Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Forfatterne anerkender Charles River laboratorier for deres fremragende teknisk støtte udfører histopatologi analyser. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en protokol (nummer 2083-16 og 2083-19) gennemgået og godkendt af Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Princeton University. Dette arbejde blev udført ved nøje at følge biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) krav, som vi har et fuldt udstyret laboratorium godkendt af Princeton University biosikkerhed udvalg. De procedurer, herunder mus footpad slid, viral inokulering, mus dissektion, og væv indsamling blev udført i en biologisk sikkerhed kabinet (BSC) i P...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia.">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aujeszky's+disease+(pseudorabies)+in+pigs.">Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs.</a> Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).</li><li>Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue:+Application+in+the+APP/PS1+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing.">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).</li><li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models.">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li><li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1.">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li><li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons.">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).</li><li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li><li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Den footpad vaccination model beskrevet her er nyttigt at undersøge indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion. Desuden er denne in vivo model bruges til at etablere kinetik af replikation og spredning af alphaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er en alternativ til andre vaccinationsmodeller, såsom flanke hud podning model, som bygger på dyb dermal ridser13, eller intrakraniel rute, som direkte indfører virus i CNS14<...

Denne undersøgelse beskriver en footpad vaccination model til at undersøge replikation og spredning af virus fra PNS til CNS og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Fodplade-inokuleringsmodellen er blevet intensivt anvendt til at undersøge alfaherpesvirusinfektion i neuroner1,,2,3. Hovedformålet med denne model er at tillade neurotropiske vira til at rejse en maksimal afstand gennem PNS før de når CNS. Her, denne model bruges til at opnå nye indsigter i udviklingen af en bestemt neuropati (neuropatisk kløe) i mus inficeret med pseudorabies virus (PRV).
PRV er en alfaherpesvirus relateret til flere velkendte patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsager forkølelsessår, genitale læsioner og skoldkopper, henholdsvis4. Disse vira er alle pantropic og i stand til at inficere mange forskellige celletyper uden at vise affinitet for en bestemt vævstype. Men de udviser alle en karakteristisk neurotropisme ved at invadere PNS (og lejlighedsvis CNS) af værtsarter. Den naturlige vært er grisen, men PRV kan inficere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige værter, PRV inficerer PNS og inducerer en alvorlig kløe kaldet "gal kløe", efterfulgt af perakuute død5,6. Den neuroimmune responss rolle i det kliniske resultat og patogenesensens rolle er blevet dårligt forstået.
Den footpad vaccination model giver PRV at indlede infektion i epidermale celler i footpad. Derefter, infektionen breder sig til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes ved viruspartikler bevæger sig via iskiasnerven til DRG inden for ca 60 h. Infektionen spredes gennem rygmarven, i sidste ende nå hindhjernen, når dyrene bliver døende (82 h post-infektion). I dette tidsrum kan vævsprøver indsamles, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponset. For eksempel kan histologisk undersøgelse og viral belastning kvantificering udføres i forskellige væv for at etablere sammenhænge mellem indledningen og udviklingen af kliniske, virologiske og neuroinflammatoriske processer i PRV patogenese.
Ved hjælp af fodblok-vaccinationsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismer i PRV-induceret kløe i mus undersøges. Desuden, denne model kan give ny indsigt i indledningen og udvikling af virus-induceret neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bedre forståelse af de processer, der ligger til grund for alfaherpesvirus-inducerede neuropatier, kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne model nyttig til at undersøge mekanismerne i neuropatisk kløe hos patienter med post-herpetiske læsioner (f.eks herpes zoster, helvedesild) og teste nye terapeutiske mål i mus for de tilsvarende sygdomme hos mennesker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Denne protokol beskriver en footpad vaccination model, der anvendes til at studere indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion i mus. Som alphaherpesvirus er de vigtigste angribere af det perifere nervesystem (PNS), denne model er egnet til at karakterisere kinetik af viral replikation, dens spredning fra PNS til CNS, og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Den footpad vaccination model giver virus partikler til at sprede sig fra en primær infektion site i footpad epidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes via iskiasnerven til dorsale rod ganglier (DRG) og i sidste ende gennem rygmarven til hjernen. Her, en mus footpad er podet med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nært beslægtet med herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne model viser, at PRV-infektion inducerer alvorlig betændelse, karakteriseret ved neutrofil infiltration i footpad og DRG. Høje koncentrationer af inflammatoriske cytokiner påvises efterfølgende i homogeniserede væv ved ELISA. Desuden observeres en stærk korrelation mellem PRV-genet og proteinudtryk (via qPCR og IF farvning) i DRG og produktionen af proinflammatoriske cytokiner. Derfor, footpad vaccination model giver en bedre forståelse af de processer, der ligger til grund alfaherpesvirus-induceret neuropatier og kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. Desuden kan modellen guide forskning på perifere neuropatier, såsom multipel sklerose og tilhørende viral-induceret skade på PNS. I sidste ende kan det tjene som et omkostningseffektivt in vivo-værktøj til udvikling af lægemidler.

Musen footpad podning model giver mulighed for karakterisering af immunpatogenese af alphaherpesvirus infektion in vivo, herunder replikering og spredning af infektionen fra den podede footpad til nervesystemet og induktion af specifikke neuroinflammatoriske reaktioner.
I denne undersøgelse, vi først abraded musen bagfødslet og enten mock-podet eller podet den abraded region med en ondartet stamme af PRV (PRV-Becker). Stedet for slid var synlig i kontrol footpad. En skorpe blev dannet på s...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Den footpad vaccination model er et værdifuldt værktøj til at karakterisere viral-induceret neuroinflammatoriske reaktioner in vivo. Den giver især en klar vurdering af viral kinetik og tilhørende immunpatologiske processer, der er indledt i det perifere nervesystem.

Mus Footpad Podulation Model til undersøgelse Viral-induceret Neuroinflammatory Responses

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Denne protokol giver mulighed for undersøgelse af indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner i musen perifere nervesystem under en virusinfektion. Med denne model, infektioner rejse en større afstand fra periferien til det perifere og centrale nervesystem, så en maksimal vurdering af kinetik af neuroinflammatoriske respons. Efter at placere de fem til syv uger gamle bedøvet C57BL/6 mus i liggende position på en kirurgisk pad, bekræfte en manglende reaktion på pedal refleks.Og brug en 100 til 180 grus slibning bord, til forsigtigt at abrade den glabrous huden af en hind footpad mellem hælen og gå puder med omkring 20 passerer af brættet. Brug derefter fine kraftbecer til langsomt at skrælle stratum corneum løsrevet af slid for at eksponere stratum basale. Efter skånsom blanding påføres topisk 20 mikroliter af den relevante titer af virusinokulum på den afslede footpad.Der udføres kun mock-vaccinationer med medium i de afslede fodpuder af kontroldyr parallelt. Efter hver påføring gnides fodpladen forsigtigt 10 gange med skaftet af en nål for at lette adsorption af virus hver 10 minutter i 30 minutter. Når den afslede footpad tørres, skal musene komme sig med overvågning, indtil sternal recumbency, før dyrene anbringes i de enkelte bure med henblik på klinisk opfølgning og prøveudtagning.På de relevante eksperimentelle tidspunkter indsamles de virusudponerede organer, herunder hjerte, lunger, milt, bugspytkirtel, lever, nyrer og blære, i individuelle 1,5 milliliter mikrorør på is. Høst derefter de afslede fodpuder mellem hælen og gåpuderne, og læg prøverne i individuelle 1,5 milliliter mikrorør på is. Dernæst placere musen i den udsatte position og våd pelsen med 70% ethanol.At udsætte rygsøjlen, lave et lille snit i regionen af bækkenet og fratage huden fra baglestremerne mod hovedet. For at fjerne for- og bagbenene skal du bruge en saks til at skære parallelt med og tæt på rygsøjlen på begge sider. Og fjern hovedet i bunden af kraniet.Brug saksen til at åbne kraniet fra foramen magnum til frontal knoglen. Og brug krafterne til at åbne kraniet i en lateral retning. Brug derefter sceitterne til forsigtigt at øse hjernen ud og placere hjernen i en 1,5 milliliter mikrorør på is.Brug buet saks til at rense rygsøjlen af muskler, fedt og blødt væv, og fjerne halen. Derefter anbringes den intakte rygsøjle i et 15 milliliterrør af steril iskold PBS på is i højst tre timer. Efter dissektion, overføre rygmarven i et væv kultur parabol at tillade fjernelse af eventuelle resterende blødt væv.Brug et barberblad til at lave tre tværgående snit gennem rygsøjlen på S2, L1, og T1 ryghvirvler. Stykerne overføres til individuelle 15 millimeter retter, der indeholder steril iskold PBS. Hold styr på og mærkning af segmentets oprindelse til senere analyse.Brug derefter vicess til at sikre et segment dorsal side op og bruge et barberblad til at lave en enkelt, langsgående skåret ned gennem midterlinjen for at opdele kolonnen i to lige store halvdele. Placer begge halvdele i en ny petriskål, der indeholder frisk, steril iskold PBS i den oprindelige retning for at kunne skelne mellem venstre og højre side af rygsøjlen. Under et dissekerende mikroskop skal du bruge fine kraftbefængte til forsigtigt at skrælle rygmarven ud af hver halvdel af rygsøjlen i en rostral til haleretning.Derefter placeres begge rygmarvshalvdele i individuelle 1,5 milliliter mikrorør, der indeholder 500 mikroliter steril iskold PBS på is. At udsætte dorsale rod ganglion, forsigtigt fjerne meninges fra den ene side af rygsøjlen til den anden. Og træk den udsatte hvide rygnerve ud af rygsøjlen.Høst den runde, gennemsigtige dorsale rod ganglion fra rygsøjlen segment i en 15 millimeter petriskål af iskold PBS. Og indsamle ipsilateral og kontralateral dorsale rod ganglion som netop vist. Efter høst spinal nerve og dorsale rod ganglion fra de to andre rygsøjlen segmenter som netop påvist, centrifuge alle rør af væv ved høj hastighed.Derefter aspirere supernatanter og flash-fryse prøverne i flydende nitrogen, og opbevares på minus 80 grader Celsius indtil homogenisering. Til vævshomogenisering optørørene af frosset væv på is, før de vejer 100 mg af hver prøve ud. Overfør til et mikrocentrifugerør på to milliliter, der indeholder sterile perler og 500 mikroliter af radioimmunoprecipitationsanalysebuffer.Dernæst forstyrre væv ved stuetemperatur på en homogenisator på 20 cyklusser per sekund i to minutter, efterfulgt af en et minuts ventetid, og 20 cyklusser per sekund i yderligere to minutter. Efter anden homogeniseringsrunde centrifugeres vævene med høj hastighed, før 500 mikroliter af hver supernatant overføres til et nyt passende mærket rør. Opbevares på minus 20 grader Celsius indtil downstream analyse.Slidstedet er synligt i kontrolfodpladen. Og det er typisk for en skorpe at danne på slidstedet som en del af helingsprocessen. I modsætning hertil, mus podet med pseudorabies, demonstrere en alvorlig betændelse i footpad på humane endepunkt, der er karakteriseret ved hævelse og rødme.Histopatologisk undersøgelse af den podede footpad og dorsale rod ganglion afslører epidermal nekrose og svær dermal betændelse i pseudorabies inficerede fodsektioner. Infiltration af neutrofiler er også observeret i pseudorabies inficerede DRG sektioner. En betydelig stigning i G-CSF protein udtryk måles i footpad og dorsale rod ganglion af pseudorabies inficerede mus sammenlignet med kontrol på både syv og 82 timer efter infektion.SignifikantE G-CSF niveauer er også observeret på 82-timer post-infektion i rygmarven, hjernen, hjerte, og levervæv af pseudorabies inficerede mus i forhold til kontrol. Desuden påvises signifikante niveauer af IL-6 i alle testede væv af pseudorabies-inficerede mus fra 24 timer efter infektionen. I en døende tilstand, pseudorabies blev opdaget i footpad, dorsal rod ganglion, rygmarv, og hjerne.Med den høje cytoplasmatiske udtryk for psuedorabies glycoprotein gB i neuroner af dorsale rod ganglion i pseudorabies inficerede mus. For at sikre en vellykket infektion, er det vigtigt, at dråbe virus i en kolonne ikke falder fra den abraded footpad. Denne dyremodel kan tjene platform til at teste effekten af anti-inflammatoriske og antivirale lægemidler for at forhindre viral-induceret perifere neuropatier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoller til vaginal Podning og Prøvetagning i den eksperimentelle musemodel Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Undersøge, hvilken rolle svælg-associeret lymforetikulære Tissue (NALT) i mus Responses til vacciner

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniseret Mouse Model til Study bakterieinfektioner Målretning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Øget Recovery Time og Nedsat LPS administration til at undersøge den Vagus nerve stimulation Mekanismer i Begrænsede inflammatoriske reaktioner

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsigtet overvågning af inflammatoriske reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge Blister protokol at studere Human T-celle hjemkalde svar In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En barciak Oral Administration Model til Study Commensal-Induced medfødte immunrespons

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skræddersy in vivo cytotoksiske assays til at studere immun dominans i tumor specifikke CD8+ T- celle respons

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...