Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Denna forskning stöddes av följande: AHA Award 14SDG20480186 för LC, Ämnesinnovation team av Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 för BZ, och Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A för KES och LC.

Alla förfaranden på djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky, och lämplig försiktighet vidtogs för att minimera stress eller smärta i samband med kirurgi.
1. Beredning av injektionskatetrar och kirurgiska krokar
<ol><li>Konstruera injektionskatetern (bild 1). Samla in nödvändiga material, inklusive: MRE010, MRE025 och MRE050 slangar, 20 G, 26 G och 27 G injektionsnålar (<strong class="xfig...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

Stamcellsterapi för neurologiska sjukdomar är fortfarande i ett tidigt utforskande skede. En viktig fråga är att det inte finns någon etablerad metod för tillräcklig leverans av SCs eller NSCs i hjärnan.
Även om exogena SCs/NSCs kan detekteras i hjärnan efter intravenös (IV), intraperitoneal (IP) eller intraparenchymal/intracerebral injektion, har varje leverans tillvägagångssätt nackdelar. Den detekterbara populationen i hjärnan uppskattas vara mycket låg med perifer injektion...

Stamcellsterapi (SC) har en enorm potential som behandling för neurologiska sjukdomar, inklusive stroke, skallskada och demens1,,2,3,,4,5,6. En effektiv metod för att leverera exogenacs till den sjuka hjärnan är dock fortfarande problematisk2,,6,7,8,9,10,,11,12,13. SCs levereras genom perifera leveransvägar, inklusive intravenös (IV) eller intraperitoneal (IP) injektion, är föremål för första passage filtrering i mikrocirkulationen, särskilt i lungan, lever, mjälte och muskel8,9,13,14, ökar chanserna för ansamling av celler i icke-målområden. Den invasiva intrakningsmetoden resulterar i lokaliserad hjärnvävnadsskada och en mycket begränsad fördelning av SCs nära injektionsstället2,,6,,8,,14,,15,16. Vi har nyligen etablerat en kateter-baserade intra-arteriell injektion metod för att leverera exogena neurala SCs (NSCs), som beskrivs här tillämpas i en gnagare modell av focal ischemisk stroke. Vi inducerar transient (1 h) ischemi-reperfusion skada på ett halvklot med hjälp av en silikon gummibelagd glödtråd att ockludera den vänstra mellersta cerebralartär (MCA) i musen eller råtta17,18,19. I denna modell har vi reproducerbart observerat cirka 75-85% depression av cerebralt blodflöde (CBF) i ensidig halvklot med Laser Doppler eller Laser speckle imaging17,19, vilket ger konsekvent neurologiska underskott17,18,19.
För tidsbesparande ändamål är videon inställd på att spela dubbelt så snabbt och rutinmässiga kirurgiska ingrepp såsom hudberedning och sårstängning med sutur och användning och inställning av den motoriserade sprutpumpen presenteras inte. Metoden för intraarteriell leverans av NSCs visas i samband med den mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO) modell av experimentell stroke hos gnagare. Därför inkluderar vi den övergående ischemisk stroke förfarande för att senare visa hur den andra operationen, den intraarteriella injektionen, utförs med hjälp av tidigare kirurgiska webbplats på samma djur. Möjligheten att intraarteriell NSC leverans i gnagare stroke modeller visas genom att bedöma fördelningen och överlevnaden av exogena NSCs. Effekten av NSC terapi för att dämpa hjärnan patologi och neurologisk dysfunktion kommer att rapporteras separat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

Neuralstamcellsterapi (NSC) terapi är en framväxande innovativ behandling för stroke, traumatisk hjärnskada och neurodegenerativa sjukdomar. Jämfört med intrakraniell leverans, intraarteriell administrering av NSCs är mindre invasiv och producerar en mer diffus fördelning av NSCs i hjärnan parenkym. Ytterligare, intra-arteriell leverans tillåter första passagen effekt i hjärnan cirkulationen, minska risken för fångst av celler i perifera organ, såsom lever och mjälte, en komplikation i samband med perifera injektioner. Här beskriver vi metoden, hos både möss och råttor, för leverans av NSCs genom den gemensamma halspulsådern (mus) eller yttre halspulsådern (råtta) till den ensidiga halvklotet efter en ischemisk stroke. Med hjälp av GFP-märkta NSCs, illustrerar vi den utbredda fördelningen uppnås i hela gnagare ipsilateral halvklotet på 1 d, 1 vecka och 4 veckor efter postischemic leverans, med en högre densitet i eller nära ischemisk skada webbplats. Förutom långsiktig överlevnad visar vi tecken på differentiering av GFP-märkta celler vid 4 veckor. Den intraarteriösa leveransmetod som beskrivs här för NSC kan också användas för administrering av terapeutiska föreningar, och har därmed bred tillämplighet på olika CNS skada och modeller sjukdom över flera arter.

GFP-märkta NSC upptäcktes lätt i den ischemiska hjärnan, mestadels i den ensidiga halvklotet, särskilt i penumbra och längs skada fälgen (Figur 6). Examinator var single-blinded under bildframställning och analys.
Till exempel, vid 1 d efter injektion, NSCs upptäcktes inom musen hippocampus. En delmängd av NSCs visade co-uttryck för omogna neuron markör DCX i dentate gyrus även vid denna tidiga tidpunkt (Figur 6A).
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

En metod för att leverera neurala stamceller, anpassningsbar för injicering av lösningar eller suspensioner, genom den gemensamma halspulsådern (mus) eller yttre halspulsådern (råtta) efter ischemisk stroke rapporteras. Injicerade celler distribueras i stort sett i hjärnan parenkym och kan upptäckas upp till 30 d efter leverans.

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Stroke är den främsta orsaken till dödlighet och funktionshinder över hela världen. Även om trombolys och kirurgiskt avlägsnande av cerebrala Vaskulär ocklusion kan utföras i utvalda patienter, finns det fortfarande ett akut behov av effektiva terapier mot stroke. Här visar vi en kateter-baserade, intra-kranskärlens leverans av stamceller till den skandinaviska halvklotet som en potentiell regim för stroke terapi.Först introducerar vi hur man förbereder injektionskatetern och operationskrokarna. Vi utformade två typer av injektion katetrar för intra-arteriell injektion. Design ett används för injektion av en lösning eller fjädring som inte kräver spolning av röret.Design två möjliggör injektion av neurala stamceller, följt av en spolning av dödvolymen för att leverera hela volymen. För att bygga en uppsättning injektionkatetrar behöver du 26 gauge och 20 gauge nålar, en 10 till 15 centimeter längd MRE 25 kateter och tre centimeter längd MRE 50 och MRE 10 katetrar. Klipp av både nålspetsar och polera metalländen på sandpapper för att öppna röret igen och jämna ut kanterna och spola sedan med destillerat vatten för att rensa ut borren och tvätta bort skräp.Figuren visar en sluten ände av en 20 gauge nål efter klippning av nålspetsen, som öppnas igen med en slät bar efter polering. Under ett mikroskop, sätt in 20 gauge nålen i slutet av MRE 50 slangar. Böj 26 gauge nålen och sedan tränga in i slangen under slutet av 20 gauge nål spets.Säkra 26 gauge nålen med super lim. Sedan bädda in de två nålnav och slangar och epoxi för att bygga ett fast block för att öka styrkan. Du kommer också att behöva tre kirurgiska krokar för att hålla vävnaden i position för bättre exponering av de kirurgiska platserna.Skär en en och en halv till två centimeter lång nål skaft från en 27 gauge nål och polera båda ändarna på sandpapper tills tråkig. Använd en liten hemostatisk klämma för att böja axeln i en krok i ena änden och en ringformad i den andra änden. Sätt in en 10 till 15 centimeter lång MRE 25 kateter genom ringen och säkra med tydlig kirurgisk tejp.Gör ytterligare två krokar med samma metod. Krokarna och katetersystemet ska blötläggas över natten i sjuttioprocents etanol för sterilisering. Alla förfaranden som rör djurämnen godkändes av Kommittén för vård och användning av 1991 vid University of Kentucky.Vi använder ENT embryonala mus hjärnan till kultur GFP, positiva neurala stamceller. GFP positiva embryon kan lätt visualiseras i FITC-kanalen på ett fluorescerande mikroskop. Medan vilda embryon visar ingen fluorescens med samma exponering.Autofluorescensen av embryon av vildtyp syns endast när exponeringstiden ökas 100 gånger. Embryonala cortex samlas in och används för att upprätta neurala stamcellskulturer efter tillverkarens protokoll. Dessa neurala stamceller kan bilda neurosfärer och kan vara passage över 10 generationer och de kan differentiera till glia är nervceller.Panel av embryonala stamceller markörer som nanog, SSEA1, Oct4 och Sox3 kan användas för att identifiera stamceller egenskaper medan neurosfärer. Neurospheres var odlade i media, efter tillverkarens protokoll och användning mellan passager tre och fem för neurala stamceller leverans. Skandinaviska stroke var inducerad i den vänstra hemisfären för både möss och råttor, med hjälp av en glödtråd baserad, mellersta cerebral gatan ocklusion, MCAO med vissa ändringar beroende på art.Hos möss sätts glödtråden in genom den gemensamma halspulsådern, CCA och avancerade in i den inre halspulsådern, ICA. Även i råttor, glödtråden införs genom den externa halspulsådern, ECA i ICA på grund av den större arbetsutrymme. Här demonstrerar vi musoperationen.Efter att ha gjort en mittlinjen snitt längs halsen, separera de underliggande vävnaderna med hjälp av trubbig dissektion. Använd de tre mikrokirurgiska krokarna tillverkade av nålskaft med 27 gauge för att uppnå ett bättre synfält. Den svarta fyrkanten indikerar operationsområdet för nästa steg.Muskellagret ovanför den vänstra CCA är noggrant öppen för att exponera vänster CCA och vagus nerv. Följ CCA tills du når och identifiera bifurkation. Försiktighet bör iakttas att inte sträcka, tränga undan eller pressa denna CCA eller vagus nerv.Öppna försiktigt den klara bindväven, som täcker CCA och vagusnerven. Frigör utrymmet under denna CCA med en spets av tåtaningar och isolera CCA stammen så mycket som möjligt. Trä en dubbel-strandade sex O flätad nylon kirurgiska sutur under CCA.Klipp mitten punkten att lämna till suturer som ligger till grund för CCA. Placera en annan nylon sutur under CCA. Bind en slipknot på den övre suturen, håll den lös.Separera de två nedre suturerna. Knyt en slip knut med mitten sutur, hålla den lös för nu. Bind en kirurgsknop med en lägre sutur och flytta den till den proximala änden så långt det går.Trimma ner suturändarna. Ytterligare exponera CCA bortom bifurkation. Tryck den övre lösa slipknot till bifurkation och dra åt den för att förhindra tillbakaflöde av blod.Lägg kiselgummibelagd 70 nylon MCAO sutur bredvid CCA. Med hjälp av mikrosax, skär ett litet snitt på CCA, bredvid den nedre knuten. Sätt in spetsen på MCAO suturen i CCA genom detta snitt och för den vidare till den övre knuten.Justera läget för den mellersta knuten och dra åt den tills den kan hålla MCAO suturen i läge. Dra inte åt knuten alltför mycket. Släpp den övre knuten, men gör en annan lös slip knut på samma plats.För fram MCAO-suturen till ICA. Bekräfta MCAO sutur passerar bifurkation i ICA. Suturens väg bör vara relativt rak, in djupare in i vävnaden när den avancerar.Kontrollera silvermarkören på suturänden. Se till att den når bifurkationen. Kontrollera riktningen på MCAO-suturen igen.Justera övre och mellersta knutar för att säkerställa att inget blodläckage. Avancera ytterligare MCAO suturen, dra åt de två övre knutarna för att säkra MCAO suturen på plats. Starta inspelningstid för en timmes ischemi.Efter en timmes ischemi söver vi djuret och öppnar hudsåret igen. Avslöja operationsområdet. Lokalisera övre och mellersta slipknots.Släpp försiktigt den övre knuten. Dra försiktigt ut MCAO-suturen tills den vita silikongummidelen når den mellersta knuten. Dra åt den övre knuten för att hålla MCAO suturen på plats för att undvika blödning.Släpp försiktigt mitten slipknot. Dra ut MCAO suturen till dess passerar övre knut. Dra åt den övre knuten.Placera mitten slipknot höger ovanför snittet på CCA. Dra åt mitten slipknot. Ta bort den övre knuten.Trim sutur ändar av mitten knuten. Stäng hudsåret och låt djuret återhämta sig. Baserat på vår erfarenhet, neurala stamceller injiceras säkert genom denna arteriella vägen mellan en och tre dagar efter stroke.Återigen, Det finns mindre variationer mellan mus och råtta operationer för neural stamcellsinjektion. Och här demonstrerar vi musoperationen. Dag tre post-stroke, bedöva djuret, öppna såret igen och åter exponera CCA.Lägg en dubbelsträngad kirurgisk sutur under CCA och skär den vid mittpunkten för att få två suturer. Placera de två suturerna ordentligt. Gör en slipknot med den övre suturen.Placera den precis under bifurkationen. Dra åt den övre slipknot. Gör en annan slipknot med den mellersta suturen.Skär ett litet snitt precis ovanför den trimmade knuten som finns kvar från strokeoperationen. Trimma spetsen på MRE 10-katetern med en vinkel på cirka 45 grader. Använd denna skarpa änden för att komma in snittet på CCA.Var försiktig så att du justerar ingångsvinkeln ordentligt och den kraft som används för att föra in katetern. I annat fall kan katetern inte komma in i CCA eller kan punktera den. Sätt in katetern och för fram tills spetsen når den övre knuten.Dra åt mitten slipknot att hålla katetern på plats och säkerställa ingen blodlänkning. Släpp den övre knuten. Gör en glidknut med den övre suturen.Justera vinkeln på katetern inom CCA och positionerna för båda knutarna tills ett snabbt bakåtflöde av blod är synligt, vilket indikerar lyckad kommunikation mellan katetern och CCA-flödet. Starta sprutpumpen. Blodet i katetern kommer att spolas tillbaka in i CCA.Avsluta injektionen efter fem minuter. Ligate den övre knuten. Släpp mittenknuten och dra tillbaka katetern.Ligate mitten knuten. Trimma alla knop. Stäng såret och låt djuret återhämta sig.Efter intra-arteriell injektion, GFP märkt neurala stamceller finns mestadels i ipsilateral halvklotet. Här visar vi fördelningen i hippocampus dentate gyrus på en dag efter injektion. I den ipsilateral halvklotet, några av de GFP positiva neurala stamceller lokaliserade i cortex och striatum, express dubbel cort, en markör för omogna nervceller.Dessa är representativa bilder från sken- och strokedjur med eller utan neural stamcellsinjektion vid sju dagar efter injektion. Vid 30 dagar efter leverans kan endast mindre auto fluorescens detekteras genom FITC-kanal i de djur som får fordonsinsprutning. Även i stamceller injiceras djur, GFP märkt neurala stamceller kan hittas i den skadade hjärnan med uttryck för olika cell markörer som gleo markör GFP eller neuronal markör tujuan.De vita pilarna i varje bild anger neurala stamceller som uttrycker GFP eller tujuan markörer respektive. Sammanfattningsvis är intra-arteriell injektion en genomförbar metod för leverans av neurala stamceller för stroke terapi. Neurala stamceller kan överleva och differentiera till olika celltyper inom den skadade hjärnan.Och slutligen, intra-arteriell injektion metod som införs här kan också användas för leverans av lösningar och suspensioner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Fokal cerebral ischemi modellen genom endovaskulär suture Ocklusion av Mellanöstern Cerebral artär i Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Leverans till Postnatal råtthjärna av icke-ventrikulär Plasmid Injection och elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detektion av Microregional hypoxi i mus Cerebral Cortex med två-foton Imaging av endogen NADH fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Växande neurala stamceller från konventionella och icke-konventionella Regioner av vuxen Gnagare Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utveckling av ett raffinerat protokoll för Trans-skleral Subretinal Transplantation av mänskliga Retinal Pigment epitelceller i råtta ögon

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Samtidig utvärdering av cerebral Hemodynamik och ljusspridande egenskaper hos<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Brain Använda Multispektrala diffus reflektans Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...