Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo seguinte: Prêmio AHA 14SDG20480186 para LC, equipe de inovação de assuntos da Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 para BZ, e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust bolsa 14-12A para KES e LC.

Todos os procedimentos sobre os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky, e foram tomados cuidados adequados para minimizar o estresse ou a dor associados à cirurgia.
1. Preparação de cateter de injeção e ganchos cirúrgicos
<ol><li>Construa o cateter de injeção(Figura 1). Reúna os materiais necessários, incluindo: MRE010, MRE025 e tubos MRE050, agulhas de injeção de 20 G, 26 G...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

A terapia com células-tronco para doenças neurológicas ainda está em estágio exploratório precoce. Uma questão importante é que não há um método estabelecido para a entrega suficiente de SCs ou NSCs no cérebro.
Embora SCs/NSCs exógenos possam ser detectados no cérebro após injeção intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) ou intraparenquimal/intracerebral, cada abordagem de entrega tem desvantagens. Estima-se que a população detectável dentro do cérebro seja muito baixa com i...

A terapia com células-tronco (SC) tem um enorme potencial como tratamento para doenças neurológicas, incluindo acidente vascular cerebral, traumatismo craniano e demência1,,2,3,4,,5,6. No entanto, um método eficiente para fornecer SCs exógenos ao cérebro doente permanece problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. As SCs entregues através de rotas de entrega periféricas, incluindo injeção intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP), estão sujeitas à filtragem de primeira passagem na microcirculação, especialmente no pulmão, fígado, baço e músculo8,,9,,13,,14, aumentando as chances de acúmulo de células em áreas não-alvo. O método de injeção intracerebral invasivo resulta em danos localizados no tecido cerebral e uma distribuição muito restrita de SCs perto do local da injeção2,6,,8,,14,15,,16. Recentemente estabelecemos um método de injeção intra-arterial à base de cateter para fornecer SCs neurais exógenos (NSCs), que é descrito aqui aplicado em um modelo de roedor de derrame isquêmico focal. Induzimos lesão transitória (1 h) isquemia-reperfusão em um hemisfério usando um filamento revestido de borracha de silicone para ocluir a artéria cerebral média esquerda (MCA) no camundongo ou rato17,,18,,19. Neste modelo, observamos de forma reprodutiva aproximadamente 75-85% a depressão do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral com Laser Doppler ou Laser speckle imaging17,19, gerando déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para fins de economia de tempo, o vídeo é definido para jogar em duas vezes a velocidade normal e procedimentos cirúrgicos de rotina, como preparação da pele e fechamento de feridas com sutura e o uso e configuração da bomba de seringa motorizada não são apresentados. O método de entrega intra-arterial de NSCs é demonstrado no contexto do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de derrame experimental em roedores. Por isso, incluímos o procedimento de derrame isquêmico transitório, a fim de demonstrar posteriormente como a segunda cirurgia, a injeção intra-arterial, é realizada utilizando o local cirúrgico anterior no mesmo animal. A viabilidade da entrega intra-arterial de NSC em modelos de curso de roedores é demonstrada pela avaliação da distribuição e sobrevivência de NSCs exógenos. A eficácia da terapia NSC para atenuar a patologia cerebral e disfunção neurológica será relatada separadamente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

A terapia com células-tronco neurais (NSC) é um tratamento inovador emergente para derrame, lesão cerebral traumática e distúrbios neurodegenerativos. Em comparação com a entrega intracraniana, a administração intra-arterial de NSCs é menos invasiva e produz uma distribuição mais difusa de NSCs dentro do parênquim cerebral. Além disso, a entrega intra-arterial permite o efeito de primeira passagem na circulação cerebral, diminuindo o potencial de captura de células em órgãos periféricos, como fígado e baço, uma complicação associada a injeções periféricas. Aqui, detalhamos a metodologia, tanto em camundongos quanto em ratos, para a entrega de NSCs através da artéria carótida comum (rato) ou artéria carótida externa (rato) para o hemisfério ipsilateral após um derrame isquêmico. Usando NSCs rotulados por GFP, ilustramos a distribuição generalizada alcançada em todo o hemisfério ipsilateral de roedores em 1 d, 1 semana e 4 semanas após a entrega pós-isquêmica, com maior densidade dentro ou perto do local de lesão isquêmica. Além da sobrevivência a longo prazo, mostramos evidências de diferenciação de células rotuladas por GFP em 4 semanas. A abordagem de entrega intra-arterial descrita aqui para NSCs também pode ser usada para administração de compostos terapêuticos, e, portanto, tem ampla aplicabilidade a variados modelos de lesões e doenças de CNS em várias espécies.

Os NSCs rotulados por GFP foram prontamente detectados no cérebro isquêmico, principalmente no hemisfério ipsilateral, especialmente na penumbra e ao longo da borda da lesão(Figura 6). O examinador ficou cego durante a imagem e análise.
Por exemplo, a 1 d após a injeção, os NSCs foram detectados dentro do hipocampo do rato. Um subconjunto de NSCs mostrou co-expressão do marcador de neurônio imaturo DCX no giro dentado mesmo neste momento inicial<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

O AVC é a principal causa de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Embora a trommólise e a remoção cirúrgica da oclusão vascular cerebral possam ser realizadas em pacientes selecionados, ainda há uma necessidade urgente de terapias eficazes contra o AVC. Aqui, demonstramos uma entrega intra-arterial baseada em cateteres de células-tronco para o hemisfério isquêmico como um regime potencial para a terapia de derrame.Primeiro, introduzimos como preparar o cateter de injeção e ganchos cirúrgicos. Projetamos dois tipos de cateteres de injeção para injeção intra-arterial. O design um é usado para injeção de uma solução ou suspensão que não exija descarga do tubo.O design dois permite a injeção de células-tronco neurais, seguido por uma descarga do volume morto para entregar o volume total. Para construir um conjunto de cateteres de injeção, você precisará de 26 agulhas de calibre e 20, um comprimento de 10 a 15 centímetros de cateter MRE 25 e três centímetros de comprimento de cateter MRE 50 e MRE 10. Corte as duas pontas da agulha e polir a extremidade metálica na lixa para reabrir o tubo e suavizar as bordas e, em seguida, lavar com água destilada para limpar o furo e lavar os detritos.A figura mostra uma extremidade fechada de uma agulha calibre 20 depois de cortar a ponta da agulha, que é reaberta com um furo liso após o polimento. Sob um microscópio, insira a agulha de calibre 20 na extremidade da tubulação MRE 50. Dobre a agulha de calibre 26 e, em seguida, penetre o tubo abaixo do final da ponta da agulha de calibre 20.Fixar a agulha de calibre 26 com super cola. Em seguida, incorpore os dois cubos de agulha e o tubo e epóxi para construir um bloco sólido para aumentar a força. Você também precisará de três ganchos cirúrgicos para manter o tecido em posição para melhor exposição dos locais cirúrgicos.Corte um eixo de agulha de um centímetro e meio a dois centímetros de comprimento de uma agulha calibre 27 e polir ambas as extremidades em lixa até ficar maçante. Use um pequeno grampo hemostático para dobrar o eixo em um gancho em uma extremidade e um anel em forma de anel na outra extremidade. Insira um cateter MRE 25 de 10 a 15 centímetros de comprimento através do anel e fixe com fita cirúrgica clara.Faça mais dois ganchos usando o mesmo método. Os ganchos e o sistema de cateter devem ser encharcados durante a noite em 70% de etanol para esterilização. Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Kentucky.Usamos o cérebro de camundongo embrionário ent para cultivar GFP, células-tronco neurais positivas. Os embriões positivos GFP podem ser facilmente visualizados no canal FITC em um microscópio fluorescente. Enquanto embriões do tipo selvagem não mostram fluorescência usando a mesma exposição.A autofluorescência de embriões do tipo selvagem só é visível quando o tempo de exposição é aumentado 100 vezes. O córtex embrionário é coletado e usado para estabelecer culturas de células-tronco neurais seguindo o protocolo do fabricante. Essas células-tronco neurais podem formar neurosferas e podem ser passagem ao longo de 10 gerações e podem se diferenciar em glia são neurônios.Painel de marcadores de células-tronco embrionárias como nanog, SSEA1, Oct4 e Sox3 pode ser usado para identificar as propriedades das células-tronco enquanto estão nas neurosferas. As neurosferas foram cultivadas na mídia, seguindo o protocolo do fabricante e o uso entre as passagens três e cinco para a entrega de células-tronco neurais. O derrame isquêmico foi induzido no hemisfério esquerdo para camundongos e ratos, usando um filamento à base de oclusão da artéria cerebral média, MCAO com algumas modificações dependendo da espécie.Em camundongos, o filamento é inserido através da artéria carótida comum, CCA e avançado na artéria carótida interna, ICA. Enquanto em ratos, o filamento é introduzido através da artéria carótida externa, ECA no ICA por causa do maior espaço de trabalho. Aqui demonstramos a cirurgia do rato.Depois de fazer uma incisão midline ao longo do pescoço, separe os tecidos subjacentes usando dissecção contundente. Use os três ganchos microcirúrgicos feitos de eixos de agulha de calibre 27 para obter um campo visual melhor. O quadrado preto indica a área cirúrgica para o próximo passo.A camada muscular acima da CCA esquerda está cuidadosamente aberta para expor a CCA esquerda e o nervo vago. Siga a CCA até chegar e identificar a bifurcação. Deve-se ter cuidado para não esticar, deslocar ou espremer este nervo CCA ou vagus.Abra cuidadosamente o tecido conjuntivo claro, cobrindo o nervo CCA e vagus. Liberte o espaço por baixo desta CCA com uma ponta dos fórceps e isole a haste CCA o máximo possível. Enfie uma sutura cirúrgica de nylon trançada de seis fios duplos sob a CCA.Corte o ponto do meio para deixar para suturas subjacentes à CCA. Coloque outra sutura de nylon sob a CCA. Amarre um slipknot na sutura superior, mantendo-o solto.Separe as duas suturas inferiores. Amarre um nó de deslizamento com a sutura do meio, mantendo-o solto por enquanto. Amarre o nó de um cirurgião com uma sutura inferior e mova-o para a extremidade proximal o mais longe possível.Apare as pontas da sutura. Expor ainda mais a CCA além da bifurcação. Empurre o deslizamento solto superior para a bifurcação e aperte-o para evitar o fluxo de sangue.Coloque a borracha de silício revestida de 70 mcao de nylon ao lado da CCA. Usando micro tesoura, corte uma pequena incisão na CCA, ao lado do nó inferior. Insira a ponta da sutura de MCAO na CCA através desta incisão e avance-a até o nó superior.Ajuste a posição do nó médio e aperte-o até que possa manter a sutura de MCAO na posição. Não aperte excessivamente o nó. Solte o nó superior, mas faça outro nó de deslizamento solto no mesmo local.Avance a sutura de MCAO para o ICA. Confirme se a sutura de MCAO passa a bifurcação para o ICA. O caminho da sutura deve ser relativamente reto, entrando mais fundo no tecido à medida que avança.Verifique o marcador de prata na extremidade da sutura. Certifique-se de que ele atinge a bifurcação. Verifique novamente a direção da sutura MCAO.Ajuste nós superiores e médios para garantir que não haja vazamento de sangue. Avance ainda mais a sutura de MCAO, aperte os dois nós superiores para fixar a sutura de MCAO no lugar. Comece a gravar o tempo para uma hora de isquemia.Depois de uma hora de isquemia, anestesiamos o animal e reabrimos a ferida da pele. Exponha a área cirúrgica. Localize os deslizamentos superiores e médios.Solte suavemente o nó superior. Puxe suavemente a sutura de MCAO até que a parte de borracha de silicone branca atinja o nó médio. Aperte o nó superior para segurar a sutura de MCAO no lugar para evitar sangramento.Solte suavemente o slipknot do meio. Retire a sutura de MCAO até que sua extremidade passe o nó superior. Aperte o nó superior.Coloque o slipknot médio logo acima da incisão na CCA. Aperte o slipknot do meio. Remova o nó superior.Apare as extremidades da sutura do nó médio. Feche a ferida da pele e deixe o animal se recuperar. Com base em nossa experiência, células-tronco neurais injetaram com segurança através desta rota arterial entre um e três dias após o derrame.Novamente, há pequenas variações entre cirurgias de camundongos e ratos para injeção neural de células-tronco. E aqui demonstramos a cirurgia do rato. No terceiro dia pós-derrame, anestesiar o animal, reabrir a ferida e re-expor a CCA.Coloque uma sutura cirúrgica de dois fios sob a CCA e corte-a no ponto médio para obter duas suturas. Coloque as duas suturas corretamente. Faça um slipknot com a sutura superior.Coloque-o logo abaixo da bifurcação. Aperte o slipknot superior. Faça outro slipknot com a sutura do meio.Corte uma pequena incisão bem acima do nó aparado restante da cirurgia de derrame. Corte a ponta do cateter MRE 10 com um ângulo de aproximadamente 45 graus. Use esta extremidade afiada para entrar na incisão na CCA.Tenha cuidado para ajustar corretamente o ângulo de entrada e a força usada para inserir o cateter. Caso contrário, o cateter não pode entrar na CCA ou pode perfurá-lo. Insira o cateter e avance até que a ponta atinja o nó superior.Aperte o slipknot médio para manter o cateter no lugar e certifique-se de que não há ligação sanguínea. Solte o nó superior. Faça um nó de deslizamento com a sutura superior.Ajuste o ângulo do cateter dentro da CCA e as posições de ambos os nós até que um rápido fluxo de sangue seja visível, indicando uma comunicação bem sucedida entre o cateter e o fluxo CCA. Ligue a bomba de seringa. O sangue no cateter será devolvido ao CCA.Termine a injeção depois de cinco minutos. Ligate o nó superior. Solte o nó do meio e retire o cateter.Ligate o nó do meio. Aparar todos os nós. Feche a ferida e deixe o animal se recuperar.Após a injeção intra-arterial, as células-tronco neurais rotuladas por GFP são encontradas principalmente no hemisfério ipsilateral. Aqui, mostramos a distribuição no giro dento hipocampal dento em um dia após a injeção. No hemisfério ipsilateral, algumas das células-tronco neurais positivas do GFP localizadas no córtex e estriato, expressam cort duplo, um marcador de neurônios imaturos.Estas são imagens representativas de animais falsos e de derrame com ou sem injeção neural de células-tronco aos sete dias após a injeção. Aos 30 dias após o parto, apenas a fluorescência automática menor pode ser detectada através do canal FITC nos animais que recebem injeção do veículo. Enquanto em células-tronco injetavam animais, células-tronco neurais rotuladas gfp podem ser encontradas no cérebro ferido com expressão de vários marcadores celulares como o marcador gleo GFP ou o marcador neuronal tujuan.As setas brancas em cada imagem indicam células-tronco neurais expressando marcadores GFP ou tujuan, respectivamente. Em conclusão, a injeção intra-arterial é um método viável para a entrega de células-tronco neurais para terapia de derrame. Células-tronco neurais podem sobreviver e se diferenciar em diferentes tipos de células dentro do cérebro ferido.E, finalmente, o método de injeção intra-arterial introduzido aqui também pode ser usado para a entrega de soluções e suspensões.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Neurociência

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Avaliação da progressão do ciclo celular de células-tronco neurais e células progenitoras no cérebro de camundongos em desenvolvimento após estresse genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do<em&gt; In Vivo</em&gt; Cérebro de Rato Utilizando Imagem de Reflexão Difusa Multispectral

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...