Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av følgende: AHA Award 14SDG20480186 for LC, Subject innovation team of Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, og Kentucky Spinal Cord og Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES og LC.

Alle prosedyrene for dyrefag ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky, og passende forsiktighet ble tatt for å minimere stress eller smerte forbundet med kirurgi.
1. Tilberedning av injeksjonskateter og kirurgiske kroker
<ol><li>Konstruere injeksjonskateteret (figur 1). Samle nødvendige materialer, inkludert: MRE010, MRE025 og MRE050 rør, 20 G, 26 G og 27 G injeksjon nåler (Figur 2A),...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

Stamcellebehandling for nevrologiske sykdommer er fortsatt på et tidlig utforskende stadium. Et stort problem er at det ikke finnes noen etablert metode for tilstrekkelig levering av SCer eller NSCer i hjernen.
Selv om eksogene SCer/NSCer kan påvises i hjernen etter intravenøs (IV), intraperitoneal (IP) eller intraparenchymal/intracerebral injeksjon, har hver leveringstilnærming ulemper. Den påvisbare populasjonen i hjernen anslås å være svært lav med perifer injeksjon (IV eller IP), ...

Stamcellebehandling (SC) har et enormt potensial som behandling for nevrologiske sykdommer, inkludert hjerneslag, hodetraumer og demens1,,2,,3,,4,,5,6. En effektiv metode for å levere eksogene SCer til den syke hjernen er imidlertid fortsatt problematisk2,,6,7,8,9,10,11,12,13. SCer levert gjennom perifere leveringsruter, inkludert intravenøs (IV) eller intraperitoneal (IP) injeksjon, er gjenstand for førstepassfiltrering i mikrosirkulasjonen, spesielt i lunge-, lever-, milt- og muskel8,,9,,13,14,noe som øker sjansene for akkumulering av celler i ikke-målområder. Den invasive intracerebral injeksjon metoden resulterer i lokaliserte hjernevev skade og en svært begrenset fordeling av SCs nær injeksjonsstedet2,,6,8,14,15,16. Vi har nylig etablert en kateterbasert intraarteriell injeksjonsmetode for å levere eksogene nevrale SCer (NSCer), som er beskrevet her brukt i en gnagermodell av fokal iskemisk slag. Vi induserer forbigående (1 h) iskemi-reperfusjonsskade på en halvkule ved hjelp av en silikongummibelagt filament for å okkludere venstre midtre cerebral arterie (MCA) i musen eller rotte17,18,19. I denne modellen har vi reprodusert observert ca 75-85% depresjon av cerebral blodstrøm (CBF) i ipsilateral halvkule med Laser Doppler eller Laser speckle imaging17,19, noe som gir konsekvent nevrologiske underskudd17,18,19.
For tidsbesparende formål er videoen satt til å spille med dobbelt så høy hastighet og rutinemessige kirurgiske prosedyrer som hudforberedelse og sårlukking med sutur og bruk og oppsett av den motoriserte sprøytepumpen, presenteres ikke. Metoden for intraarteriell levering av NSCer er demonstrert i sammenheng med den midterste cerebrale arterieklusjonsmodellen (MCAO) av eksperimentelt slag hos gnagere. Derfor inkluderer vi den forbigående iskemiske slagprosedyren for senere å demonstrere hvordan den andre operasjonen, den intraarteriske injeksjonen, utføres ved hjelp av det forrige kirurgiske stedet på samme dyr. Muligheten for intraarteriell NSC-levering i gnagerslagmodeller demonstreres ved å vurdere fordelingen og overlevelsen av eksogene NSCer. Effekten av NSC-behandling for å dempe hjernepatologi og nevrologisk dysfunksjon vil bli rapportert separat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

Neural stamcelle (NSC) terapi er en nyskapende behandling for hjerneslag, traumatisk hjerneskade og nevrodegenerative lidelser. Sammenlignet med intrakraniell levering er intraarteriell administrering av NSCer mindre invasiv og gir en mer diffus fordeling av NSCer i hjerneparenchyma. Videre, intra-arteriell levering tillater første-pass effekt i hjernen sirkulasjon, redusere potensialet for fangst av celler i perifere organer, som lever og milt, en komplikasjon forbundet med perifere injeksjoner. Her beskriver vi metodikken, både i mus og rotter, for levering av NSCer gjennom den vanlige halspulsåren (mus) eller ekstern halspulsåren (rotte) til den ipsilaterale halvkule etter et iskemisk slag. Ved hjelp av GFP-merkede NSCer illustrerer vi den utbredte fordelingen oppnådd gjennom gnager ipsilateral halvkule ved 1 d, 1 uke og 4 uker etter postischemic levering, med en høyere tetthet i eller i nærheten av iskemisk skadested. I tillegg til langsiktig overlevelse viser vi tegn på differensiering av GFP-merkede celler ved 4 uker. Den intraarterielle leveringstilnærmingen som er beskrevet her for NSCer, kan også brukes til administrering av terapeutiske forbindelser, og har dermed bred anvendelighet til varierte CNS-skade- og sykdomsmodeller på tvers av flere arter.

GFP-merkede NSCer ble lett oppdaget i den iskemiske hjernen, for det meste i den ipsilaterale halvkule, spesielt i penumbra og langs skadekanten (figur 6). Sensoren ble single-blindet under bildebehandling og analyse.
For eksempel, ved 1 d etter injeksjon, ble NSCs oppdaget i musen hippocampus. En undergruppe av NSCer viste co-uttrykk for den umodne neuron markør DCX i dentate gyrus selv på dette tidlige tidspunktet (Figur 6A).
...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

En metode for å levere nevrale stamceller, tilpasningsdyktig for sprøyteløsninger eller suspensjoner, gjennom den vanlige halspulsåren (mus) eller ekstern halspulsåren (rotte) etter iskemisk slag er rapportert. Injiserte celler distribueres bredt gjennom hele hjernen parenchyma og kan oppdages opp til 30 d etter levering.

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Hjerneslag er den viktigste årsaken til dødelighet og funksjonshemming over hele verden. Selv om trombolyse og kirurgisk fjerning av cerebral vaskulær okklusjon kan utføres hos utvalgte pasienter, er det fortsatt et presserende behov for effektiv terapi mot hjerneslag. Her demonstrerer vi en kateterbasert, intra-arteriell levering av stamceller til den iskemiske halvkule som et potensielt regime for hjerneslagbehandling.Først introduserer vi hvordan du forbereder injeksjonskateteret og kirurgiske kroker. Vi designet to typer injeksjonskateter for intraarterial injeksjon. Design en brukes til injeksjon av en oppløsning eller suspensjon som ikke krever spyling av røret.Design to tillater injeksjon av nevrale stamceller, etterfulgt av en flush av det døde volumet for å levere hele volumet. For å bygge et sett med injeksjonkateter trenger du 26 gauge og 20 gauge nåler, en 10 til 15 centimeter lengde på MRE 25 kateter og tre centimeter lengde på MRE 50 og MRE 10 katetre. Klipp av begge nålespissene og poler metallenden på sandpapiret for å åpne røret igjen og glatte kantene og skyll deretter med destillert vann for å rense ut boringen og vaske av rusk.Figuren viser en lukket ende av en 20 gauge nål etter klipping av nålespissen, som gjenåpnes med en jevn boring etter polering. Under et mikroskop setter du den 20 gauge nålen inn i enden av MRE 50-slangen. Bøy 26 gauge nålen og deretter trenge inn i slangen under enden av 20 gauge nål spissen.Fest 26 gauge nålen med super lim. Deretter bygger du inn de to nålenavene og slangen og epoksyen for å bygge en solid blokk for å øke styrken. Du trenger også tre kirurgiske kroker for å holde vevet i posisjon for bedre eksponering av kirurgiske steder.Klipp en og en halv til to centimeter lang nål aksel fra en 27 gauge nål og polere begge ender på sandpapir til kjedelig. Bruk en liten hemostatisk klemme til å bøye akselen inn i en krok i den ene enden og en ringformet i den andre enden. Sett inn et 10 til 15 centimeter langt MRE 25-kateter gjennom ringen og fest med klart kirurgisk tape.Lag to kroker til ved hjelp av samme metode. Krokene og katetersystemet skal være gjennomvåt over natten i sytti prosent etanol for sterilisering. Alle prosedyrer som involverte dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Kentucky.Vi bruker ENT embryonale musehjerne til kultur GFP, positive nevrale stamceller. GFP positive embryoer kan lett visualiseres i FITC-kanalen på et fluorescerende mikroskop. Mens ville embryoer viser ingen fluorescens ved hjelp av samme eksponering.Autofluorescence av vill-type embryoer er bare synlig når eksponeringstiden økes 100 ganger. Embryonal cortex samles inn og brukes til å etablere nevrale stamcellekulturer etter produsentens protokoll. Disse nevrale stamcellene kan danne nevrosfærer og kan passere over 10 generasjoner, og de kan skille seg til glia er nevroner.Panel av embryonale stamcellemarkører som nanog, SSEA1, Oct4 og Sox3 kan brukes til å identifisere stamcelleegenskapene mens de er i nevrosfærer. Neurosfærer ble dyrket i media, etter produsentens protokoll og bruk mellom passasjer tre og fem for neural stamcellelevering. Iskemisk slag ble indusert på venstre halvkule for både mus og rotter, ved hjelp av en filamentbasert, midterste cerebral arterie okklusjon, MCAO med noen modifikasjoner avhengig av arten.Hos mus settes filamentet inn gjennom den vanlige halspulsåren, CCA og avanserte inn i den indre halspulsåren, ICA. Mens i rotter, filamentet er introdusert gjennom den eksterne halspulsåren, ECA i ICA på grunn av større arbeidsplass. Her demonstrerer vi museoperasjonen.Etter å ha gjort et midtlinjet snitt langs nakken, separer det underliggende vevet ved hjelp av stump disseksjon. Bruk de tre mikrokirurgiske krokene laget av 27-gauge nål aksler for å oppnå et bedre synsfelt. Den svarte firkanten indikerer operasjonsområdet for neste trinn.Muskellaget over venstre CCA er nøye åpent for å avsløre venstre CCA og vagus nerve. Følg CCA til du kommer til og identifisere bifurcation. Forsiktighet bør utvises for ikke å strekke, fortrenge eller klemme denne CCA eller vagus nerve.Åpne forsiktig det klare bindevevet, som dekker CCA og vagusnerven. Frigjør plassen under denne CCA med en spiss av tang og isolere CCA stammen så mye som mulig. Tre en dobbelt-strandet seks O flettet nylon kirurgisk sutur under CCA.Klipp midtpunktet for å la til suturer underliggende CCA. Plasser en annen nylon sutur under CCA. Bind en slipknot på den øvre suturen, og hold den løs.Skill de to nedre suturene. Bind en slip knute med midten sutur, holde den løs for nå. Bind en kirurgs knute med en lavere sutur og flytt den til den proksimale enden så langt som mulig.Trim ned suturendene. Ytterligere utsette CCA utover bifurcation. Skyv den øvre løse slipknoten til bifurcation og stram den for å forhindre tilbakestrømning av blod.Legg silisiumgummibelagt 70 nylon MCAO sutur ved siden av CCA. Bruk mikrosaks, kutt et lite snitt på CCA, ved siden av den nedre knuten. Sett spissen av MCAO-suturen inn i CCA gjennom dette snittet og gå den videre til den øvre knuten.Juster posisjonen til midtknuten og stram den til den kan holde MCAO-suturen på plass. Ikke stram knuten for mye. Slipp den øvre knuten, men lag en annen løs slip knute på samme sted.Gå MCAO-suturen inn i ICA. Bekreft at MCAO-suturen passerer bifurcation inn i ICA. Suturens vei skal være relativt rett, og går dypere inn i vevet når den utvikler seg.Kontroller sølvmarkøren på suturenden. Pass på at den når bifurcation. Kontroller retningen på MCAO-suturen igjen.Juster øvre og midtre knuter for å sikre ingen blodlekkasje. Videre fremme MCAO sutur, stram de to øvre knutene for å sikre MCAO sutur på plass. Start opptakstiden for en time med iskemi.Etter en time med iskemi bedøvelse av dyret og gjenåpner hudsåret. Utsett operasjonsområdet. Finn øvre og midterste slipknots.Slipp forsiktig den øvre knuten. Trekk forsiktig ut MCAO-suturen til den hvite silikongummidelen når midtknuten. Stram den øvre knuten for å holde MCAO-suturen på plass for å unngå blødning.Slipp forsiktig den midterste slipknoten. Trekk ut MCAO-suturen til slutten passerer den øvre knuten. Stram den øvre knuten.Plasser den midterste slipknot rett over snittet på CCA. Stram midtre slipknot. Fjern den øvre knuten.Trim sutur ender av den midterste knuten. Lukk hudsåret og la dyret komme seg. Basert på vår erfaring, nevrale stamceller trygt injisert gjennom denne arterielle ruten mellom en og tre dager etter hjerneslag.Igjen er det mindre variasjoner mellom mus og rotte operasjoner for neural stamcelle injeksjon. Og her demonstrerer vi museoperasjonen. På dag tre etter slag, bedøve dyret, gjenåpne såret og re-utsette CCA.Legg en dobbelttrådet kirurgisk sutur under CCA og kutt den på midtpunktet for å få to suturer. Plasser de to suturene riktig. Lag en slipknot med den øvre suturen.Plasser den rett under bifurcation. Stram den øvre slipknoten. Lag en annen slipknot med midten sutur.Skjær et lite snitt rett over den trimmede knuten som er igjen fra slagoperasjonen. Trim spissen av MRE 10 kateteret med en vinkel på ca. 45 grader. Bruk denne skarpe enden til å angi snittet på CCA.Vær forsiktig så du justerer inngangsvinkelen og kraften som brukes til å sette inn kateteret. Ellers kan det hende at kateteret ikke kommer inn i CCA eller kan punktere det. Sett inn kateteret og gå videre til spissen når den øvre knuten.Stram den midterste slipknoten for å holde kateteret på plass og sikre ingen blodkobling. Slipp den øvre knuten. Lag en slip knute med den øvre suturen.Juster vinkelen på kateteret i CCA og posisjonene til begge knutene til en rask tilbakestrømning av blod er synlig, noe som indikerer vellykket kommunikasjon mellom kateteret og CCA-strømmen. Start sprøytepumpen. Blodet i kateteret vil bli spylt tilbake i CCA.Avslutt injeksjonen etter fem minutter. Ligate den øvre knuten. Slipp den midterste knuten og trekk ut kateteret.Ligate midtknuten. Trim alle knuter. Lukk såret og la dyret komme seg.Etter intra-arteriell injeksjon finnes GFP-merkede nevrale stamceller for det meste på den ipsilaterale halvkule. Her viser vi fordelingen i hippocampal dentate gyrus på en dag etter injeksjon. På den ipsilaterale halvkule lokaliserte noen av GFP-positive nevrale stamceller i cortex og striatum, dobbel kort, en markør for umodne nevroner.Dette er representative bilder fra sham og hjerneslag dyr med eller uten neural stamcelle injeksjon på syv dager etter injeksjon. Ved 30 dager etter levering kan bare mindre autofluorescen oppdages gjennom FITC-kanalen hos dyrene som mottar kjøretøyinjeksjon. Mens i stamceller injisert dyr, GFP merket nevrale stamceller kan bli funnet i den skadede hjernen med uttrykk for ulike celle markører som gleo markør GFP eller neuronal markør tujuan.De hvite pilene i hvert bilde indikerer henholdsvis nevrale stamceller som uttrykker GFP- eller tujuanmarkører. Til slutt er intra-arteriell injeksjon en mulig metode for levering av nevrale stamceller for hjerneslagbehandling. Nevrale stamceller kan overleve og differensiere til forskjellige celletyper i den skadede hjernen.Og til slutt kan den intraarteriale injeksjonsmetoden som introduseres her, også brukes til levering av løsninger og suspensjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning av Microregional Hypoksi i Mus Cerebral Cortex av to-foton Imaging av endogen NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Økende nevrale stamceller fra konvensjonelle og ikke-konvensjonelle Regions of Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdere Cell Cycle Progresjon av Neural Stem og stamceller i mus utvikling av hjernen etter Gentoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utvikling av en raffinert protokoll for Trans-Innbukking Subretinal transplantasjon av menneskelig netthinnens Pigment epitelceller i rotte øyne

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Samtidig Evaluering av Cerebral hemodynamikken og lysspredning egenskaper av<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Brain Bruke multispektrale Diffus refleksjon Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...