Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

De auteurs erkennen Charles River laboratoria voor hun uitstekende technische ondersteuning bij het uitvoeren van de histopathologie analyses. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 en RO1 NS060699). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens een protocol (nummer 2083-16 en 2083-19) dat is beoordeeld en goedgekeurd door het Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) van Princeton University. Dit werk werd gedaan door strikt te volgen op de bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) eisen, waaraan we een volledig uitgerust lab goedgekeurd door de Princeton University biosafety com. De procedures met inbegrip van muis voetpad slijtage, virale inenting, muis dissectie, en weefsel collectie werden uitgevoerd in een biologisch...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia.">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aujeszky's+disease+(pseudorabies)+in+pigs.">Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs.</a> Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).</li><li>Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue:+Application+in+the+APP/PS1+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing.">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).</li><li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models.">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li><li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1.">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li><li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons.">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).</li><li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li><li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Het hier beschreven voetpad inentingsmodel is nuttig om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alfaherpesvirusinfectie te onderzoeken. Bovendien wordt dit in vivo model gebruikt om de kinetiek van replicatie en verspreiding van alfaherpesvirus van het PNS naar CNS vast te stellen. Dit is een alternatief voor andere inentingsmodellen, zoals het flankhuidinentingsmodel, dat is gebaseerd op diepe huidkrassen13, of de intracraniale route, die het virus rechtstreeks intro...

Deze studie beschrijft een voetpad inenting model om de replicatie en verspreiding van virussen te onderzoeken van de PNS naar CNS en de bijbehorende neuro-ontstekingsreacties. Het voetpad inentingsmodel is intensief gebruikt om alfaherpesvirusinfectie in neuronen1,2,,3te bestuderen. Het belangrijkste doel van dit model is om neurotrope virussen om een maximale afstand te reizen door de PNS voor het bereiken van de CNS. Hier wordt dit model gebruikt om nieuwe inzichten te verkrijgen in de ontwikkeling van een bepaalde neuropathie (neuropathische jeuk) bij muizen die besmet zijn met het pseudorabiesvirus (PRV).
PRV is een alfaherpesvirus gerelateerd aan verschillende bekende ziekteverwekkers (d.w.z. herpes simplex type 1 en 2 [HSV1 en HSV2] en varicella-zoster virus [VZV]), die koortsblaasjes, genitale laesies en waterpokken veroorzaken, respectievelijk4. Deze virussen zijn allemaal pantropisch en in staat om veel verschillende celtypes te infecteren zonder affiniteit te tonen voor een specifiek weefseltype. Ze vertonen echter allemaal een karakteristiek neurotropisme door de PNS (en af en toe het CNS) van gastsoorten binnen te vallen. De natuurlijke gastheer is het varken, maar PRV kan de meeste zoogdieren infecteren. In deze niet-natuurlijke gastheren, PRV infecteert de PNS en induceert een ernstige pruritus genaamd de "mad jeuk", gevolgd door peracute dood5,6. De rol van de neuro-immuunrespons in de klinische uitkomst en pathogenese van PRV-infectie is slecht begrepen.
Het voetpad inentingsmodel stelt PRV in staat om infectie in de opperhuidcellen van het voetpad te starten. Dan, de infectie verspreidt zich in zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich door virusdeeltjes die binnen ongeveer 60 uur via de heupzenuw naar de DRG bewegen. De infectie verspreidt zich door het ruggenmerg, uiteindelijk het bereiken van de achterhersenen wanneer dieren stervende raken (82 uur na infectie). Gedurende deze tijd venster, weefsel monsters kunnen worden verzameld, verwerkt, en geanalyseerd voor virus replicatie en markers van de immuunrespons. Bijvoorbeeld, histologisch onderzoek en virale belasting kwantificering kan worden uitgevoerd in verschillende weefsels om correlaties tussen de initiatie en ontwikkeling van klinische, virologische en neuro-inflammatoire processen in PRV pathogenese vast te stellen.
Met behulp van het voetpad inentingsmodel kunnen de cellulaire en moleculaire mechanismen van PRV-geïnduceerde pruritus bij muizen worden onderzocht. Bovendien kan dit model nieuw inzicht geven in de initiatie en ontwikkeling van door virussen geïnduceerde neuro-ontsteking tijdens herpesvirusinfecties. Een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën kan leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Dit model is bijvoorbeeld nuttig om de mechanismen van neuropathische jeuk te onderzoeken bij patiënten met postherpetische laesies (bijvoorbeeld herpes zoster, gordelroos) en nieuwe therapeutische doelen bij muizen te testen op de overeenkomstige menselijke ziekten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Dit protocol beschrijft een voetpad inenting model dat wordt gebruikt om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alphaherpesvirus infectie bij muizen te bestuderen. Als alfaherpesvirussen zijn belangrijkste indringers van het perifere zenuwstelsel (PNS), dit model is geschikt om de kinetiek van virale replicatie, de verspreiding ervan van de PNS naar CNS, en de bijbehorende neuro-inflammatorische reacties te karakteriseren. Het voetpad inentingsmodel maakt het mogelijk virusdeeltjes te verspreiden van een primaire infectie site in het voetpad opperhuid tot zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich via de heupzenuw naar de rugwortel ganglia (DRG) en uiteindelijk via het ruggenmerg naar de hersenen. Hier wordt een muisvoetpad ingeënt met pseudorabiesvirus (PRV), een alfaherpesvirus dat nauw verwant is aan het Herpes simplex virus (HSV) en het varicella-zostervirus (VZV). Dit model toont aan dat PRV-infectie ernstige ontsteking veroorzaakt, gekenmerkt door neutrofiele infiltratie in het voetpad en DRG. Hoge concentraties inflammatoire cytokinen worden vervolgens gedetecteerd in gehomogeniseerde weefsels door ELISA. Daarnaast wordt een sterke correlatie waargenomen tussen PRV-gen- en eiwitexpressie (via qPCR en IF-kleuring) in DRG en de productie van pro-inflammatoire cytokinen. Daarom biedt het voetpad inentingsmodel een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën en kan het leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Daarnaast kan het model onderzoek naar perifere neuropathieën begeleiden, zoals multiple sclerose en bijbehorende virale schade aan de PNS. Uiteindelijk kan het dienen als een kosteneffectief in vivo instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Het muisvoetpad inentingsmodel maakt karakterisering van de immunopathogenese van alfaherpesvirusinfectie in vivo mogelijk, inclusief replicatie en verspreiding van de infectie van het ingeënte voetpad naar het zenuwstelsel en de inductie van specifieke neuro-inflammatoire reacties.
In deze studie schuurden we eerst het achtervoetpad van de muis en hebben we het geschuurde of ingeënt gebied met een virulente stam van PRV (PRV-Becker) geschuurd of ingeënt. De plaats van slijtage was zichtbaa...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Het voetpad inentingsmodel is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van virale geïnduceerde neuro-inducerende reacties in vivo. Het biedt met name een duidelijke beoordeling van virale kinetiek en bijbehorende immunopathologische processen die in het perifere zenuwstelsel worden geïnitieerd.

Mouse Footpad Inenting Model om virale geïnduceerde neuro-ontstekingsreacties te bestuderen

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Dit protocol maakt het mogelijk de studie van de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties in de muis perifere zenuwstelsel tijdens een virale infectie. Met dit model, infecties reizen een grotere afstand van de periferie naar het perifere en centrale zenuwstelsel, waardoor een maximale beoordeling van de kinetiek van de neuro-inflammatoire reactie. Na het plaatsen van de vijf tot zeven weken oude verdoofde C57BL/6 muis in de supine positie op een chirurgische pad, bevestig een gebrek aan reactie op pedaal reflex.En gebruik een 100 tot 180 grit emery board, om zachtjes schuren de glabrous huid van een achterste voetpad tussen de hiel en wandelpads met ongeveer 20 passen van het bord. Gebruik dan fijne tangen om langzaam af te pellen van de stratum corneum losgemaakt door de slijtage aan de stratum basale bloot te leggen. Na het zachte mengen, actueel aanbrengen 20 microliter van de juiste titer van virus inoculum op de geschuurde voetpad.Voer schijninentingen met medium alleen uit in de geschuurde voetpaden van controledieren parallel. Wrijf na elke toepassing het voetpad 10 keer voorzichtig in met de schacht van een naald om de adsorptie van het virus gedurende 30 minuten te vergemakkelijken. Wanneer het geschuurde voetpad is gedroogd, laat u de muizen met controle herstellen tot sternale recumbency voordat ze de dieren in individuele kooien plaatsen voor klinische follow-up en bemonstering.Op de juiste experimentele tijdstippen, het verzamelen van het virus blootgestelde organen, met inbegrip van het hart, longen, milt, alvleesklier, lever, nieren, en blaas in individuele 1,5 milliliter microtubes op ijs. Oogst vervolgens de geschuurde voetpaden tussen de hiel en de wandelpads en leg de monsters in individuele 1,5 milliliter microtubes op ijs. Plaats vervolgens de muis in de gevoelige positie en maak de vacht nat met 70% ethanol.Om de wervelkolom bloot te leggen, maak een kleine incisie in het gebied van het bekken en strip de huid van de achterste ledematen naar het hoofd. Om de voor- en achterpoten te verwijderen, gebruikt u een schaar om parallel met en dicht bij de wervelkolom aan beide zijden te snijden. En verwijder het hoofd aan de basis van de schedel.Gebruik de schaar om de schedel te openen van de foramen magnum naar het frontale bot. En gebruik tangen om de schedel in een zijwaartse richting open te trekken. Gebruik dan de tangen om voorzichtig schep uit de hersenen en plaats de hersenen in een 1,5 milliliter microtube op ijs.Gebruik gebogen schaar om de wervelkolom van spier, vet en zacht weefsel schoon te maken en verwijder de staart. Plaats vervolgens de intacte wervelkolom in een 15 milliliter buis van steriele ijskoude PBS op ijs voor niet meer dan drie uur. Na de dissectie, breng het ruggenmerg in een weefsel cultuur schotel om verwijdering van eventuele resterende weke delen mogelijk te maken.Gebruik een scheermesje om drie dwarse sneden te maken door de wervelkolom op de S2, L1, en de T1 wervels. Breng de stukken in individuele 15 millimeter schotels met steriele ijskoude PBS. Het bijhouden en markeren van de oorsprong van de segmenten voor latere analyse.Gebruik vervolgens tangen om een segment dorsale kant omhoog te beveiligen en gebruik een scheermesje om een enkele, longitudinale cut down door de middellijn om de kolom te splitsen in twee gelijke helften te maken. Plaats beide helften in een nieuwe petrischaal met verse, steriele ijskoude PBS in de oorspronkelijke oriëntatie om de linker- en rechterkant van de wervelkolom te kunnen onderscheiden. Gebruik onder een ontledenmicroscoop fijne tangen om het ruggenmerg voorzichtig uit de elke helft van de wervelkolom te pellen in een rostral naar caudal richting.Plaats vervolgens beide ruggenmerghelften in individuele 1,5 milliliter microbuisjes met 500 microliter steriele ijskoude PBS op ijs. Om de dorsale wortel ganglion bloot te stellen, verwijder voorzichtig de hersenvliezen van de ene kant van de wervelkolom naar de andere. En trek de blootgestelde witte ruggenmerg zenuw uit de wervelkolom.Oogst de ronde, transparante rugwortel ganglion uit de wervelkolom segment in een 15 millimeter Petri schotel van ijskoude PBS. En het verzamelen van de ipsilaterale en contralaterale dorsale wortel ganglion zoals net aangetoond. Na het oogsten van de spinale zenuw en dorsale wortel ganglion van de andere twee wervelkolom segmenten zoals net aangetoond, centrifuge alle buizen van weefsel op hoge snelheid.Dan aspirate de supernatants en flash-freeze de monsters in vloeibare stikstof, en op te slaan op min 80 graden Celsius tot homogenisatie. Voor weefselhomogenisatie ontdooit u de buisjes bevroren weefsel op ijs voordat u 100 milligram van elk monster weegt. Breng over in een twee milliliter microcentrifugebuis met steriele kralen en 500 microliters radioimmunoprecipitatie.Vervolgens verstoren de weefsels bij kamertemperatuur op een homogenisator op 20 cycli per seconde gedurende twee minuten, gevolgd door een wachttijd van een minuut, en 20 cycli per seconde voor een extra twee minuten. Na de tweede ronde van homogenisatie, centrifugeren de weefsels op hoge snelheid alvorens 500 microliters van elke supernatant in een nieuwe geschikt gelabelde buis. Opslaan op min 20 graden Celsius tot downstream analyse.De plaats van slijtage is zichtbaar in het controlevoetpad. En het is typisch voor een korst te vormen op de slijtage site als onderdeel van het genezingsproces. Muizen daarentegen ingeënt met pseudorabies, tonen een ernstige ontsteking van het voetpad aan op het humane eindpunt dat wordt gekenmerkt door zwelling en roodheid.Histopathologisch onderzoek van het ingeënte voetpad en dorsale wortel ganglion onthult epidermale necrose en ernstige huidontsteking binnen de pseudorabies geïnfecteerde voetsecties. Infiltratie van neutrofielen wordt ook waargenomen in pseudorabies geïnfecteerde DRG secties. Een aanzienlijke toename van G-CSF eiwitexpressie wordt gemeten in het voetpad en dorsale wortel ganglion van pseudorabies geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles op zowel zeven als 82-uur na infectie.Significante G-CSF niveaus worden ook waargenomen op 82-uur na infectie in het ruggenmerg, hersenen, hart, en leverweefsels van pseudorabies geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles. Bovendien worden significante niveaus van IL-6 gedetecteerd in alle geteste weefsels van met pseudorabies geïnfecteerde muizen vanaf 24 uur na infectie. In een stervende toestand, pseudorabies werd ontdekt in het voetpad, dorsale wortel ganglion, ruggenmerg, en hersenen.Met de hoge cytoplasmatische expressie van psuedorabies glycoprotein gB in de neuronen van de dorsale wortel ganglion in pseudorabies geïnfecteerde muizen. Om een succesvolle infectie te garanderen, is het belangrijk dat de druppel van het virus in een kolom niet van het geschuurde voetpad valt. Dit diermodel kan platform dienen om de werkzaamheid van ontstekingsremmende en antivirale geneesmiddelen te testen om virale geïnduceerde perifere neuropathieën te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Het onderzoeken van de rol van Nasopharyngeal-geassocieerde lymforeticulaire Tissue (nalt) in de muis reacties op vaccins

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantatie van Tail Skin aan allogene CD4 T-cel responsen bij muizen

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Verhoogde Recovery Time en verminderde LPS Administration aan de Nervus Vagus Stimulatie Mechanismen in Limited ontstekingsreacties Studie

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...