Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
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Les auteurs reconnaissent les laboratoires charles river pour leur excellent soutien technique exécutant les analyses d’histopathologie. Ces travaux ont été financés par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 et RO1 NS060699). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse de données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément à un protocole (numéro 2083-16 et 2083-19) examiné et approuvé par l’Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Princeton. Ce travail a été effectué en suivant strictement les exigences de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), auxquelles nous disposons d’un laboratoire entièrement équipé approuvé par le comité de biosécurité de l’Université de Princeton. Les procédures, y compris l’abrasion du tapis de s...

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	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Le modèle d’inoculation de la piétinement décrit ici est utile pour étudier l’initiation et le développement de réponses neuroinflammatoires pendant l’infection à alphaherpesvirus. En outre, ce modèle in vivo est utilisé pour établir la cinétique de la réplication et la propagation de l’alphaherpesvirus du PNS au SNC. Il s’agit d’une alternative à d’autres modèles d’inoculation, tels que le modèle d’inoculation de la peau du flanc, qui repose sur le grattage dermique profond<sup class="xr...

Cette étude décrit un modèle d’inoculation de la paillère pour étudier la réplication et la propagation des virus du SNP au SNC et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la passerelle a été intensivement utilisé pour étudier l’infection à l’alphaherpesvirus dans les neurones1,2,3. L’objectif principal de ce modèle est de permettre aux virus neurotropes de parcourir une distance maximale à travers le PNS avant d’atteindre le SNC. Ici, ce modèle est utilisé pour obtenir de nouvelles idées dans le développement d’une neuropathie particulière (démangeaisons neuropathiques) chez les souris infectées par le virus pseudorabies (PRV).
Le PRV est un alphaherpesvirus lié à plusieurs agents pathogènes bien connus (c.-à-d. l’herpès simplex de type 1 et 2 [HSV1 et HSV2] et le virus varicelle-zoster [VZV]), qui causent respectivement des boutons de fièvre, des lésions génitales et lavaricelle, respectivement 4. Ces virus sont tous pantropes et capables d’infecter de nombreux types de cellules différents sans montrer d’affinité pour un type de tissu spécifique. Cependant, ils présentent tous un neurotropisme caractéristique en envahissant le PNS (et parfois, le SNC) des espèces hôtes. L’hôte naturel est le porc, mais le PRV peut infecter la plupart des mammifères. Dans ces hôtes non naturels, prv infecte le PNS et induit un prurit sévère appelé la « émite foll », suivie par la mort peracute5,6. Le rôle de la réponse neuroimmune dans les résultats cliniques et la pathogénie de l’infection de PRV a été mal compris.
Le modèle d’inoculation de la héliporte permet au PRV d’initier l’infection dans les cellules épidermiques du pavé. Ensuite, l’infection se propage dans les fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares, et le derme. L’infection se propage par des particules virales se déplaçant via le nerf sciatique au DRG dans environ 60 h. L’infection se propage par la moelle épinière, atteignant finalement le cerveau postérieur lorsque les animaux deviennent moribondes (82 h après l’infection). Pendant cette période, des échantillons de tissus peuvent être prélevés, traités et analysés pour la réplication du virus et les marqueurs de la réponse immunitaire. Par exemple, l’examen histologique et la quantification de charge virale peuvent être exécutés dans différents tissus pour établir des corrélations entre l’initiation et le développement des processus cliniques, virologiques, et neuroinflammatoires dans la pathogénie de PRV.
À l’aide du modèle d’inoculation du pavé de pieds, les mécanismes cellulaires et moléculaires du prurit induit par le PRV chez la souris peuvent être étudiés. En outre, ce modèle peut fournir un nouvel aperçu de l’initiation et le développement de la neuroinflammation induite par le virus pendant les infections à herpèsvirus. Une meilleure compréhension des processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. Par exemple, ce modèle est utile pour étudier les mécanismes de démangeaisons neuropathiques chez les patients présentant des lésions post-herpétiques (par exemple, herpès zoster, zona) et tester de nouvelles cibles thérapeutiques chez les souris pour les maladies humaines correspondantes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Ce protocole décrit un modèle d’inoculation de pied-pad utilisé pour étudier l’initiation et le développement des réponses neuroinflammatoires pendant l’infection d’alphaherpesvirus chez la souris. Comme les alphaherpesvirus sont les principaux envahisseurs du système nerveux périphérique (PNS), ce modèle est approprié pour caractériser la cinétique de la réplication virale, sa propagation du PNS au SNC, et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la carte de pied permet aux particules virales de se propager d’un site d’infection primaire dans l’épiderme du pavé du pied aux fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares et le derme. L’infection se propage par l’intermédiaire du nerf sciatique aux ganglions de racine dorsale (DRG) et finalement par la moelle épinière au cerveau. Ici, un tapis de souris est inoculé avec le virus pseudorabies (PRV), un alphaherpesvirus étroitement lié au virus de l’herpès simplex (HSV) et au virus varicelle-zoster (VZV). Ce modèle démontre que l’infection de PRV induit l’inflammation grave, caractérisée par l’infiltration de neutrophile dans le pavé et le DRG. Des concentrations élevées de cytokines inflammatoires sont par la suite détectées dans les tissus homogénéisés par ELISA. En outre, une forte corrélation est observée entre le gène PRV et l’expression des protéines (via qPCR et si coloration) dans DRG et la production de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, le modèle d’inoculation de la piéillère permet de mieux comprendre les processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus et peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. En outre, le modèle peut guider la recherche sur les neuropathies périphériques, telles que la sclérose en plaques et les dommages induits par le virus associés à la PNS. En fin de compte, il peut servir d’outil in vivo rentable pour le développement de médicaments.

Le modèle d’inoculation du tapis de souris permet la caractérisation de l’immunopathogenèse de l’infection à l’alphaherpesvirus in vivo, y compris la réplication et la propagation de l’infection du pavé de pied inoculé au système nerveux et l’induction de réponses neuroinflammatoires spécifiques.
Dans cette étude, nous avons d’abord abrasé le tapis arrière de souris et soit simulé-inoculé ou inoculé la région abrasée avec une souche virulente de PRV (PRV-Becker)...

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Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Le modèle d’inoculation de la carte de pied est un outil précieux pour caractériser les réponses neuroinflammatoires induites par le virus in vivo. En particulier, il fournit une évaluation claire de la cinétique virale et des processus immunopathologiques associés initiés dans le système nerveux périphérique.

Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Ce protocole permet l’étude de l’initiation et du développement des réponses neuroinflammatory dans le système nerveux périphérique de souris pendant une infection virale. Avec ce modèle, les infections voyagent une plus grande distance de la périphérie au système nerveux périphérique et central, permettant une évaluation maximale de la cinétique de la réponse neuroinflammatory. Après avoir placé la souris C57BL/6 anesthésiée de cinq à sept semaines en position supine sur un bloc chirurgical, confirmer un manque de réponse au réflexe de la pédale.Et utilisez une planche d’émeri de 100 à 180 grains, pour abrader doucement la peau glabre d’un pied arrière entre le talon et les coussinets de marche avec environ 20 passages de la planche. Ensuite, utilisez des forceps fins pour décoller lentement la strate cornée détachée par l’abrasion pour exposer la basale strate. Après un mélange doux, appliquer topiquement 20 microlitres du litre approprié d’inoculum de virus sur le pavé abrassé.Effectuer des inoculations simulées avec moyen seulement dans les pavés abrasés des animaux de contrôle en parallèle. Après chaque application, frottez doucement le footpad 10 fois avec l’arbre d’une aiguille pour faciliter l’adsorption du virus toutes les 10 minutes pendant 30 minutes. Lorsque le pavé abradé est séché, permettre aux souris de récupérer avec surveillance jusqu’à la récumbence sternale avant de placer les animaux dans des cages individuelles pour un suivi clinique et l’échantillonnage.Aux moments expérimentaux appropriés, recueillir les organes exposés au virus, y compris le cœur, les poumons, la rate, le pancréas, le foie, les reins et la vessie en microtubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, récoltez les coussinets abrasés entre le talon et les coussinets de marche et placez les échantillons dans des microtubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, placez la souris en position couchée et mouillez la fourrure avec 70% d’éthanol.Pour exposer la colonne vertébrale, faire une petite incision dans la région du bassin et dépouiller la peau des membres postérieurs vers la tête. Pour enlever les membres avant et arrière, utilisez des ciseaux pour couper parallèlement à la colonne vertébrale des deux côtés et à proximité. Et retirez la tête à la base du crâne.Utilisez les ciseaux pour ouvrir le crâne du magnum foramen à l’os frontal. Et utilisez des forceps pour ouvrir le crâne dans une direction latérale. Ensuite, utilisez les forceps pour ramasser doucement le cerveau et placer le cerveau dans un microtube de 1,5 millilitre sur la glace.Utilisez des ciseaux incurvés pour nettoyer la colonne vertébrale des muscles, des graisses et des tissus mous, et enlever la queue. Placez ensuite la colonne vertébrale intacte dans un tube de 15 millilitres de PBS stérile glacé sur la glace pendant au plus trois heures. Après la dissection, transférer la moelle épinière dans un plat de culture tissulaire pour permettre l’enlèvement de tout tissu mou restant.Utilisez une lame de rasoir pour faire trois coupes transversales à travers la colonne vertébrale aux vertèbres S2, L1 et T1. Transférer les morceaux dans des plats individuels de 15 millimètres contenant du PBS froid comme glace stérile. Garder une trace et marquer les origines des segments pour une analyse ultérieure.Ensuite, utilisez des forceps pour fixer un côté dorsale du segment vers le haut et utilisez une lame de rasoir pour faire une seule coupe longitudinale à travers la ligne médiane pour diviser la colonne en deux moitiés égales. Placez les deux moitiés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS frais et stérile glacé dans l’orientation originale pour pouvoir distinguer les côtés gauche et droit de la colonne vertébrale. Sous un microscope disséquant, utiliser des forceps fins pour peler doucement la moelle épinière de chaque moitié de la colonne vertébrale dans une direction rostrale à caudale.Placez ensuite les deux moitiés de moelle épinière dans des microtubes individuels de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS stérile glacé sur la glace. Pour exposer le ganglion de racine dorsale, retirez doucement les méninges d’un côté de la colonne vertébrale à l’autre. Et retirez le nerf spinal blanc exposé de la colonne vertébrale.Récoltez le ganglion de racines dorsales rond et transparent du segment de la colonne vertébrale en une boîte de Pétri de 15 millimètres de PBS glacé. Et recueillir le ganglion de racine dorsale ipsilateral et contralatéral comme vient de le démontrer. Après avoir récolté le nerf spinal et le ganglion de racine dorsale des deux autres segments de colonne vertébrale comme juste démontré, centrifugeuse tous les tubes du tissu à grande vitesse.Ensuite, aspirez les supernatants et clignotez les échantillons dans de l’azote liquide, et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à homogénéisation. Pour l’homogénéisation tissulaire, décongeler les tubes de tissu congelé sur la glace avant de peser 100 milligrammes de chaque échantillon. Transférer dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant des perles stériles et 500 microlitres de tampon d’essai de radioimmunoprécipation.Ensuite, perturbez les tissus à température ambiante sur un homogénéisant à 20 cycles par seconde pendant deux minutes, suivi d’une période d’attente d’une minute, et de 20 cycles par seconde pendant deux minutes supplémentaires. Après le deuxième cycle d’homogénéisation, centrifugez les tissus à grande vitesse avant de transférer 500 microlitres de chaque supernatant dans un nouveau tube dûment étiqueté. Conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse en aval.Le site de l’abrasion est visible dans le pavé de contrôle. Et il est typique qu’une croûte se forme au site d’abrasion dans le cadre du processus de guérison. En revanche, les souris inoculées avec des pseudorabies, démontrent une inflammation grave du footpad au point final humain qui est caractérisé par le gonflement et la rougeur.L’examen histopathologique du footpad inoculé et du ganglion dorsale de racine indique la nécrose épidermique et l’inflammation cutanée grave dans les sections infectées de pied de pseudorabies. L’infiltration des neutrophiles est également observée dans les pseudorabies infectées sections DRG. Une augmentation significative de l’expression de protéine de G-CSF est mesurée dans le footpad et le ganglion dorsale de racine des souris infectées de pseudorabies comparées aux contrôles à la fois à sept et 82 heures après l’infection.Des niveaux significatifs de G-CSF sont également observés à 82 heures après infection dans la moelle épinière, le cerveau, le coeur, et les tissus de foie des souris infectées de pseudorabies comparées aux contrôles. En outre, des niveaux significatifs d’IL-6 sont détectés dans tous les tissus testés de souris infectées par pseudorabies à partir de 24 heures après l’infection. Dans un état moribond, des pseudorabies ont été détectées dans le footpad, le ganglion dorsale de racine, la moelle épinière, et le cerveau.Avec l’expression cytoplasmique élevée de psuedorabies glycoprotéine gB dans les neurones du ganglion dorsale de racine chez les souris infectées de pseudorabies. Pour assurer une infection réussie, il est important que la gouttelette de virus dans une colonne ne tombe pas du pavé abrassé. Ce modèle animal peut servir de plate-forme pour tester l’efficacité des anti-inflammatoires et des antiviraux afin de prévenir les neuropathies périphériques induites par le virus.

Research

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