Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
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Gli autori riconoscono i laboratori Charles River per il loro eccellente supporto tecnico nell'esecuzione delle analisi istopatologiche. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità a un protocollo (numero 2083-16 e 2083-19) esaminato e approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituzione (IACUC) dell'Università di Princeton. Questo lavoro è stato fatto seguendo rigorosamente i requisiti di livello di biosicurezza-2 (BSL-2), a cui abbiamo un laboratorio completamente attrezzato approvato dal comitato per la biosicurezza dell'Università di Princeton. Le procedure, tra cui l'abrasione del piede del topo, l...

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	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Il modello di inoculazione del footpad descritto qui è utile per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus. Inoltre, questo modello in vivo viene utilizzato per stabilire la cinetica della replicazione e la diffusione di alfaherpesvirus dal PNS al SNC. Si tratta di un'alternativa ad altri modelli di inoculazione, come il modello di inoculazione della pelle del fianco, che si basa su graffi dermici profondi13, o il percorso intracranico, c...

Questo studio descrive un modello di inoculazione del footpad per studiare la replica e la diffusione dei virus dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad è stato utilizzato intensamente per studiare l'infezione da alfaherpesvirus nei neuroni1,2,3. L'obiettivo principale di questo modello è quello di consentire ai virus neurotropici di percorrere una distanza massima attraverso il PNS prima di raggiungere il SNC. Qui, questo modello viene utilizzato per ottenere nuove intuizioni nello sviluppo di un particolare neuropatia (prurito neuropatico) in topi infettati da pseudorabies virus (PRV).
Il PRV è un alfaintovirus correlato a diversi patogeni ben noti (cioè herpes simplex di tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e virus varicella-zoster [VV]), che causano herpivi di freddo, lesioni genitali e varicella, rispettivamente4. Questi virus sono tutti pantropici e in grado di infettare molti diversi tipi di cellule senza mostrare affinità per un tipo di tessuto specifico. Tuttavia, tutti presentano un caratteristico neurotropismo invadendo il PNS (e occasionalmente, il CNS) delle specie ospiti. L'ospite naturale è il maiale, ma il PRV può infettare la maggior parte dei mammiferi. In questi ospiti non naturali, PRV infetta il PNS e induce un forte prurito chiamato "prurito pazzo", seguito da morte peracuta5,6. Il ruolo della risposta neuroimmune nell'esito clinico e nella patogenesi dell'infezione da PRV è stato poco compreso.
Il modello di inoculazione del footpad consente a PRV di avviare l'infezione nelle cellule epidermiche del footpad. Quindi, l'infezione si diffonde in fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e il derma. L'infezione si diffonde da particelle di virus che si muovono attraverso il nervo sciatico al DRG entro circa 60 h. L'infezione si diffonde attraverso il midollo spinale, raggiungendo infine il cervello posteriore quando gli animali diventano moribondi (82 h dopo l'infezione). Durante questa finestra temporale, i campioni di tessuto possono essere raccolti, elaborati e analizzati per la replicazione del virus e marcatori della risposta immunitaria. Ad esempio, l'esame istologico e la quantificazione del carico virale possono essere eseguiti in diversi tessuti per stabilire correlazioni tra l'avvio e lo sviluppo di processi clinici, virologici e nevrinfiammatori nella patogenesi PRV.
Utilizzando il modello di inoculazione del pedebole, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari del prurito indotta da PRV nei topi. Inoltre, questo modello può fornire nuove informazioni sull'avvio e lo sviluppo di neuroinfiammazioni indotte da virus durante le infezioni da herpesvirus. Una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte dall'alfadante può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Ad esempio, questo modello è utile per studiare i meccanismi del prurito neuropatico nei pazienti con lesioni post-epetiche (ad esempio, herpes zoster, heringles) e testare nuovi bersagli terapeutici nei topi per le corrispondenti malattie umane.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Questo protocollo descrive un modello di inoculazione del footpad utilizzato per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus nei topi. Poiché gli alfaherppi sono i principali invasori del sistema nervoso periferico (PNS), questo modello è adatto a caratterizzare la cinetica della replicazione virale, la sua diffusione dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad consente alle particelle di virus di diffondersi da un sito di infezione primaria nell'epidermide del footpad alle fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e la dermide. L'infezione si diffonde attraverso il nervo sciatico ai gangli della radice dorsale (DRG) e, infine, attraverso il midollo spinale al cervello. Qui, un piede di topo è inoculato con pseudorabies virus (PRV), un virus alfaherpesvirus strettamente correlato al virus dell'herpes simplex (HSV) e del virus varicella-zoster . Questo modello dimostra che l'infezione da PRV induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie vengono successivamente rilevate nei tessuti omogeneizzati da ELISA. Inoltre, si osserva una forte correlazione tra l'espressione genica e proteica PRV (tramite qPCR e colorazione IF) nella DRG e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, il modello di inoculazione del footpad fornisce una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte da alfaancorato e può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Inoltre, il modello può guidare la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e il danno ai virali associato al PNS. In definitiva, può servire come uno strumento in vivo conveniente per lo sviluppo di farmaci.

Il modello di inoculazione del piede del mouse consente la caratterizzazione dell'immunopatogenesi dell'infezione da alfarevirus in vivo, compresa la replicazione e la diffusione dell'infezione dal footpad inoculato al sistema nervoso e l'induzione di specifiche risposte neuroinfiammatorie.
In questo studio, abbiamo prima abraso il piede posteriore del topo e sia finto-inoculato o inoculato la regione abrasa con un ceppo virulento di PRV (PRV-Becker). Il sito di abrasione era visibile nella pe...

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Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Il modello di inoculazione del footpad è uno strumento prezioso per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie indotte da virali in vivo. In particolare, fornisce una valutazione chiara della cinetica virale e dei processi immunopatologici associati avviati nel sistema nervoso periferico.

Mouse Footpad Modello di inoculazione per studiare risposte neuroinfiammatorie indotte da virus

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Questo protocollo consente lo studio dell'iniziazione e dello sviluppo di risposte neuroinfiammatorie nel sistema nervoso periferico del topo durante un'infezione virale. Con questo modello, le infezioni percorreno una maggiore distanza dalla periferia al sistema nervoso periferico e centrale, consentendo una valutazione massima della cinetica della risposta neuroinfiammatoria. Dopo aver posizionato il mouse C57BL/6 anestetizzato di cinque-sette settimane nella posizione supina su un cuscinetto chirurgico, confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale.E usa una tavola emery da 100 a 180 graniglia, per abrasare delicatamente la pelle glabrata di un piede posteriore tra il tallone e i cuscinetti da pass con circa 20 passaggi della tavola. Quindi utilizzare forcep fini per staccare lentamente lo strato corneo staccato dall'abrasione per esporre lo strato basale. Dopo una miscelazione delicata, applicare topicamente 20 microlitri del tazzo appropriato dell'inoculo del virus sul peduncolo abraso.Effettuare finte inoculazioni con mezzo solo nei pedoni abrasi degli animali di controllo in parallelo. Dopo ogni applicazione, strofinare delicatamente il pedone 10 volte con l'albero di un ago per facilitare l'adsorbimento del virus ogni 10 minuti per 30 minuti. Quando il pedante abraso viene asciugato, consentire ai topi di riprendersi con il monitoraggio fino a quando la reclinanza sternale prima di mettere gli animali in gabbie individuali per il follow-up clinico e il campionamento.Nei punti di tempo sperimentali appropriati, raccogliere gli organi esposti al virus, inclusi il cuore, i polmoni, la milza, il pancreas, il fegato, i reni e la vescica in singoli microtubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi raccogliere i pedoni abrasi tra il tallone e i cuscinetti da passeggio e posizionare i campioni in singoli microtubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi, posizionare il mouse nella posizione prona e bagnare la pelliccia con il 70% di etanolo.Per esporre la colonna vertebrale, fare una piccola incisione nella regione del bacino e rimuovere la pelle dagli arti posteriori verso la testa. Per rimuovere gli arti anteriori e posteriori, utilizzare le forbici per tagliare parallelamente e vicino alla colonna vertebrale su entrambi i lati. E rimuovere la testa alla base del cranio.Usa le forbici per aprire il cranio dal forame magnum all'osso frontale. E usa le forcep per aprire il cranio in direzione laterale. Quindi usa le forcep per raccogliere delicatamente il cervello e posizionare il cervello in un microtubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio.Usa forbici curve per pulire la colonna vertebrale di muscoli, grassi e tessuti molli e rimuovere la coda. Quindi posizionare la colonna vertebrale intatta in un tubo da 15 millilitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio per non più di tre ore. Dopo la dissezione, trasferire il midollo spinale in un piatto di coltura tissutale per consentire la rimozione di tutti i tessuti molli rimanenti.Usa una lama di rasoio per effettuare tre tagli trasversali attraverso la colonna vertebrale alle vertebre S2, L1 e T1. Trasferire i pezzi in singoli piatti da 15 millimetri contenenti PBS sterile ghiacciato. Tenere traccia e contrassegnare le origini dei segmenti per un'analisi successiva.Successivamente, utilizzare le forcep per fissare un lato dorsale di segmento verso l'alto e utilizzare una lama di rasoio per fare un singolo taglio longitudinale attraverso la linea mediana per dividere la colonna in due metà uguali. Posizionare entrambe le metà in una nuova piastra di Petri contenente PBS fresco e sterile ghiacciato nell'orientamento originale per poter distinguere i lati sinistro e destro della colonna vertebrale. Al microscopio sezionato, utilizzare forcep fini per sbucciare delicatamente il midollo spinale da ogni metà della colonna vertebrale in direzione rostrale a caudale.Quindi posizionare entrambe le metà del midollo spinale in singoli microtubi da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per esporre il ganglio della radice dorsale, rimuovere delicatamente le meningi da un lato della colonna vertebrale all'altro. E estrarre il nervo spinale bianco esposto dalla colonna vertebrale.Raccogli il ganglio rotondo e trasparente della radice dorsale dal segmento della colonna vertebrale in una piastra di Petri di 15 millimetri di PBS ghiacciato. E raccogliere il ganglio della radice dorsale ipsilaterale e contralaterale come appena dimostrato. Dopo aver raccolto il nervo spinale e il ganglio della radice dorsale dagli altri due segmenti della colonna vertebrale come appena dimostrato, centrifuga tutti i tubi di tessuto ad alta velocità.Quindi aspirare i supernatanti e congelare flash i campioni in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'omogeneizzazione. Per l'omogeneizzazione dei tessuti, scongelare i tubi di tessuto congelato sul ghiaccio prima di pesare 100 milligrammi di ciascun campione. Trasferire in un tubo di microcentrifugo a due millilitri contenente perline sterili e 500 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione.Successivamente, interrompere i tessuti a temperatura ambiente su un omogeneizzatore a 20 cicli al secondo per due minuti, seguito da un periodo di attesa di un minuto e 20 cicli al secondo per altri due minuti. Dopo il secondo ciclo di omogeneizzazione, centrifugare i tessuti ad alta velocità prima di trasferire 500 microlitri di ogni supernatante in un nuovo tubo opportunamente etichettato. Conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi downstream.Il sito di abrasione è visibile nel footpad di controllo. Ed è tipico che una crosta si fori nel sito di abrasione come parte del processo di guarigione. Al contrario, i topi inoculati con pseudorabie, dimostrano una grave infiammazione del footpad all'endpoint umano che è caratterizzata da gonfiore e arrossamento.L'esame istopatologico del pedone inoculato e del ganglio della radice dorsale rivela necrosi epidermica e grave infiammazione dermica all'interno delle sezioni del piede infettate da pseudorabi. L'infiltrazione di neutrofili è osservata anche nelle sezioni DRG infettate da pseudorabie. Un aumento significativo dell'espressione proteica G-CSF viene misurato nel footpad e nel ganglio della radice dorsale di topi infetti da pseudorabi rispetto ai controlli a sette e 82 ore dopo l'infezione.Significativi livelli di G-CSF sono osservati anche a 82 ore dopo l'infezione nel midollo spinale, nel cervello, nel cuore e nei tessuti epatici di topi infetti da pseudorabie rispetto ai controlli. Inoltre, livelli significativi di IL-6 sono rilevati in tutti i tessuti testati di pseudorabie topi infetti a partire da 24 ore dopo l'infezione. In uno stato moribondo, sono state rilevate pseudorabie nel pedante, nel ganglio della radice dorsale, nel midollo spinale e nel cervello.Con l'alta espressione citoplasmatica della psuedorabies glicoproteina gB nei neuroni del ganglio della radice dorsale nei topi infetti da pseudorabie. Per garantire un'infezione di successo, è importante che la goccia di virus in una colonna non cada dal footpad abraso. Questo modello animale può servire piattaforma per testare l'efficacia dei farmaci antinfiammatori e antivirali al fine di prevenire le neuropatie periferiche indotte dal virus.

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