Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
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著者らは、チャールズ川研究所が組織病理学分析を実行する優れた技術サポートを認めている。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS)(RO1 NS033506およびRO1 NS060699)によって資金提供されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

すべての動物実験は、プリンストン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によってレビューされ、承認されたプロトコル(番号2083-16および2083-19)に従って行われました。この作業は、プリンストン大学のバイオセーフティ委員会によって承認された設備の整ったラボを持っているバイオセーフティレベル2(BSL-2)要件に厳密に従うことによって行われました。マウスフットパッドの擦りやウ...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. 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ここで説明するフットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を調べるのに有用である。さらに、このin vivoモデルは、PNSからCNSへのαヘルペスウイルスの複製および拡散の運動学を確立するために使用される。これは、深い真皮掻き傷13に依存する腹面皮膚接種モデル、またはCNS,14、15、16,<sup class="...

本研究では、PNSからCNSへのウイルスの複製と拡散および関連する神経炎症反応を調査するためのフットパッド接種モデルについて説明する。フットパッド接種モデルは,、ニューロン1、2、32におけるαヘルペスウイルス感染を研究するために集中的1に使用されている。3このモデルの主な目的は、神経刺激性ウイルスがCNSに到達する前にPNSを通って最大距離を移動できるようにすることです。ここでは、このモデルは、疑似狂犬病ウイルス(PRV)に感染したマウスにおける特定の神経障害(神経障害性かゆみ)の発症における新たな洞察を得るために使用される。
PRVは、いくつかのよく知られた病原体(すなわち、単純ヘルペス1型および2型[HSV1およびHSV2]および水痘帯状疱疹ウイルス[VZV])に関連するアルファヘルペスウイルスであり、それぞれ4の冷たいびらん、性器病変、および水疱瘡を引き起こす。これらのウイルスは、すべてのパントトロピックと特定の組織タイプの親和性を示すことなく、多くの異なる細胞型に感染することができます.しかし、それらはすべて、宿主種のPNS(時にはCNS)に侵入することによって特徴的な神経刺激性を示す。自然宿主は豚であるが、PRVはほとんどの哺乳動物に感染する可能性がある。これらの非自然な宿主では、PRVはPNSに感染し、「狂ったかゆみ」と呼ばれる重篤な掻痒を誘発し、その後に急性期死亡55、66が続く。PRV感染の臨床結果および病因における神経免疫応答の役割は十分に理解されていない。
フットパッド接種モデルは、PRVがフットパッドの表皮細胞に感染を開始することを可能にする。その後、感染は表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維と交感神経線維に広がる。この感染は、約60時間以内に神経坐骨神経を介してDRGに移動するウイルス粒子によって広がる。感染は脊髄を通って広がり、動物がモリバンドになると最終的に後脳に達する(感染後82時間)。この時間枠の間に、組織サンプルはウイルス複製および免疫応答のマーカーについて収集、処理、および分析することができる。例えば、組織学的検査とウイルス負荷の定量は、PRV病原性における臨床的、ウイルス学的、および神経炎症性プロセスの開始と開発との間の相関関係を確立するために、異なる組織で行うことができる。
フットパッド接種モデルを用いて、マウスにおけるPRV誘発性掻痒の細胞および分子機構を調べることができます。さらに、このモデルは、ヘルペスウイルス感染時のウイルス誘発性神経炎症の開始および発症に関する新たな洞察を提供することができる。αヘルペスウイルス誘発性神経障害の根底にあるプロセスをよりよく理解することは、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。例えば、このモデルは、ヘルペス後病変(例えば、帯状疱疹、帯状疱疹)を有する患者における神経因性かゆみのメカニズムを調べ、対応するヒト疾患に対するマウスの新規治療標的を試験するのに有用である。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

このプロトコルは、マウスにおけるαヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を研究するために使用されるフットパッド接種モデルを記述する。αヘルペスウイルスは末梢神経系(PNS)の主な侵略者であるため、このモデルは、ウイルス複製の運動、PNSからCNSへの広がり、および関連する神経炎症反応を特徴付けるために適している。フットパッド接種モデルにより、ウイルス粒子は、フットパッド表皮の一次感染部位から、表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維および交感神経線維に広がる。感染は坐骨神経を介して後頭根神経節(DRG)に広がり、最終的には脊髄を介して脳に広がる。ここでは、マウスフットパッドに、シュードラビウイルス(PRV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)および水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)と密接に関連するアルファヘルペスウイルスを接種する。このモデルは、PRV感染がフットパッドおよびDRGにおける好中球浸潤を特徴とする重度の炎症を誘発することを示す。高濃度の炎症性サイトカインは、ELISAによってホモジナイズ組織で続いて検出される。また、DRGにおけるPRV遺伝子とタンパク質発現(qPCRおよびIF染色による)と炎症性サイトカインの産生との間には強い相関関係が認められる。したがって、フットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス誘導神経障害の基礎となるプロセスをよりよく理解し、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。さらに、このモデルは、多発性硬化症およびPNSに関連するウイルス誘発損傷などの末梢神経障害に関する研究を導くことができる。最終的には、医薬品開発のための費用対効果の高いインビボツールとして役立ちます。

マウスフットパッド接種モデルは、インビボにおけるαヘルペスウイルス感染の免疫病原性の特徴付け、接種されたフットパッドから神経系への感染の複製および広がりおよび特定の神経炎症反応の誘導を可能にする。
本研究では、まずマウス後方のフットパッドをブラドし、PRV(PRV-Becker)の有害な株で、模擬接種または接種領域のいずれかを接種した。摩耗の部位は、コ...

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Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

フットパッド接種モデルは、生体内でウイルス誘発性神経炎症反応を特徴付けるための貴重なツールです。特に、末梢神経系において開始されたウイルス動態および関連する免疫病理学的プロセスの明確な評価を提供する。

ウイルス誘導神経炎症反応を研究するマウスフットパッド接種モデル

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

このプロトコルは、ウイルス感染時のマウス末梢神経系における神経炎症反応の開始および発達の研究を可能にする。このモデルでは、感染症は周辺から末梢および中枢神経系までより大きな距離を移動し、神経炎症反応の運動学の最大評価を可能にする。5~7週齢の麻酔付きC57BL/6マウスを手術パッドの上の立場に置いた後、ペダル反射への応答の欠如を確認する。そして、100〜180グリットエメリーボードを使用して、ヒールとボードの約20パスでヒールとウォーキングパッドの間の1つの後ろ足パッドのグラブロウススキンを優しくブラドします。その後、細かい鉗子を使用して、摩耗によって切り離された角質層をゆっくりと剥がし、地層のバサレを露出させる。穏やかな混合の後、局所的に、アトワードフットパッドにウイルス接種の適切なチターの20マイクロリットルを適用する。コントロール動物の吸い込んだフットパッドでのみ、培地で模擬接種を並行して行います。各アプリケーションの後、10分ごとにウイルスの吸着を容易にするために針のシャフトでフットパッドを10回軽くこすり、30分間します。ブラッド付きフットパッドを乾燥させると、マウスは胸骨の不順までモニタリングして回復してから、動物を個々のケージに入れて臨床後処理およびサンプリングを行う。適切な実験時点で、ウイルスに曝された臓器を収集します, 心臓を含みます, 肺, 脾臓, 膵臓, 肝臓, 腎臓, 氷上の個々の 1.5 ミリリットルマイクロチューブに.その後、ヒールとウォーキングパッドの間の摩耗したフットパッドを収穫し、サンプルを氷の上の個々の1.5ミリリットルマイクロチューブに入れます。次に、マウスを起こしやすい位置に置き、70%エタノールで毛皮を濡らします。椎骨柱を露出するには、骨盤の領域に小さな切開を行い、後肢から頭部に向かって皮膚を剥ぎ取る。前肢と後肢を取り除くためには、はさみを使用して両側の脊柱と平行に切断し、両側の脊柱に近い。そして、頭蓋骨の基部の頭を取り除きます。はさみを使用して、頭蓋のマグナムから前頭骨まで頭蓋骨を開きます。そして、頭蓋骨を横方向に引っ張るために鉗子を使用してください。その後、鉗子を使用して脳を優しくすくい取り、脳を氷の上の1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れる。湾曲したはさみを使用して、筋肉、脂肪、軟部組織の脊柱をきれいにし、尾を取り除きます。その後、無傷の脊柱を氷の上の無菌氷冷PBSの15ミリリットルチューブに3時間以下に入れます。解剖後、脊髄を組織培養皿に移し、残りの軟部組織を除去する。カミソリの刃を使用して、S2、L1、およびT1椎骨の脊柱を3回横切ります。滅菌氷冷PBSを含む個々の15ミリメートルの皿に作品を転送します。後で解析するために、セグメントの原点を追跡し、マーキングします。次に、鉗子を使用して1つのセグメント背側を固定し、カミソリの刃を使用して、正中線を通る単一の縦方向のカットダウンを行い、列を2つの等しい半分に分割します。背骨の左右を区別できるように、新鮮な無菌の氷冷PBSを含む新しいペトリ皿に両方の半分を置きます。解剖顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して、脊椎柱の各半分から小道部の脊髄をそっと剥がし、尾骨方向に剥がします。その後、500マイクロリットルの無菌氷冷PBSを含む個々の1.5ミリリットルマイクロチューブに両方の脊髄半分を氷の上に置きます。背骨根神経節を露出させるために、脊柱の片側からもう一方の側に髄膜をそっと取り除く。そして、露出した白い脊髄神経を脊柱から引き出します。円形の透明な背根神経節を脊椎セグメントから氷冷PBSの15ミリメートルペトリ皿に収穫します。そして、ちょうど実証したように、イプシラショナルと対側の後側の根神経節を収集します。ちょうど実証したように、他の2つの脊柱セグメントから脊髄神経および後根神経節を収穫した後、遠心分離機組織のすべての管を高速で。その後、上清を吸引し、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズし、均質化するまでマイナス80°Cで保存します。組織均質化のために、各サンプルの100ミリグラムを計量する前に氷上の凍結組織のチューブを解凍します。滅菌ビーズと500マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイバッファーを含む2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移管。次に、ホモジナイザーの室温で2分間毎秒20サイクル、続いて1分間の待ち時間、さらに2分間毎秒20サイクルで組織を破壊する。均質化の第2ラウンド後、各上清の500マイクロリットルを新しい適切にラベル付けされたチューブに移す前に、組織を高速で遠心分離します。ダウンストリーム分析までマイナス20°Cで保管してください。摩耗の部位は、コントロールフットパッドに表示されます。そして、癒しのプロセスの一環として、摩耗部位で地殻が形成されるのが典型的です。対照的に、偽狂犬病を接種したマウスは、腫脹および発赤を特徴とする人道的エンドポイントにおけるフットパッドの重篤な炎症を示す。接種されたフットパッドおよび背部根神経節の病理組織学的検査は、偽狂犬病感染した足の切片内の表皮壊死および重度の真皮炎症を明らかにする。好中球の浸潤は、DRG切片に感染した偽狂犬病でも観察される。G-CSFタンパク質発現の有意な増加は、感染後7時間および82時間の両方のコントロールと比較して、偽狂病感染マウスのフットパッドおよび背部根神経節で測定される。有意なG-CSFレベルは、対照と比較して、マウスに感染した偽狂犬病の脊髄、脳、心臓、および肝臓組織における感染後82時間で観察される。さらに、感染後24時間から始まる偽狂病感染マウスの全ての試験組織において、IL-6の有意なレベルが検出される。モリバンド状態では、フットパッド、背根神経節、脊髄、および脳に偽狂病が検出された。偽狂犬病感染マウスにおける後根神経節のニューロンにおけるプロデラトラビクス糖タンパク質gBの高い細胞質発現を用いた。感染を確実にするためには、カラム内のウイルスの液滴が、手をつすれたフットパッドから落ちないようにすることが重要です。この動物モデルは、ウイルス誘導末梢神経障害を予防するために抗炎症薬および抗ウイルス薬の有効性を試験するプラットフォームを提供し得る。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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の実験的マウスモデルにおけるプッシー接種とサンプル採取のためのプロトコルカンジダ膣炎

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

回復時間の増加とリミテッド炎症反応における迷走神経刺激メカニズムを研究するためにLPSの管理を減少

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...