Name: mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Yazarlar histopatoloji analizleri yürüten mükemmel teknik destek için Charles River laboratuvarları kabul. Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (RO1 NS033506 ve RO1 NS060699) tarafından finanse edilmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Tüm hayvan deneyleri Princeton Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilip onaylanan bir protokole (sayı 2083-16 ve 2083-19) uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışma, Princeton Üniversitesi biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmış tam donanımlı bir laboratuarımız olan biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) gerekliliklerini sıkı bir şekilde izleyerek yapılmıştır. Fare ayak takımı aşınması, viral aşılama, fare diseksiyonu ve doku toplama gibi işlemler P...

<ol>
	<li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation.">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li><li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad.">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li><li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia.">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aujeszky's+disease+(pseudorabies)+in+pigs.">Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs.</a> Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).</li><li>Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue:+Application+in+the+APP/PS1+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing.">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).</li><li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice.">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li><li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling.">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models.">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li><li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1.">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li><li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system.">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li><li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection.">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).</li><li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis:+a+clinical+and+electrophysiologic+study.">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li><li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons.">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).</li><li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li><li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro.">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), 49 (2017).</li><li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis.">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li></ol>

Burada açıklanan ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve gelişimini araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu in vivo modeli çoğaltma kinetik kurmak ve PNS CNS alfaherpesvirus yayılması nı kurmak için kullanılır. Bu diğer aşılama modelleri için bir alternatif, yan deri aşılama modeli gibi, hangi derin dermal çizilme dayanır13, veya intrakranial rota, doğrudan CNS içine virüs tanıttı<sup clas...

Bu çalışma, PNS'den CNS'ye ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlara kadar virüslerin replikasyonve yayılmasını araştırmak için bir footpad aşılama modelini açıklamaktadır. Ayak takımı aşılama modeli yoğun nöronlarda alfahiçvirüs enfeksiyonu çalışmak için kullanılmıştır1,2,3. Bu modelin temel amacı nörotropik virüsler CNS ulaşmadan önce PNS ile maksimal bir mesafe seyahat etmek için izin vermektir. Burada, bu model psödorabis virüsü (PRV) ile enfekte farelerde belirli bir nöropati (nöropatik kaşıntı) gelişiminde yeni anlayışlar elde etmek için kullanılır.
PRV birkaç iyi bilinen patojenler ile ilgili bir alfaherpesvirus (yani, herpes simpleks tip 1 ve 2 [HSV1 ve HSV2] ve varisella-zoster virüsü [VZV]), hangi soğuk yaralar, genital lezyonlar ve su çiçeği neden, sırasıyla4. Bu virüslerin hepsi pantropik ve belirli bir doku tipi için yakınlık göstermeden birçok farklı hücre tipleri enfekte edebiliyoruz. Ancak, hepsi ev sahibi türlerin PNS (ve bazen, CNS) işgal ederek karakteristik bir nörotropizm sergiler. Doğal konak domuz, ama PRV en memeliler bulaştırmak olabilir. Bu doğal olmayan konaklarda, PRV PNS enfekte ve şiddetli bir pruritus indükler "deli kaşıntı", perakut ölüm takip5,6. PRV enfeksiyonunun klinik sonucu ve patogenezinde nöroimmün yanıtın rolü tam olarak anlaşılamamıştır.
Ayak takımı aşılama modeli PRV footpad epidermal hücrelerde enfeksiyon başlatmak için izin verir. Daha sonra, enfeksiyon epidermis innerve duyusal ve sempatik sinir lifleri içine yayılır, ter bezleri, ve dermis. Enfeksiyon yaklaşık 60 saat içinde DRG siyatik sinir yoluyla hareket eden virüs parçacıkları tarafından yayılır. Enfeksiyon omurilik yoluyla yayılır, sonuçta hayvanlar moribund (82 h post-enfeksiyon) haline geldiğinde arka beyne ulaşan. Bu süre zarfında doku örnekleri toplanabilir, işlenebilir ve virüs replikasyonu ve immün yanıt ın belirteçleri için analiz edilebilir. Örneğin, PRV patogenezinde klinik, virolojik ve nöroinflamatuar süreçlerin başlatılması ve gelişimi arasında korelasyon lar kurmak için farklı dokularda histolojik inceleme ve viral yük nicelliği yapılabilir.
Ayak takımı aşılama modeli kullanılarak farelerde PRV'ye bağlı pruritusun hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırılabilir. Ayrıca, Bu model herpesvirus enfeksiyonları sırasında virüs kaynaklı nöroinflamasyon başlatılması ve gelişimi içine yeni bir fikir sağlayabilir. Alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılması yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Örneğin, bu model post-herpezik lezyonları olan hastalarda nöropatik kaşıntı mekanizmaları araştırmak için yararlıdır (örneğin, herpes zoster, zona) ve ilgili insan hastalıkları için farelerde yeni terapötik hedefleri test.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PRV gB</td>
			<td>Made by the lab</td>
			<td></td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-hold2 pap pen red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>2886909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)</td>
			<td>Revlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (5-7 weeks)</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td>
			<td>SH30088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved scissors stainless steel</td>
			<td>FST</td>
			<td>14095-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting media</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 2ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72692005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>154022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide needle 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades steel back</td>
			<td>Personna</td>
			<td>9412071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer (RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/plus microscopic slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 (goat anti-mouse)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/2000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse footpad inoculation model to study viral-induced neuroinflammatory responses

Bu protokol farelerde alfaherpesvirus enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi için kullanılan bir footpad aşılama modeli açıklar. Alfaherpesvirüsler periferik sinir sisteminin ana işgalciler ilerler gibi (PNS), Bu model viral çoğaltma kinetik karakterize etmek için uygundur, CNS PNS onun yayılması, ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlar. Ayak takımı aşılama modeli virüs parçacıkları nın ayak takımı epidermisindeki birincil enfeksiyon bölgesinden epidermisin, ter bezlerini ve dermisi innerve eden duyusal ve sempatik sinir liflerine yayılmasını sağlar. Enfeksiyon dorsal kök gangliyonu siyatik sinir yoluyla yayılır (DRG) ve sonuçta beyne omurilik yoluyla. Burada, bir fare footpad pseudorabies virüs (PRV), bir alfaherpesvirüs yakından herpes simpleks virüsü (HSV) ve varisella-zoster virüsü (VZV) ile ilgili aşılanır. Bu model PRV enfeksiyonu ciddi inflamasyon neden olduğunu göstermektedir, ayak ve DRG nötrofil infiltrasyon ile karakterize. Yüksek inflamatuar sitokin konsantrasyonları daha sonra ELISA tarafından homojendokularda saptanır. Buna ek olarak, DRG'de PRV geni ile protein ekspresyonu (qPCR ve IF boyama yoluyla) ile pro-inflamatuar sitokin üretimi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmektedir. Bu nedenle, ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar ve yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Buna ek olarak, model periferik nöropatiler üzerinde araştırma rehberlik edebilir, multipl skleroz ve PNS ilişkili viral kaynaklı hasar gibi. Sonuçta, uyuşturucu gelişimi için bir maliyet-etkin in vivo aracı olarak hizmet verebilir.

Fare ayak takımı aşılama modeli in vivo alfaherpesvirus enfeksiyonunun immünopatogenezinin karakterizasyonuna olanak sağlar, buna inolanmış ayak lıktan sinir sistemine enfeksiyonun replikasyonu ve yayılması ve spesifik nöroinflamatuar yanıtların indüksiyonu da dahil olmak üzere.
Bu çalışmada, ilk olarak fare arka ayak takımı aşılanmış ve ya mock-aşılanmış ya da PRV (PRV-Becker) öldürücü bir suşu ile aşılanmış aşılanmış. Aşınma yeri kontrol ayak takı...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses at JoVE.com

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Ayak takımı aşılama modeli in vivo viral kaynaklı nöroinflamatuar yanıtları karakterize etmek için değerli bir araçtır. Özellikle, viral kinetik ve ilgili immünopatolojik süreçlerin periferik sinir sisteminde başlatılan net bir değerlendirme sağlar.

Viral Kaynaklı Nöroinflamatuar Yanıtları İncelemek Için Fare Ayak Takımı Aşılama Modeli

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Bu protokol, viral bir enfeksiyon sırasında fare periferik sinir sisteminde nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi nin incelenmesine olanak sağlar. Bu model ile, enfeksiyonlar periferik ve merkezi sinir sistemine çevre daha büyük bir mesafe seyahat, nöroinflamatuar yanıt kinetik maksimal bir değerlendirme sağlayan. Beş ila yedi haftalık anestezik C57BL/6 fareyi cerrahi bir ped üzerinde supine pozisyonuna yerleştirdikten sonra, pedal refleksine yanıt eksikliğini doğrulayın.Ve 100-180 grit emery kurulu kullanın, yavaşça topuk ve tahta yaklaşık 20 geçer ile yürüyüş pedleri arasında bir arka ayak takımı glabrous deri aşındırmak için. Sonra yavaş yavaş stratum basale ortaya çıkarmak için aşınma ile ayrılmış stratum korneum soymak için ince forceps kullanın. Nazik karıştırma sonra, topikal abraded pad üzerine virüs inoculum uygun titre 20 mikrolitre uygulayın.Sadece kontrol hayvanlarının aşılı ayak lıklarında orta ile sahte aşılar gerçekleştirin. Her uygulamadan sonra, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir virüsün adsorpsiyonkolaylaştırmak için bir iğne mili ile hafifçe ayak takımı 10 kez ovmak. Abraded footpad kurutulduğunda, klinik takip ve örnekleme için tek tek kafeslere hayvanları yerleştirmeden önce farelerin sternal recumbency kadar izleme ile kurtarmak için izin verin.Uygun deneysel zaman noktalarında, virüs kalp, akciğerler, dalak, pankreas, karaciğer, böbrekler ve mesane de dahil olmak üzere maruz organları toplamak buz üzerinde bireysel 1.5 mililitre mikrotüpler içine. Sonra topuk ve yürüyüş pedleri arasında abraded footpads hasat ve buz üzerinde bireysel 1,5 mililitremikrotüpler içine örnekleri yerleştirin. Daha sonra fareyi yatkın konuma getirin ve kürkü %70 etanolle ısla.Vertebral kolon ortaya çıkarmak için, pelvis bölgesinde küçük bir kesi yapmak ve baş doğru arka ekstremitelerden deri şerit. Ön ve arka uzuvları çıkarmak için, paralel ve her iki tarafta spinal kolon yakın kesmek için makas kullanın. Ve kafatasının tabanındaki kafayı çıkar.Ön kemik foramen magnum kafatası açmak için makas kullanın. Ve kafatasını yanal bir yöne çekmek için forceps kullanın. Sonra yavaşça beyin dışarı kepçe ve buz üzerinde 1.5 mililitrelik mikrotüp içine beyin yerleştirmek için forceps kullanın.Kas, yağ ve yumuşak doku omurilik temizlemek ve kuyruk kaldırmak için kavisli makas kullanın. Daha sonra bozulmamış omuriliğini en fazla üç saat boyunca 15 mililitrelik steril buz gibi pbs tüpüne yerleştirin. Diseksiyondan sonra, kalan yumuşak dokunun çıkarılmasını sağlamak için omuriliği bir doku kültürü yemeğine aktarın.S2, L1 ve T1 omurları omurilik yoluyla üç enine kesik yapmak için bir jilet kullanın. Parçaları steril buz gibi PBS içeren 15 milimetrelik tek tek yemeklere aktarın. Daha sonraki analizler için segmentlerin kökenlerini izlemek ve işaretlemek.Daha sonra, bir segment dorsal tarafı kadar güvenli ve iki eşit yarıya sütun bölmek için orta hat üzerinden tek, uzunlamasına kesilmiş yapmak için bir jilet kullanın forceps kullanın. Omurganın sol ve sağ taraflarını ayırt edebilmek için orijinal yönde taze, steril buz gibi PBS içeren yeni bir Petri kabına her iki yarım yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskop altında, yavaşça kaudal yönde bir rostral vertebral sütunun her yarısından omurilik soymak için ince forceps kullanın.Daha sonra her iki omurilik yarımlarını buz üzerinde 500 mikrolitre steril buz gibi PBS içeren tek tek 1,5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin. Dorsal kök ganglion ortaya çıkarmak için, yavaşça diğer omurilik bir tarafında menenjler kaldırın. Ve açıkta kalan beyaz omurilik sinirini omurilikten çıkar.Yuvarlak hasat, omurga segmentinden şeffaf dorsal kök ganglion içine 15 buz gibi PBS bir 15 milimetre Petri çanak. Ve ipsilateral ve kontrlateral dorsal kök ganglion toplamak gibi sadece gösterdi. Sadece gösterildiği gibi diğer iki spinal kolon segmentlerinden spinal sinir ve dorsal kök ganglion hasat sonra, yüksek hızda doku tüm tüpleri santrifüj.Daha sonra süpernatantları aspire edin ve numuneleri sıvı nitrojende flaş dondurun ve homojenhale gelene kadar eksi 80 derecede saklayın. Doku homojenizasyonu için, her numunenin 100 miligramını tartmadan önce donmuş doku tüplerini buz üzerinde eritin. Steril boncuklar ve 500 mikrolitre radyoimmünopreyağış tofçuk tamponu içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, iki dakika boyunca saniyede 20 döngü, bir dakika bekleme süresi ve ek bir iki dakika için saniyede 20 döngüleri bir homogenizer oda sıcaklığında dokuları bozmak. Homojenizasyon ikinci tursonra, yeni bir uygun etiketli tüp içine her supernatant 500 mikrolitre aktarmadan önce yüksek hızda dokuları santrifüj. Aşağı analize kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.Aşınma yeri kontrol ayak takımı görünür. Ve iyileşme sürecinin bir parçası olarak aşınma yerinde bir kabuk oluşturmak için tipiktir. Buna karşılık, fareler psödorabies ile aşılanmış, şişme ve kızarıklık ile karakterizedir insancıl ucunda ayak takımı ciddi bir iltihap göstermek.Aşılama pediye ve dorsal kök ganglion histopatolojik inceleme psödorabies enfekte ayak bölümleri içinde epidermal nekroz ve şiddetli dermal inflamasyon ortaya koymaktadır. Nötrofilin infiltrasyonu da psödorabi enfekte DRG kesitlerinde gözlenmektedir. G-CSF protein ekspresyonunda önemli bir artış, enfeksiyon sonrası yedi ve 82 saatlik kontrollere kıyasla, enfekte olmuş farelerin pediye ve dorsal kök ganglion'unda ölçülür.Önemli G-CSF düzeyleri de kontrollere göre spinal kord, beyin, kalp ve psödokuyabiler enfekte farelerin karaciğer dokularında 82 saatlik post-enfeksiyon gözlenir. Ayrıca, 24 saat post-enfeksiyon dan başlayarak psödorabis enfekte farelerin tüm test dokularında IL-6 önemli düzeyde tespit edilir. Bir moribund durumda, psödorabies ayak takımı tespit edildi, dorsal kök ganglion, omurilik, ve beyin.Psödorabies enfekte farelerde dorsal kök ganglion nöronlarında psuedorabies glikoprotein gB yüksek sitoplazmik ekspresyonu ile. Başarılı bir enfeksiyon sağlamak için, bir sütunda virüs damlacık abraded ayak takımı düşmez önemlidir. Bu hayvan modeli viral kaynaklı periferik nöropatileri önlemek için anti-inflamatuar ve antiviral ilaçların etkinliğini test etmek için platform hizmet edebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Kurtarma Zamanı Artan ve Sınırlı Enflamatuar Yanıtları içinde Vagus sinir stimülasyonu Mekanizmaları Eğitim için LPS İdaresi Azalmış

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Bir Galleria mellonella Oral yönetim modeli için Study Commensal-Induced doğuştan gelen bağışıklık yanıtı

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...