Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Författarna erkänner Charles River laboratorier för deras utmärkta tekniska stöd utför histopathology analyser. Detta arbete finansierades av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 och RO1 NS060699). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med ett protokoll (nummer 2083-16 och 2083-19) som granskades och godkändes av Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Princeton University. Detta arbete utfördes genom att strikt följa kraven på biosäkerhetsnivå-2 (BSL-2), till vilka vi har ett fullt utrustat labb godkänt av Princeton University biosäkerhetskommitté. Förfarandena inklusive mus fotpad nötning, viral inokulering, mus dissekering och vävnad insamling utfördes i en biologisk säkerhet skåp (...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia.">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aujeszky's+disease+(pseudorabies)+in+pigs.">Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs.</a> Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).</li><li>Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue:+Application+in+the+APP/PS1+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing.">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).</li><li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models.">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li><li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1.">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li><li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons.">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).</li><li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li><li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Footpad inokulering modell som beskrivs här är användbart för att undersöka inledandet och utvecklingen av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion. Dessutom används denna in vivo-modell för att fastställa kinetiken för replikering och spridning av alphaherpesvirus från PNS till CNS. Detta är en alternativ till andra inokulering modeller, såsom flanken huden inympning modell, som bygger på djup dermal repor13, eller intrakraniell väg, som direkt introducerar viruset i ...

Denna studie beskriver en footpad inokulering modell för att undersöka replikering och spridning av virus från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatory svar. Footpad inokulering modellen har intensivt använts för att studera alphaherpesvirus infektion i nervceller1,2,3. Huvudsyftet med denna modell är att tillåta neurotropa virus att resa ett maximalt avstånd genom PNS innan de når CNS. Här används denna modell för att få nya insikter i utvecklingen av en viss neuropati (neuropatisk klåda) hos möss infekterade med pseudorabiesvirus (PRV).
PRV är ett alfaherpesvirus relaterat till flera välkända patogener (dvs. herpes simplex typ 1 och 2 [HSV1 och HSV2] och varicella-zoster virus [VZV]), som orsakar munsår, genitala lesioner, och vattkoppor,respektive 4. Dessa virus är alla pantropiska och kunna infektera många olika celltyper utan att visa affinitet för en viss vävnadstyp. De uppvisar dock alla en karakteristisk neurotropism genom att invadera PNS (och ibland CNS) av värdarter. Den naturliga värden är grisen, men PRV kan infektera de flesta däggdjur. I dessa icke-naturliga värdar infekterar PRV PNS och inducerar en allvarlig klåda som kallas "galna kliar", följt av perakut död5,6. Rollen av neuroimmune svar i det kliniska resultatet och patogenes av PRV infektion har varit dåligt förstått.
Footpad inokulering modellen tillåter PRV att initiera infektion i epidermala cellerna i fotplattan. Sedan sprider infektionen till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innerverar epidermis, svettkörtlar och dermis. Infektionen sprids genom viruspartiklar som rör sig via ischiasnerven till DRG inom cirka 60 timmar. Infektionen sprider sig genom ryggmärgen, slutligen når hindbrain när djur blir döende (82 h efter infektion). Under denna tidsperiod kan vävnadsprover samlas in, bearbetas och analyseras för virusreplikation och markörer för immunsvaret. Till exempel kan histologisk undersökning och viral belastning kvantifiering utföras i olika vävnader för att fastställa korrelationer mellan inledande och utveckling av kliniska, virological och neuroinflammatoriska processer i PRV patogenes.
Med hjälp av footpad inokulering modell, cellulära och molekylära mekanismer prv-inducerad klåda hos möss kan undersökas. Dessutom kan denna modell ge ny insikt i initiering och utveckling av virus-inducerad neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Till exempel är denna modell användbar för att undersöka mekanismerna för neuropatisk klåda hos patienter med postherpetiska lesioner (t.ex. herpes zoster, bältros) och testa nya terapeutiska mål hos möss för motsvarande mänskliga sjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Detta protokoll beskriver en footpad inokulering modell som används för att studera inledande och utveckling av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion hos möss. Eftersom alphaherpesviruses är huvudsakliga inkräktare av det perifera nervsystemet (PNS), är denna modell lämplig att karakterisera kinetiken av viral replikering, dess spridning från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatoriska svar. Footpad inympning modellen tillåter viruspartiklar att sprida sig från en primär infektion plats i footpad epidermis till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innervera epidermis, svettkörtlar, och dermis. Infektionen sprider sig via ischiasnerven till dorsala rot ganglierna (DRG) och i slutändan genom ryggmärgen till hjärnan. Här är en mus fotplatta inokuleras med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nära besläktad med herpes simplex virus (HSV) och varicella-zoster virus (VZV). Denna modell visar att PRV-infektion inducerar svår inflammation, som kännetecknas av neutrofilinfiltration i fotplattan och DRG. Höga koncentrationer av inflammatoriska cytokiner upptäcks därefter i homogeniserade vävnader av ELISA. Dessutom observeras en stark korrelation mellan PRV gen och protein uttryck (via qPCR och OM färgning) i DRG och produktion av proinflammatoriska cytokiner. Därför ger footpad inympning modellen en bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier och kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Dessutom kan modellen vägleda forskning om perifera neuropatier, såsom multipel skleros och tillhörande viral-inducerad skada på PNS. I slutändan, Det kan fungera som ett kostnadseffektivt in vivo verktyg för läkemedelsutveckling.

Musen footpad inokulering modell möjliggör karakterisering av immunopathogenesis av alphaherpesvirus infektion in vivo, inklusive replikering och spridning av infektionen från inokulerade footpad till nervsystemet och induktion av specifika neuroinflammatoriska svar.
I denna studie avökade vi först musen hind footpad och antingen mock-inokulerade eller inokulerade den avlånga regionen med en virulent stam av PRV (PRV-Becker). Platsen för nötning var synlig i kontroll fotplattan. En sko...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Footpad inokulering modellen är ett värdefullt verktyg för att karakterisera viral-inducerad neuroinflammatoriska svar in vivo. I synnerhet ger det en tydlig bedömning av viral kinetik och tillhörande immunopatologiska processer som inletts i det perifera nervsystemet.

Mus fotpad inokulering modell för att studera viral-inducerad Neuroinflammatoriska svar

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Detta protokoll gör det möjligt att studera initiering och utveckling av neuroinflammatory svar i musen perifera nervsystemet under en viral infektion. Med denna modell, infektioner resa ett större avstånd från periferin till perifera och centrala nervsystemet, vilket möjliggör en maximal bedömning av kinetiken i neuroinflammatory svaret. Efter att ha placerat fem till sju veckor gamla sövda C57BL/6 mus i ryggläge på en kirurgisk pad, bekräfta en brist på svar på pedal reflex.Och använd en 100 till 180 grit emery ombord, att försiktigt abrade glabrous huden på en bakfotpad mellan hälen och gång kuddar med ca 20 passerar av brädet. Använd sedan fina tyckor för att långsamt skala bort hornlagret lossnat av nötning för att exponera stratum basale. Efter skonsam blandning applicerar lokalt 20 mikroliter av lämplig titer av virusinokulat på den förslitna fotsatsen.Utför mocka inympningar med medium endast i de försade fotpadarna av kontrolldjur parallellt. Efter varje applicering, försiktigt gnugga fotplattan 10 gånger med axeln av en nål för att underlätta adsorption av viruset var 10 minuter i 30 minuter. När den abraderade fotplattan torkas, låt mössen återhämta sig med övervakning tills sternal recumbency innan djuren placeras i enskilda burar för klinisk uppföljning och provtagning.Vid lämpliga experimentella tidpunkter, samla in viruset exponerade organ, inklusive hjärta, lungor, mjälte, bukspottkörtel, lever, njurar, och urinblåsa i enskilda 1,5 milliliter mikrorör på is. Sedan skörda de förslitna fotplattorna mellan hälen och gångkuddarna och placera proverna i enskilda 1,5 milliliter mikrorör på is. Därefter placera musen i utsatt läge och väta pälsen med 70%etanol.För att exponera kotpelaren, gör ett litet snitt i regionen av bäckenet och remsor huden från bakbenen mot huvudet. För att ta bort fram- och bakbenen, använd sax för att skära parallellt med och nära ryggraden på båda sidor. Och ta bort huvudet vid skallbasen.Använd saxen för att öppna skallen från foramen magnum till frontalbenet. Och använda forceps för att dra upp skallen i en lateral riktning. Använd sedan tärnarna för att försiktigt ösa ut hjärnan och placera hjärnan i en 1,5 milliliter mikrorör på is.Använd böjd sax för att rengöra ryggraden av muskel, fett och mjuk vävnad, och ta bort svansen. Placera sedan den intakta ryggraden i en 15 milliliter tub av steril iskall PBS på is i högst tre timmar. Efter dissektionen, överför ryggmärgen till en vävnadskulturskål för att tillåta avlägsnande av eventuell kvarvarande mjukvävnad.Använd ett rakblad för att göra tre tvärgående skär genom ryggraden på S2, L1, och T1 kotor. Överför bitarna till individuella 15 millimeters rätter som innehåller steril iskall PBS. Att hålla ordning och markera segmentens ursprung för senare analys.Därefter använder du tåtan för att säkra ett segment dorsala sidan upp och använda ett rakblad för att göra en enda, längsgående skära ner genom mittlinjen för att dela kolumnen i två lika halvor. Placera båda halvorna i en ny petriskål som innehåller färsk, steril iskall PBS i den ursprungliga orienteringen för att kunna skilja ut vänster och höger sida av ryggraden. Under en dissekera mikroskop, använd fina tångar för att försiktigt skala ryggmärgen ur varje halv av kotpelaren i en rostral till caudal riktning.Placera sedan båda ryggmärgshalvorna i enskilda 1,5 milliliter mikrorör som innehåller 500 mikroliter sterila iskalla PBS på is. För att exponera den dorsala roten ganglion, försiktigt bort hjärnhinnorna från ena sidan av ryggraden till den andra. Och dra ut den exponerade vita ryggradsnerven ur ryggraden.Skörda den runda, transparenta ryggrots ganglion från ryggradssegmentet till en 15 millimeter petriskål av iskall PBS. Och samla in den ipsilaterala och kontralaterala dorsala roten ganglion som just visat. Efter skörd spinal nerv och dorsala roten ganglion från de andra två spinal kolumn segment som just visat, centrifug alla rör av vävnad med hög hastighet.Sedan aspirera supernatanterna och flash-frysa proverna i flytande kväve, och förvara på minus 80 grader Celsius tills homogenisering. För vävnadshomogenisering tina rören av frusen vävnad på is innan man väger ut 100 milligram av varje prov. Överföring till ett två milliliter mikrocentrifugrör som innehåller sterila pärlor och 500 mikroliter av radioimmunoprecipitation assay buffert.Därefter störa vävnaderna vid rumstemperatur på en homogenisator vid 20 cykler per sekund i två minuter, följt av en minuts väntetid, och 20 cykler per sekund i ytterligare två minuter. Efter den andra omgången av homogenisering, centrifug vävnaderna med hög hastighet innan du överför 500 mikroliter av varje supernatant i en ny lämpligt märkt rör. Förvaras på minus 20 grader Celsius tills analys nedströms.Platsen för nötning syns i styrfotsatsen. Och det är typiskt för en skorpa att bilda på nötningsplatsen som en del av läkningsprocessen. Däremot möss inokulerade med pseudorabies, visar en allvarlig inflammation i footpad vid humana endpoint som kännetecknas av svullnad och rodnad.Histopatologisk undersökning av inokulerade footpad och dorsala roten ganglion avslöjar epidermal nekros och allvarliga dermal inflammation inom de pseudorabies infekterade fot avsnitten. Infiltration av neutrofiler observeras också i pseudorabies infekterade DRG sektioner. En signifikant ökning av G-CSF protein uttryck mäts i footpad och dorsala rot ganglion av pseudorabies infekterade möss jämfört med kontroller vid både sju och 82-timmar efter infektion.Betydande G-CSF nivåer observeras också vid 82-timmar post-infektion i ryggmärgen, hjärnan, hjärtat, och levern vävnader av pseudorabies infekterade möss jämfört med kontroller. Dessutom upptäcks betydande nivåer av IL-6 i alla testade vävnader av pseudorabies infekterade möss som börjar vid 24-timmars post-infektion. I en döende tillstånd upptäcktes pseudorabies i footpad, dorsala rot ganglion, ryggmärg och hjärnan.Med den höga cytoplasmatiska uttryck psuedorabies glykoprotein gB i nervcellerna i den dorsala roten ganglion i pseudorabies infekterade möss. För att säkerställa en lyckad infektion, det är viktigt att droppen av virus i en kolumn inte faller från den abraded footpad. Denna djurmodell kan tjäna plattform för att testa effekten av antiinflammatoriska och antivirala läkemedel i syfte att förhindra viral-inducerad perifera neuropatier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoll för vaginal Inokulation och Provtagning i den experimentella musmodell av Candida Vaginit

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Undersöka roll Nasofaryngeal-associerad lymfretikulärvävnad (NALT) i Mus Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniserad musmodell för att studera bakterieinfektioner Inriktning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Ökad Återhämtningstid och minskade LPS administration att studera vagusnerven stimulering mekanismer i begränsade inflammatoriska svar

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model för<em&gt; In vivo</em&gt; Långvarig övervakning av inflammatoriska reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skräddarsy in vivo cytotoxicitet assays att studera Immunodominans i Tumörspecifika CD8+ T cell svar

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...