Name: flypub to study ethanol induced behavioral disinhibition and sensitization
Uploaded: 2020-05-18T14:30:00
Duration: 8 min 13 s
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この研究は、NIAAA 1R15AA020996、NIMH R21MH109953、脳行動研究財団NARSAD、およびNIMHD 2G12MD007592 NMDクラスタ補助金によって支えられました。また、NMDとCMSを支援するためのNIH出資のRISEプログラム(NIGMS 5R25GM0696621)、NMDを支援するためのUTEP COURI-上回りプログラム、AAを支援するためのNIH出資のMARCプログラム(NIGMS 2T34GM008048-31)、およびEBSを支援するためのKeelung Hong大学院フェローシップに感謝しています。私たちはUTEPコミュニケーション部門に大いに感謝しています:ダーリーン・バラハス、クリスチャン・リベラ、カリーナ・モレノ、ホセ・ロヤ・フェルナンデス、音楽部門:スティーブン・A・ハダッドはビデオとボイスオーバー制作の助けを借りています。最後に、カントンSのバックグラウンドでtβh変異体をカントンSのhハエと共に共有してくれたアンドレアス・サム博士に非常に感謝しています。ジェシカ・ブルシアガは、オクトパミンに関する最初の研究と議論とサポートのためのハンラボメンバーに貴重な貢献をしました。

注:プロトコルセクションでは、(1)チャンバの(1)アセンブリ、(2)フライケアと収集、(3)アッセイステーションのセットアップ、(4)エタノール暴露、(5)求愛採点とデータ分析、および(6)統計分析を含む準備、Flypubアッセイおよび分析ステップを詳述しています。Flypub アッセイと分析を行うための主要なステップは、ワークフローで示されています (図 1)。
1. チャンバーの組み立て (図 2)
<ol><li>カミソリの刃を使用して、25 mLマークで丸いショウジョウバエボトルの下部を切り取ります。</li>
	<li>熱いはんだ付け鉄を使用してボトルの50 mLマークで、直径5mmの穴を作ります。 注:これはハエがチャンバーに転送されるアクセスポイントです。</li>
	<li>75 mLマークでショウジョウバエボトルに収まるように、メッシュシートを直径54mmの円に切ります。</li>
	<li>ホットグルーを使用して、ボトルの75 mLマークでメッシュを固定します。</li>
	<li>ポリカーボネートのプラスチックシートを直径70mmの円に切ります。</li>
	<li>ホットグルーを使用して、25 mLマーク(ステップ1.1で作られた底面の開いた領域)でボトルにポリカーボネートプラスチックシートを取り付けます。</li>
	<li>ポリカーボネートラウンドが底部にしっかりと取り付けられていることを確認するために重量を使用して圧力を下げます。</li>
	<li>エタノールでパブを洗って臭いを取り除き、蒸留水の下で何度もやたらと洗い流します。余分な水を取り除くために精力的にパブを振ります。</li>
	<li>常温でペーパータオルの上に横に置いてパブを乾燥させます。</li>
</ol>2. フライケアとコレクション
<ol><li>標準的なコーンミール/寒天/砂糖/酵母食品培地(https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html)でハエを維持します。</li>
	<li>生後1~2日のオスのハエを、二酸化炭素(CO2)麻酔下で1つのデータポイントを表す33のグループに集める。無傷の形態を持つハエを選択し、回復するために食品バイアルに入れてください。 注:グループごとに2つまたは3つ少ないハエは許容可能です。動作は実験的な設定に敏感であり、パブごとの合計フライ数はコントロールフライラインで調整する必要があります。 注:麻酔ハエが食べ物にくっつかないように、食品バイアルが側面に置かれていないことを確認してください。</li>
	<li>25°Cインキュベーターでハエを少なくとも50%の相対湿度と12時間光/12時間の暗いサイクルでエタノール暴露前に2日間保ちます。 注:CO2クリアランスは、エタノール誘導応答を変化させる可能性のある CO2誘導生理的または行動的な効果を排除するために重要です。</li>
	<li>コードを使用して、エタノール暴露を行い、求愛行動を採点する実験者に、遺伝子型または治療条件を盲目にします。 注: ブラインドテストは、実験的バイアスを排除するのに役立ちます。</li>
</ol>3. アッセイステーション設置(図3A)
<ol><li>換気の良い部屋のベンチトップにセンターアームを取り付けたコピースタンドを設置します。 メモ:コピースタンドは必須ではありません。レベル プラットフォームを提供するステージング デバイスがあれば、十分です。</li>
	<li>2本の側面アームをスタンドにクランプし、各アームをスタンドの中央から約18cm外に出します。</li>
	<li>スタンドの各アームに蛍光灯を、中央に1つ置きます。</li>
	<li>ビデオレコーダーをセンターアーム(ベースの中央から約38cm上)に取り付けます。これは、トップビューからパブを記録します。</li>
	<li>スタンドのベースを白い紙で覆い、暗い色のハエを視覚化してコントラストを作り出します。</li>
	<li>露光の日には、コピースタンドに取り付けられているビデオカメラに接続された蛍光灯とコンピュータをオンにします(図3A)。 注:光強度2100-2200ルクスは、スコアリングのための記録された動作の良質を提供します。しかし、実験室の周囲の照明条件は、エタノール誘導求愛活動を観察するのに十分である。</li>
	<li>図3Bに示すエタノール暴露に使用するアイテムを用意します。</li>
	<li>実験のセットのために6つのきれいな、組み立てられたパブを集め、コード1から6でラベル付けします。 注: ランダム化コードは、必ず、ハエの遺伝子型または治療条件に配置してください。</li>
</ol>エタノール暴露 (図3)
<ol><li>小さな漏斗を使用して、50 mLマークの穴を通して33人の男性のグループをFlypubチャンバーにそっと移します。 注:ハエへの機械的ストレスを最小限に抑えるには、移動中にマウスパッドまたはクッション材をパブの下に置きます。</li>
	<li>穴をテープで覆います。 注:テープは、ハエがパブから脱出するのを防ぐために、穴を閉じるために使用されます。</li>
	<li>ステージ上のパブを1から6に合わせます。</li>
	<li>ハエをチャンバーに10分間順応する(図3D)。</li>
	<li>焦点、ズーム、明るさを含むカメラの設定を調整し、基礎求愛レベルを測定するために順応の最後の5分を記録します。 注:パブからの光反射によって発生するグレアを除去するには、ラボワイプ(通常は4層または1mm未満の厚さ)をパブの下部に配置して角度を調整します。</li>
	<li>きれいなはさみで4つの等しい象限にパッドを切断することによってエタノール配達のための綿パッドを準備し、順応の間にペトリ皿に収まるようにコーナーをトリミングする(図3C)。 メモ:綿パッドの取り扱いに素手を使用しないでください。臭気の潜在的な伝達を避けるために綿パッドを扱うために鉗子を使用してください。</li>
	<li>各ペトリ皿に綿パッドを追加します。</li>
	<li>各綿パッドに95%エタノールの1mLを加え、エタノール溶液がパッドの全領域に均等に分配されるようにしてください。</li>
	<li>高速エタノール蒸発を避けるために二重層ラボワイプで覆います。</li>
	<li>エタノールを浸した綿パッドを含む小さなペトリ皿と二重層ラボを順応後のパブの底開口部を拭きます。</li>
	<li>ステージ上のパブを揃えて、記録を開始し、同時にタイマーを開始します。</li>
	<li>ハエがセドレーションのために求愛や移動を停止するまで、エタノール暴露中にハエを含むパブを記録します。</li>
	<li>ハエの90%以上が鎮静されたときに、各パブからエタノールを含むペトリ皿をヘラで取り除きます。</li>
	<li>パブの50 mLマークの穴を通して、割り当てられたバイアルにゆっくりと移動します。 注:転送を支援するために食品バイアルの上に漏斗を置きます。食べ物のバイアルの側面に鎮静ハエを置いて、食べ物に詰まりないようにしてください。</li>
	<li>エタノールでパブをきれいにして臭いを取り除き、蒸留水の下で何度もやたらと洗い流します。余分な水を取り除くために精力的にパブを振ります。</li>
	<li>常温でペーパータオルの上に横に置いてパブを乾燥させます。</li>
	<li>25°Cインキュベーターでハエを少なくとも50%の相対湿度と12時間光/12時間の暗いサイクルで保管してください。</li>
	<li>6日間連続して24時間ごとにステップ4.1-4.17を繰り返し、概日の影響を避けるために、一日の同じ時間にエタノール暴露を行うことを確認してください。 注:健康なハエを維持するために2〜3日ごとに食品バイアルを変更します。</li>
</ol>5. 求愛スコアリングとデータ分析 (図 4-6)
<ol><li>メディア プレーヤー (VLC など) を使用して録画したビデオを開き、ビデオを拡大して、ハエを明確に観察して得点します (図 4A)。</li>
	<li>ビデオにタイムコードを添付します (図 4B)。</li>
	<li>以下を含む求愛活動に従事する男性の数を数えます, 一方的な翼の延長, 求愛チェーン, 求愛サークル, 腹部の曲げと取り付け10 s 時間ブロック 31 (図 5).</li>
	<li>10s 時間ブロックごとに求愛を表示する男性の数をワークシートに入力します (図 6A)。</li>
	<li>3つの連続した10の時間ブロック内の求愛男性の最大数を代表的なデータポイントとして使用します(図6B)。</li>
	<li>最高値を持つ連続する10個のデータポイントの平均を計算し(図6C)、これはパブあたりの男性間求愛度の割合を表します(図6A)。</li>
</ol>6. 統計分析(補足図1)
<ol><li>統計解析ソフトウェア(Minitab 17など)を開き、ワークシートに求愛データを追加します。 注: 統計解析ソフトウェアは、いずれも使用できます。</li>
	<li>データの分布 (正規分布または非正規分布) を決定するには、[統計] タブに移動し、[基本統計] を選択して、[正規性検定] オプション (図 1Ai を補足) をクリックします。</li>
	<li>変数で、個々の列(研究中の遺伝子型または治療のデータセットを表す各列)を選択し、アンダーソン・ダーリング検定を選択し、OK(補足図1Aii)をクリックします。 注: 正規確率プロットには、計算されたP値が表示されます:P値が0.05より大きい場合、データは正規分布されます。P値が0.05未満の場合、データは非正規分布(補足図1Aiii)である。</li>
	<li>複数のグループを比較するには、[データ] タブをクリックして比較する列をスタックし、[スタック] を選択して、[列] (補足図 1Bi) を選択します。</li>
	<li>[スタック列]ウィンドウで、スタックするデータ列を選択し、現在のワークシートの新規ワークシートまたは列で、下付き文字を示すために指定された次の列 (データ グループ ID、補足図 1Bii-1Biii)。</li>
	<li>[Stat]タブをクリックし、[ANOVA検定]を選択し、[一般線形モデル]を選択して、[一般線形モデルに適合]をクリックします(補足図 1Ci)。</li>
	<li>[一般線形モデル]ウィンドウで、[応答] ボックスで比較する列を選択し、[係数] ボックスで下付き文字を含む列を選択して[OK]をクリックすると、統計分析の結果が表示されます (補足図 1Cii-1Ciii)。</li>
	<li>正規分布データとの比較を行う場合は、[統計] タブをクリックし、[基本統計] を選択し、 2-Sample t 検定( 図 1Diを補足) を選択します。</li>
	<li>[平均] ウィンドウの [2-Sample t]で、[各サンプルが独自の列]の [各サンプル] を選択し、[サンプル 1]ボックスと [サンプル 2]ボックスで比較する 2 つのグループを選択し、[OK]をクリックすると、統計分析結果が表示されます (図 1Dii-1Diiiを補足します)。</li>
	<li>2 つのグループと非正規分布データを比較するには、[統計] タブに移動し、[非パラメトリック]を選択して[マン・ホイットニー ] (補足図 1Ei)をクリックします。</li>
	<li>「マン・ホイットニー」ウィンドウで、「第 1 サンプル」および「2 番目のサンプル」ボックスで比較する 2 つのグループを選択し、「OK」をクリックすると、統計分析の結果が得られます (補足図 1Eii-1Eiii)。</li>
	<li>非正規分布データの3つ以上のグループの比較を行う場合は、[統計] タブに移動し、[非パラメトリック]を選択して、Kruskal-Wallis 検定(補足図 1Fi)をクリックします。</li>
	<li>[Kruskal-Wallis]ウィンドウで、[応答] ボックスで比較する列を選択し、[係数] ボックスで下付き文字を含む列を選択して[OK] をクリックすると、統計分析の結果が得られます (補足図 1Fii-1Fiii)。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このレポートでは、Flypubアッセイのセットアップと詳細なプロトコルについて説明しました。エタノール曝露の繰り返しが求愛と行動感作を阻害する方法を測定する新しい方法。Flypubアッセイは比較的簡単ですが、いくつかのステップは、信頼性の高い結果を確保するために注意と注意が必要です。まず、検査用のハエは完全に着色(すなわち、完全に発達した成虫ハエ)、健康で無傷でなければならない。特に翼や脚の変形や損傷は、男性の裁判能力に影響を与える可能性があります。第二に、フライ年齢は重要であり、対照群と実験群の間で一致しなければならない(最適年齢:エタノール暴露1で3〜5日齢)。2週間と古い野生型の雄のハエは、阻害された求愛の上昇レベルを表示する傾向があります 31.したがって、研究中のハエの適切な年齢マッチングは、可変的な結果を避けるために不可欠です。第三に、パブあたりのフライ数は不可欠です(最適:パブあたり33)。パブあたりの低いまたは高いフライ数は、求愛スコアを大幅に歪めることができます(データは表示されません)。第四に、Flypubチャンバは図2Bに示すように同じボリュームを持っている必要があります。これにより、ハエはエタノール蒸気を同期的に受け取り、引き出された挙動は一貫しています。第五に、明確なビデオ録画と正確な求愛スコアリングが不可欠です。このプロトコルは行動観察に大きく依存するため、標準化された求愛スコアリングプロトコルに細心の注意を払って遵守することは、矛盾した結果を最小限に抑えるための基本です。最後に、エタノール暴露と求愛スコアリングステップの両方を盲目的に行うことを強くお勧めします。
フライパブアッセイには複数の利点があります。まず、複数のハエグループを同時にテストして比較することができます。第二に、それは安価で、セットアップが簡単で、学びやすく、小学生から高校、学部生、大学院生、ポスドクや教員、限られたスペースと予算の教育研究所を含むすべてのレベルの実験者に非常に適しています。第三に、初期感受性および耐性の発達および維持を評価するために、雌ハエの抑制された求愛およびエタノールまたは他の鎮静剤の鎮静効果などの追加の行動を測定するために利用することができる31、32。31,フライパブは一緒に、AUDの多様な機能を研究するための汎用性の高い方法です。
Flypubアッセイの主な制限は、厳格で骨の折れる求愛の採点計画です。エタノールの影響下での求愛行動は、求愛期間が1秒未満から数分間に及び、求愛に従事するハエがかなり頻繁に変化しているように、非常にダイナミックである。ここで提示されたスコアリング体制は、この動的性質を取り入れ、特定の遺伝子型31、32,32に対して個々のエタノール暴露に一貫したスコアを提供するために開発されました。プロトコルで述べたように、求愛活動は手動で採点され、時間がかかります。いくつかの自動スコアリングプログラムは、公平なハイスループット行動スクリーニングを容易にするために開発されており、そのすべてが個々のハエの動きと位置39、40、41、42、43、44、45に依存しています。39,40,41,42,43,44,45また、求愛活動を自動的にカウントするコンピュータソフトウェアの開発を試みましたが、一貫した信頼性の高い結果を得ることができませんでした。これは、行動スコアリングには、複数の求愛ステップ(すなわち、一方的な翼延長、腹部の曲げおよび取り付け)が一度に複数のハエの35、36、4646を含むという事実に起因する可能性があります。35,36この制限があっても、十分な訓練を受けた実験者は、エタノール誘発性の求愛行動を一貫性と正確さで定量化できるべきである。それにもかかわらず、機械学習やその他の高度なアルゴリズムをフォローアップとして採用することは大きな助けとなり、重要です。
げっ歯類モデルと同様に、フライモデルにおけるエタノールに関する研究は、主にエタノールの運動刺激および鎮静効果に焦点を当てている。しかし、Flypubアッセイは、新しい31、32である認知阻害の一種である、阻害された求愛を32測定する。したがって、Flypubは、分子プレーヤー、細胞経路および神経回路、ならびに行動阻害および感作に不可欠な危険因子(例えば、年齢、睡眠、食事または社会的環境)を解明するのに役立ちます。我々は以前に、げっ歯類モデルおよびヒト被験者の知見66,9,319,31に沿ったEIBSにドーパミンシグナル伝達が必要であることを実証した。また、概念実証として、OAを欠tいたtβh変異体(ノルエピネフリンの無脊椎動物の対応)を調べたところ、OAはドーパミン31に比べてその寄与は比較的小さいもののエタノールの阻害効果に対する行動感作にも重要であることがわかった。この発見は、tβh変異型ハエがエタノールのロコモ運動活性化h効果47に対する感作に明らかな障害を示さないというショルツ47の観察と47は対照的である。これは、行動感作を抑制対運動運動活性化に媒介する明確な分子、細胞および神経経路を示唆している。フォローアップ研究は、この食欲をそそる概念をさらに協力する必要があります。
要約すると、Flypubは、エタノールに対する行動応答、特に阻害および行動感作化を調査するための低コストで多面的かつ効果的な方法であり、AUDの理解を進め、この慢性疾患に対する効果的な介入に関する洞察を提供する可能性があります。

アルコールは、世界で最も容易に入手可能で広く消費される薬物の1つです。それは誤用と中毒の可能性が高いです。しかし、このプロセスの根底にあるメカニズムは完全には理解されていません。エタノールは、阻害、幸福感、認知障害、多動性、運動制御の喪失およびワーム1、フルーツハエ11、2、3、2,3マウス4、ラット5およびヒト6を誘導し、無脊椎動物からヒトを含む哺乳類へのエタノールの影響を媒介する一般的な神経生物学的成分を示す。慢性エタノール摂取は、AUDの根本となる神経適応および行動修飾を引き起こす。適応の一,つは、エタノール,77、8、9または他の中毒性物質910、11、12,11の反復経験を伴う増強応答として定義される行動感作である。,812
エタノール誘導行動感作(EIBS)に関する研究は、ユーフォリア応答,,77、8、9、138の代理として使用される運動運動刺激効果に焦点を当ててきました。913例えば、繰り返し(24、48、または72時間毎)エタノール投与時のラットまたはマウスは、,歩行速度,,,,88、14、15、16、17、18、19、20、2114,15によって測定された拡張運動活性を表示する。,211617181920同様に、第1露光後4時間にエタノール蒸気に第2露光を施した果実ハエは、同様に22と同様に歩行速度によって測定される高度な運動応答を示す。フルーツハエにおける運動刺激効果に対するEIBSの基礎となるメカニズムに関する情報は得られないですが、 ラットおよびマウスの研究は、EIBS,,6、9、23の主要な役割を果たす神経基質および回路(例えば、腹側テグメンタル領域、側坐核、扁桃体および前頭前野)と同様に、分子およびシグナル伝達成分(例えば、ドーパミン、グルタミン酸およびGABA系)を発見した。623
阻害はエタノールの主要な効果であり、典型的に制限されている行動の現れにつながる。抑制効果は、運動、感情的、社会的、性的および認知的機能に及ぼされ、人間および動物モデル24、25、26、27、28、29における不適切な性的24,25,26,27行動、言葉または身体的攻撃性および28,29衝動的な行為につながる可能性がある。エタノール誘発阻害は、機械学的研究のための動物モデルで調査されており、それらはげっ歯類およびサルにおける運動衝動性および侵略性ならびにワーム696、9、24、28、29、30の阻害を24,28,29,30食い止める。,,我々は、果実ハエがエタノール31の影響下で抑制された性的行動を示していることを実証した。具体的には、野生型の男性はエタノール31なしで他の男性を裁判にすることはめったになく、そうすると、求愛者は積極的に男性を求愛することを拒否する。しかし、エタノールの影響下では、オスのハエは他の男性に対してより多くの求愛を示し、求愛者は拒絶反応が少なく、全体的に男性間の求愛が強化される。特に、ハエは、EIBS31,32,32を研究する独自のシステムとして機能するエタノール曝露を繰り返し行う際の抑制効果に対する行動感作を発現する。
本報告では、Flypubアッセイおよびデータを設定、実行、トラブルシューティング、および分析して、ショウジョウバエメラノガスターの果実フライにおけるエタノール誘発抑制および感作化を研究する方法を説明する。その有用性と有効性を提供するために、オクトパミン(OA)を合成するチラミンβヒドロキシラーゼ(tβh)の欠損ハエと一緒に野生型カントンS(CS;コントロールフライ株)を試験しました。CSOAは無脊椎動物33、34における主要な神経調節器であり、34ハエ22におけるエタノール耐性の開発において重要な役割を果たしている。ここでは、OAが EIBS にとって重要であることを初めて報告します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>95 % Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>BDH1158-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canton-S</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>wild-type strain used as a control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy stand with arms</td>
			<td>Kaiser</td>
			<td>205411</td>
			<td>model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton rounds</td>
			<td>Swisspers</td>
			<td>COT-027</td>
			<td>to deliver ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light bulb</td>
			<td>Lights of America</td>
			<td>7108N</td>
			<td>maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft LifeCam software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>version 3.60; to videotape flypubs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft LifeCam Studio</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Q2F-00013</td>
			<td>1080P HD sensor; to videotape flypubs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab 17</td>
			<td>Minitab</td>
			<td>-</td>
			<td>version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh sheet</td>
			<td>Sefar Nitex</td>
			<td>-</td>
			<td>model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td>35 x 10 mm; to deliever ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel - mid size</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10-348A</td>
			<td>65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel - small</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>07-202-121</td>
			<td>4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheet</td>
			<td>Lexan</td>
			<td>-</td>
			<td>0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom bottle</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AS115</td>
			<td>polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td>to make a hole in a flypub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time code</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramine b hydroxylase (tbh)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN</td>
			<td>-</td>
			<td>version 3.0.8; any media player can be used to score courtship</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flypub to study ethanol induced behavioral disinhibition and sensitization

アルコール使用障害(AUD)は、私たちの社会で深刻な問題のままです。中毒に対する効果的な介入を開発するには、多様な実験的アプローチとモデルシステムが必要な根本的な神経生物学的メカニズムを理解することが重要である。アルコール飲料の主成分はエタノールであり、中枢神経系の適応的変化と慢性摂取時の行動を引き起こす。行動感作(すなわち、エスカレートした応答)は、特に中毒の根底にある主要な適応変化を表す。動物モデルにおけるエタノール誘導行動感作の研究の多くは、エタノールの運動活性化効果に関して行われている。エタノールの顕著な効果は行動阻害である。しかし、エタノールの抑制効果に対する行動感作は、過小評価されている。この問題に対処するために、我々は、ショウジョウバエメラノガスターでの繰り返しエタノール暴露時に阻害された求愛活動のエスカレート増加を測定することを可能にするFlypubアッセイを開発した。ここでは、エタノール暴露室の組み立て、アッセイステーションの設定、フライケアと収集の基準、エタノール送達、阻害された求愛活動の定量化、データ処理および統計分析を含む、ステップバイステップのFlypubアッセイを報告する。また、重要なステップのトラブルシューティング、制限の克服、その有用性の拡張など、エタノールによるその他の挙動を評価する方法も提供されています。Flypubアッセイは、ショウジョウバエメラノガスターの強力な遺伝的ツールと組み合わせて、エタノール誘導行動感作の基礎となるメカニズムを発見する作業を容易にします。

このセクションでは、Flypub の代表的な実験の結果を示します。ショウジョウバエの男性はめったに他の男性35、36,を裁判にかけました。最初のエタノール暴露の間、野生型カントン-S(CS)の雄は、抑制された男性間求愛31のわずかな有意な増加を示した(図7A)。CSしかし、CS男性は、その後のエタノール暴露における阻害された求愛活性のエスカレート増加を示した(ANOVA GLM,CS: R2=0.83、F (5,66) =65.21, p < 0.0001; CSn = 12;図7A)は、エタノールの抑制効果に対する行動感作を示す。我々は以前にEIBSのこのタイプは、キノコニューロン31、32,32にドーパミンとドーパミン受容体DopEcRを必要とすることを示している。
追加の神経調節物質がEIBSに関与しているかどうかを特定するために、ハエ(tβh;nM18ヌルアレーレ)37、38,38はOA生合成におけるレート制限酵素であるチラミンβヒドロキシラーゼを欠き、OAで欠損を行い、OAの役割を調べた。tCS遺伝的背景のtβh雄(ドイツのライプツィヒ大学アンドレアス・トゥム博士からの親切な贈り物)は、毎日のエタノール暴露時に感作された抑制された求愛応答を表示した(ANOVA GLM、tβh:R t 2=0.67、F(5,66)=27.60、p<20.000; (5,66) pn = 12;図 7B)しかし、CS(ANOVA GLM、相互作用効果:F=2.50、p<0.034)と比較して減少したレベルで。 F pポストホック分析の際、tβh雄は、CSと比較して4回目から6回目のエタノール暴露中に最も顕著である各暴露で男性間求愛のより低いレベルを示した(2サンプルt-test:EXP4ではp<0.002、EXP5ではppp<0.021;n = 12;図 7C)。これらの結果は、一緒に、OAがエタノールの阻害効果にEIBSにおいて役割を果たす可能性があることを示している。さらに重要なことに、これらのデータセットは、エタノール誘発阻害および感作化を研究するFlypubアッセイの有用性と有効性を明確に示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig1.jpg"> 図1:フライパブアッセイのワークフロー。Flypubアッセイを実施するための主要なステップを強調するワークフロー図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig2.jpg"> 図2:フライパブ室の材料とアセンブリ。(A) フライパブチャンバーを構築するために必要な材料には、 (i) ホットグルーガン接着剤の棒, (ii) 熱い接着剤銃, (iii) カミソリ刃, (iv) はんだ付け鉄,(v)定規, (vi) メッシュ,(vii)ポリカーボネートプラスチックシート, (viii) ラウンドボトムショウジョフィラボトル.(B) フライパブチャンバーアセンブリの概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig3.jpg"> 図3:エタノール暴露。(A) 完全に組み立てられたフライパブ駅。(B) エタノール暴露に必要な材料としては、 (ii)iiテープ,(iii)コットンパッド, (iv) ペトリ皿, (v) ラボワイプ, (vi) 小漏斗, (vii) タイマー, (viii) 中型の漏斗,(ix)マウスパッド,(x)はさみ, (xi )95% エタノール,xi)力を含む.(C) 綿パッドの切り方の手順。(D) ステージ上で整列したパブのトップビュー画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig4.jpg"> 図 4: 動作スコアリングのビデオ設定図は、ビデオを拡大表示する方法と、動作スコアリングのために VLC メディア プレーヤーにタイムコード ファイルを挿入する方法 (A) のステップ バイ ステップ ガイドです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig5.jpg"> 図 5: 男性の求愛行動代表的な画像は、行動スコアリングに使用されるショウジョウバエ男性求愛行動(A)求愛歌、(B)求愛連鎖、(C)求愛サークル(D)腹部曲げ、および(E)取り付けの後及び一方的な翼の延長を含む。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig6.jpg"> 図 6: データ入力と分析(A) 10時間ごとに求愛に従事する男性の数をワークシートに書き起こします。連続した3つの連続した10の時間ブロック(緑色の矢印)の求愛男性の最大数は、代表的なデータポイントとして使用されます。最大値を持つ連続した10個のデータポイント(青またはオレンジ括弧)の平均は、パブあたりの男性間求愛の割合を表します[オレンジブラケット;MAX(平均)、黒矢印(B,C)最大代表的なデータポイントと、パブごとの連続する 10 個の連続するデータ ポイントの最大平均を計算するために使用されるワークシートの数式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig7.jpg"> 図7:CSおよびtβhにおけるエタノール誘発行動阻害および感作h化。(A,B)CSおよびtβhの雄は、繰り返しエタノール暴露を伴う感作求愛阻害を示した(ANOVA GLM,CS:R R2=0.83、F(5,66)=65.21, p < 0.0001; F(5,66) t tβh: R2=0.67, F(5,66)=27.60, p < 0.0001;n = 12)。(C) tβh雄はCS(n=12)に比べてあまり阻害されない求愛を示した。 CSポストホック解析のp値は、ラインの上に表示されます。各エタノール曝露について生成された動画から男性間求愛活動を分析した。全てのデータは平均の平均値±標準誤差として報告される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:統計分析Minitab 17ソフトウェアのステップは、(A)正規性検定、(B)データの積み重ね、(C)一般線形モデルANOVA検定、(D)2サンプルt検定、(E)マンホイットニー検定および(F)クルスカル・ウォリス検定を実行する方法を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123supfig1large.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization

Flypubアッセイは、フルーツフライショウジョウバエメラノガスターがエタノールの影響下で表示する挙動を測定します。アッセイは、あらゆるレベルの実験者によって容易に習得され、様々な気化した刺激に適用され、薬物乱用および中毒研究を促進することができる。

フライパブ、エタノール誘導行動抑制と感作を研究

Alcohol use disorder (AUD) remains a serious problem in our society. To develop effective interventions for addiction, it is important to understand the ...

Flypubアッセイは、アルコールの影響下で抑制された行動を測定します。それによりアルコール使用障害の機械研究を促進する。アルコールは、世界で最も容易に入手可能で広く乱用されている薬物の一つです。しかし、アルコール使用障害の根底にある神経生物学的メカニズムは不完全に理解されている。フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、幸福感、移動、阻害、および沈殿に対するエタノールの影響を研究するために広く使用されています。また、寛容さ、感作、エタノールシークなどの中毒に関連する行動の長期的かつ永続的な変化を研究するためにも使用されます。ショウジョウバエや他の動物モデルの多くの研究は、エタノールの運動活性化効果に焦点を当てています。エタノールの明確な効果は行動阻害である。しかし、それは研究がかなり過小評価されています。この重要な問題に対処するため、エタノールの影響下での抑制行動を測定するFlypubアッセイを開発しました。Flypubチャンバーを組み立てるには、丸いボトルを取り、カミソリの刃で25ミリリットルのマークの底部を切断します。熱いはんだ付け鉄を使用して50ミリリットルのマークに穴を作成します。これは、ハエが導入されるアクセスポイントです。直径54ミリの丸いメッシュを75ミリリットルのマークに置き、熱い接着剤を使用して固定します。透明なプラスチックシートを開いた底端に直径70ミリメートルに置き、熱い接着剤を使用して固定します。プラスチックラウンドがしっかりと底に取り付けられていることを確認するために、重量を使用して圧力ダウン。33のグループにオスのハエを収集します。それらを食品バイアルの側面に置きます。少なくとも50%の相対湿度と12時間の光、12時間の暗いサイクルをエタノール暴露の前に2日間の25°Cインキュベーターに入れます。ビデオ録画用のライト、コンピュータ、カメラをオンにして、Flypubアッセイステーションを準備します。実験のセットのために6つのパブを準備します。1から6までの数字でラベルを付けます。小さな漏斗を使ってハエをパブにそっと紹介します。テープを使用してパブを閉じます。ハエを10分間順応させます。順応の間、カメラの焦点を調節し、順応の最後の5分を記録します。順応の間エタノール配達のための綿のパッドを準備する。綿パッドを4つの等しい象限にカットし、コーナーをトリミングしてペトリ皿に収めます。ペトリ皿に綿パッドを加えます。綿パッドに95%エタノールを1ミリリットル加えます。エタノール溶液はパッドの全領域に均等に分配されるようにしてください。ペトリ皿をラボワイプで素早くカバーします。各パブの下にペトリ皿を含むエタノールを慎重に置きます。ステージ上のパブを整列します。記録を開始し、同時にタイマーを開始します。ハエが求愛や移動を停止するまで記録します。ハエの90%以上が鎮静されたときにペトリ皿を含むエタノールを取り除きます。鎮静したハエをゆっくりとフードバイアルに戻します。インキュベーターに戻します。前の手順を 24 時間ごとに 6 日間連続して繰り返します。メディア プレーヤーを使用してビデオを開きます。その後、10秒ごとに求愛活動に従事する男性の数をスコア。得点する求愛活動には、一方的な翼延長、求愛チェーン、求愛サークル、腹部の曲げおよび取り付けが含まれます。表示されるフライ動作の代表的な記録です。男性が多くの活動を示さない順応中。男性が散発的な求愛を示す最初の暴露の間に。そして、男性が活動の求愛を表示する6回目の暴露の間に。求愛を表示する男性の数を 10 秒のブロックで入力します。求愛する男性の最大数を、代表的なデータポイントとして3つの連続した10秒のブロックに使用します。最も高い値を持つ10の連続したデータポイントの平均は、パブあたりの男性間求愛の割合を表します。野生型カントン-Sは、エタノール曝露を繰り返した際に、徐々に求愛を抑制する活動を増加させた。エタノールの抑制効果に対する行動感作を表す。チラミンβ-ヒドロキシラーゼ、TβHを欠いているハエを試験することにより、感作におけるタコパミンの役割を調べ、オクトパミンに欠損した。カントン-Sと同様に、TベータH突然変異体は繰り返しエタノール暴露に対するエスカレート応答を示したが、減少したレベルであった。TβHとカントン-Sを比較した際、TβH変異体の雄は、各暴露においてカントン-Sの男性よりも阻害されない求愛度が低いことを観察し、オクトパミンが感作にとって重要である可能性があることを示した。Flypubアッセイを使用してエタノールによって誘導される行動を設定、実施、分析することができます。留意点としては、パブの適切な組み立てが挙げられます。2つ、一貫したエタノール送達、および3つの、正確で公平な行動スコア。フライパブアッセイには多くの利点があります。それは簡単で、セットアップに安価で、学ぶことが容易です。また、複数のハエ群を同時にアッセイすることができ、この研究は遺伝的または実験的操作の効果を特定することを容易にする。Flypubアッセイは、小学生から高校、学部生、大学院生、ポストドキュメント、教員を含むすべてのレベルの実験者に非常に魅力的です。要約すると、Flypubアッセイは、アルコール使用障害に寄与する分子プレーヤー、細胞経路、脳回路、および危険因子を同定することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Behavior

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

統合された行動ステーション（INBEST）を有するマウス疾患モデルの行動表現型

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

ラットにおけるパブロフ付きアルコール探索行動の状況誘発性のリニューアルを観察する手順

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

A Mouse Model of Subchronic and Mild Social Defeat Stress for Understanding Stress-induced Behavioral and Physiological Deficits

ストレスによって誘発される行動や生理障害を理解するための亜慢性マイルド社会敗北ストレスのマウスモデル

Stressful life events often increase the incidence of depression in humans. To study the mechanisms of depression, the development of animal models of ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

知覚と学習を研究するためのツールと​​しての電気生理学的皮質の記録と刺激と組み合わせたシャトル・ボックストレーニング

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

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Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

コカイン誘発性行動感作の評価とマウスにおける条件付け場所嗜好

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

アクアリアにおける魚類の生殖生態に関する基礎的研究

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

リバーシブルの冷却誘起 Deactivations 歩行猫障害メモリへの皮質の貢献を研究するには

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Using the FishSim Animation Toolchain to Investigate Fish Behavior: A Case Study on Mate-Choice Copying In Sailfin Mollies

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FishSimアニメーション ツールを使用して、魚の行動を調査する: 配偶者選択コピー八角 Mollies に関する事例

Over the last decade, employing computer animations for animal behavior research has increased due to its ability to non-invasively manipulate the ...

Behavioral Assessments of Spontaneous Locomotion in a Murine MPTP-induced Parkinson's Disease Model

マウス MPTP 誘発パーキンソン病モデルにおける自発運動の行動評価

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder disease, causing the phenomenon of shaking, rigidity, slowness of movement and ...