Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Charles laboratorier for deres utmerkede tekniske støtte som utfører histopatologianalyser. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til en protokoll (nummer 2083-16 og 2083-19) gjennomgått og godkjent av Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Princeton University. Dette arbeidet ble gjort ved å følge kravene til biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2), som vi har et fullt utstyrt laboratorium godkjent av Princeton University biosikkerhetskomité. Prosedyrene inkludert mus footpad slitasje, viral inokulasjon, musedisseksjon, og vev samling ble utført i en biologisk sikkerhetsskap (BSC) i Princeton Univers...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia.">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aujeszky's+disease+(pseudorabies)+in+pigs.">Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs.</a> Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).</li><li>Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue:+Application+in+the+APP/PS1+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing.">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).</li><li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models.">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li><li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1.">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li><li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons.">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).</li><li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li><li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Fotputeinokulasjonsmodellen som er beskrevet her, er nyttig for å undersøke initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon. Videre brukes denne in vivo-modellen til å etablere kinetikk av replikering og spredning av alfaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er et alternativ til andre inokulasjonsmodeller, for eksempel flankehudinokulasjonsmodellen, som er avhengig av dyp dermal riper13, eller intrakraniell rute, som direkte introduserer viruset i CNS<sup c...

Denne studien beskriver en fotputeinokulasjonsmodell for å undersøke replikering og spredning av virus fra PNS til CNS og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen har blitt intensivt brukt til å studere alfaherpesvirusinfeksjon i nevroner1,,2,3. Hovedmålet med denne modellen er å tillate nevrotropiske virus å reise en maksimal avstand gjennom PNS før du når CNS. Her brukes denne modellen til å få ny innsikt i utviklingen av en bestemt nevropati (nevropatisk kløe) hos mus infisert med pseudorabies virus (PRV).
PRV er et alfaherpesvirus relatert til flere kjente patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsaker forkjølelsessår, genital lesjoner og kylling pox, henholdsvis4. Disse virusene er alle pantropiske og i stand til å infisere mange forskjellige celletyper uten å vise affinitet for en bestemt vevstype. Imidlertid viser de alle en karakteristisk nevrotropisme ved å invadere PNS (og av og til CNS) av vertsarter. Den naturlige verten er grisen, men PRV kan infisere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige vertene smitter PRV PNS og induserer en alvorlig kløe kalt "mad itch", etterfulgt av perakutt død5,6. Rollen til nevroimmun respons i det kliniske utfallet og patogenesen av PRV-infeksjon har blitt dårlig forstått.
Fotputeinokulasjonsmodellen gjør det mulig for PRV å starte infeksjon i fotputens epidermale celler. Deretter sprer infeksjonen seg inn i sensoriske og sympatiske nervefibre som innerverer epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg av viruspartikler som beveger seg via isjiasnerven til DRG innen ca. 60 timer. Infeksjonen sprer seg gjennom ryggmargen, og når til slutt bakhjernen når dyr blir moribund (82 t etter infeksjon). I løpet av dette tidsvinduet kan vevsprøver samles inn, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponsen. For eksempel kan histologisk undersøkelse og virusbelastning kvantifisering utføres i forskjellige vev for å etablere sammenhenger mellom initiering og utvikling av kliniske, virologiske og nevroinflammatoriske prosesser i PRV patogenese.
Ved hjelp av fotputeinkulasjonsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismene til PRV-indusert kløe hos mus undersøkes. Videre kan denne modellen gi ny innsikt i initiering og utvikling av virusinflammation under herpesvirusinfeksjoner. En bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne modellen nyttig å undersøke mekanismene for nevropatisk kløe hos pasienter med post-herpetic lesjoner (f.eks herpes zoster, helvetesild) og teste nye terapeutiske mål hos mus for tilsvarende menneskelige sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Denne protokollen beskriver en fotputeinokulasjonsmodell som brukes til å studere initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon hos mus. Som alfaherpesvirus er hovedinntrengere i det perifere nervesystemet (PNS), er denne modellen egnet til å karakterisere kinetikkene til viral replikering, spredning fra PNS til CNS, og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen gjør at viruspartikler kan spre seg fra et primært infeksjonssted i fotputeeeepidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre som innervate epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg via isjiasnerven til dorsale rotgangene (DRG) og til slutt gjennom ryggmargen til hjernen. Her er en musefotpute inokulert med pseudorabies virus (PRV), et alfaherpesvirus nært relatert til herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne modellen viser at PRV-infeksjon induserer alvorlig betennelse, preget av nøytrofil infiltrasjon i fotblokken og DRG. Høye konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner oppdages senere i homogenisert vev av ELISA. I tillegg observeres en sterk korrelasjon mellom PRV-gen- og proteinuttrykk (via qPCR og IF-farging) i DRG og produksjon av proinflammatoriske cytokiner. Derfor gir fotputeinokulasjonsmodellen en bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier og kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. I tillegg kan modellen veilede forskning på perifere nevropatier, for eksempel multippel sklerose og tilhørende virusindusert skade på PNS. Til syvende og sist kan det tjene som et kostnadseffektivt in vivo-verktøy for narkotikautvikling.

Mus footpad inokulasjon modellen gjør det mulig for karakterisering av immunopathogenese av alfaherpesvirus infeksjon in vivo, inkludert replikering og spredning av infeksjonen fra inoculated footpad til nervesystemet og induksjon av spesifikke nevroinflammatoriske reaksjoner.
I denne studien, vi først slipt musen bak footpad og enten mock-inoculated eller inoculated den slipte regionen med en virulent stamme av PRV (PRV-Becker). Stedet for slitasje var synlig i kontrollfoten. En skorpe ble ...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Fotputeinokulasjonsmodellen er et verdifullt verktøy for å karakterisere virusinduserte nevroinflammatoriske responser in vivo. Spesielt gir det en klar vurdering av viral kinetikk og tilhørende immunopathological prosesser initiert i det perifere nervesystemet.

Mouse Footpad Inokulasjon Modell for å studere viral-indusert neuroinflammatoriske responser

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Denne protokollen tillater studiet av initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser i musen perifert nervesystem under en virusinfeksjon. Med denne modellen reiser infeksjoner en større avstand fra periferien til perifert og sentralnervesystemet, slik at en maksimal vurdering av kinetikken til nevroinflammatoriske respons. Etter å ha plassert den fem til syv uker gamle bedøvet C57BL/6 musen i liggende stilling på en kirurgisk pute, bekrefter mangel på respons på pedalrefleks.Og bruk en 100 til 180 grit emery bord, for å forsiktig slipe den glabrous huden på en bakfotplate mellom hælen og gåputer med ca 20 passeringer av brettet. Bruk deretter fine tang til å sakte skrelle av stratum corneum løsrevet av slitasjen for å avsløre stratum basale. Etter mild blanding, lokalt bruke 20 mikroliter av riktig titer av virus inoculum på slipt fottastatur.Utfør mock inokulasjoner med medium bare i slipte fotputer av kontrolldyr parallelt. Etter hvert program, forsiktig gni fotplaten 10 ganger med skaftet på en nål for å lette adsorpsjon av viruset hvert 10 minutt i 30 minutter. Når den slipte fotplaten tørkes, la musene komme seg med overvåking til sternal recumbency før du plasserer dyrene i individuelle bur for klinisk oppfølging og prøvetaking.På de riktige eksperimentelle tidspunktene, samle viruset eksponert organer, inkludert hjertet, lungene, milten, bukspyttkjertel, lever, nyrer, og blære i individuelle 1,5 milliliter mikrorør på is. Deretter høster du de slipte fotputene mellom hælen og gåputene og plasserer prøvene i individuelle 1,5 milliliter mikrorør på is. Deretter plasserer du musen i utsatt stilling og våt pelsen med 70% etanol.For å avsløre vertebralkolonnen, gjør et lite snitt i bekkenets område og strippe huden fra baklemmer mot hodet. For å fjerne for- og baklemmer, bruk saks til å kutte parallelt med og nær ryggsøylen på begge sider. Og fjern hodet ved foten av skallen.Bruk saksen til å åpne skallen fra foramen magnum til frontalbenet. Og bruk tang til å trekke åpne skallen i sideretning. Bruk deretter tangen til å forsiktig øse ut hjernen og plassere hjernen i et 1,5 milliliter mikrorør på is.Bruk buet saks for å rense ryggraden i muskel, fett og bløtvev, og fjern halen. Plasser deretter den intakte ryggsøylen i et 15 milliliter rør med steriliskald PBS på is i ikke mer enn tre timer. Etter disseksjonen, overfør ryggmargen til en vevskulturrett for å tillate fjerning av gjenværende bløtvev.Bruk et barberblad til å lage tre tverrgående kutt gjennom ryggsøylen på S2, L1 og T1 ryggvirvler. Overfør bitene til individuelle 15 millimeter retter som inneholder sterile iskalde PBS. Holde styr og markere opprinnelsen til segmentene for senere analyse.Deretter bruker du tang til å feste ett segment dorsal side opp og bruke et barberblad for å gjøre en enkelt, langsgående kuttet ned gjennom midtlinjen for å dele kolonnen i to like halvdeler. Legg begge halvdelene i en ny petriskål som inneholder fersk, steriliskulde PBS i originalorientering for å kunne skille mellom venstre og høyre side av ryggraden. Under et dissekerende mikroskop, bruk fine tang til å forsiktig skrelle ryggmargen ut av hver halvdel av vertebralkolonnen i en rostral til caudal retning.Plasser deretter begge ryggmargshalvdelene i individuelle 1,5 milliliter mikrorør som inneholder 500 mikroliter sterile iskalde PBS på is. For å avsløre den ryggemessige rotganglionen, fjern forsiktig meningene fra den ene siden av ryggsøylen til den andre. Og trekk den eksponerte hvite ryggnerven ut av ryggraden.Høst den runde, gjennomsiktige ryggrotganglionen fra ryggraden segmentet inn i en 15 millimeter Petriskål av iskald PBS. Og samle ipsilateral og kontralateral dorsal rot ganglion som nettopp demonstrert. Etter høsting av spinalnerven og ryggrotganglion fra de to andre spinalkolonnesegmentene som nettopp demonstrert, sentrifugerer alle rørene av vev i høy hastighet.Deretter aspirerer supernativa og flash-fryse prøvene i flytende nitrogen, og lagre på minus 80 grader Celsius til homogenisering. For vev homogenisering, tine rørene av frosset vev på is før veiing ut 100 milligram av hver prøve. Overfør til en to milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder sterile perler og 500 mikroliter av radioimmunoprecipitation analyse buffer.Deretter forstyrrer vevet ved romtemperatur på en homogenisator ved 20 sykluser per sekund i to minutter, etterfulgt av en ett minutt ventetid, og 20 sykluser per sekund i ytterligere to minutter. Etter den andre runden med homogenisering sentrifuger vevet i høy hastighet før du overfører 500 mikroliter av hver supernatant til et nytt passende merket rør. Oppbevares ved minus 20 grader Celsius til nedstrøms analyse.Slitasjestedet er synlig i kontrollfotplaten. Og det er typisk for en skorpe å danne seg på skrubbsstedet som en del av helbredelsesprosessen. I motsetning viser mus inokulert med pseudorabies en alvorlig betennelse i fotplaten ved humant endepunkt som er preget av hevelse og rødhet.Histopatologisk undersøkelse av den inokulerte fotplaten og dorsal rotganglion avslører epidermal nekrose og alvorlig dermal betennelse i pseudorabies infiserte fotseksjoner. Infiltrasjon av nøytrofiler observeres også i pseudorabbier infiserte DRG-seksjoner. En betydelig økning i G-CSF proteinuttrykk måles i fotplaten og dorsal rot ganglion av pseudorabies infiserte mus sammenlignet med kontroller på både syv og 82 timer etter infeksjon.Signifikante G-CSF nivåer er også observert ved 82-timers etterinfeksjon i ryggmargen, hjernen, hjertet, og levervev av pseudorabies infiserte mus sammenlignet med kontroller. Videre oppdages signifikante nivåer av IL-6 i alle testede vev av pseudorabies infiserte mus som starter ved 24-timers etterinfeksjon. I en moribund tilstand ble pseudorabies oppdaget i fotplaten, ryggrotganglion, ryggmarg og hjerne.Med det høye cytoplasmatiske uttrykket av psuedorabies glykoprotein gB i nevronene til dorsal rotganglion i pseudorabies infiserte mus. For å sikre en vellykket infeksjon er det viktig at dråpe virus i en kolonne ikke faller fra den slipte fotplaten. Denne dyremodellen kan tjene plattform for å teste effekten av antiinflammatoriske og antivirale legemidler for å forhindre viral-induserte perifere nevropatier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoller for Vaginal Inokulasjon og Prøvetaking i Experimental mus modell av Candida Vaginitt

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Undersøke rolle Nasofaryngeal-assosiert lymforetikulært vev (NALT) i Mus Responses til Vaksiner

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanisert mus modell for å studere bakterieinfeksjoner Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantasjon av Tail Skin Study Cell Responses Allogen CD4 T i Mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Økt utvinning tid og Redusert LPS Administration å studere vagus nerve stimulering Mekanismer i begrensede inflammatoriske responser

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsiktig overvåking av inflammatoriske responser

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar i Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skreddersy in vivo cytotoksisitet analyser for å studere Immunodominance i tumor spesifikke CD8+ T celle svar

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...