Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Denne forskning finansieres af tilskud til M.S.J fra Akademiet i Finland (308317, 320005), Sigrid Juselius Foundation og Tor, Joe og Pentti Borg mindefond, og til K.E. fra Academy of Finland (274728, 316796), Cancer Foundation of Finland, og Turku University Central Hospital. M.Z.T. er finansieret af Åbo Akademi Ph.d.-netværk for informations- og strukturbiologi. Vi takker CSC IT Center for Science for computerressourcerne og Dr. Jukka Lehtonen for it-supporten under Biocenter Finlands bioinformatiknetværk; og Biocenter Finland strukturelle biologi infrastruktur netværk.

BEMÆRK: De detaljerede skridt, der er taget for at undersøge virkningerne af ΔELREA- og A702V-mutationen på EGFR-strukturen ved hjælp af MD-simuleringer, behandles således:
1. Forberedelse af strukturen
BEMÆRK: For at undersøge de strukturelle virkninger af ΔELREA-mutationen fremstilles vildtype- og mutantformer af apoaktive, ATP-bundne aktive og apo inaktive EGFR monomerstrukturer på følgende måde.
<ol><li>Åbn Chimera23 visualiseringsprogrammet (<a href="https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/" target="_blank">https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a>) for at forberede den vilde apo aktive EGFR kinase struktur. Klik på indstillingen Hent efter id i menuen Filer, og vælg databasen Protein Data Bank (PDB24), og angiv PDB-kode 2GS225 (2,8 Å-opløsning). FBF er et opbevaringssted for 3D-strukturer, der løses ved forskellige eksperimentelle teknikker, herunder røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonansspektroskopi, kryoelektronmikroskopi og neutrondiffusion.</li>
	<li>Byg de manglende strukturelle elementer i 2GS2 ved at tage disse segmenter fra EGFR PDB strukturer 1M1426 (2,6 Å) og 3W2S27 (1,9 Å). For at gøre dette skal du åbne 1M14 og 3W2S og overlejre dem på 2GS2 ved hjælp af Indstillingen MatchMaker i menuen → struktursammenligning. Tools → Structure comparison<ol>
<li>Beskære de segmenter, der skal tilføjes fra 1M14 og 3W2S. Der vælges restproduktets terminalatomer før hullerne i 2GS2 og de atomer, der skal tilsættes fra 1M14 og 3W2S (for detaljerede oplysninger om de tilføjede segmenter, se tabel 1). På kommandolinjen type obligation sel og tryk enter. Denne struktur er skabelonstrukturen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brug skabelonstrukturen fra trin 1.2 til at konstruere ΔELREA-sletnings mutantform af EGFR-kinasedomænet. Fremgød FASTA-formatsekvensen af ΔELREA EGFR ved at gemme sekvensen af skabelonstrukturen(Favorit → Sequence → File → save as)og derefter slette ELREA-sekvensen ved restnumrene 746-750.<ol>
<li>Åbn ΔELREA EGFR-sekvensen i Chimera, og juster den til sekvensen af 2GS2-skabelonstrukturen ved hjælp af menuen Sekvens. Vælg indstillingen Struktur → Modeller (homologi)28 i justeringsvinduet.</li>
		<li>Angiv den sammensatte 2GS2-struktur i pop op-vinduet som skabelon og mutantsekvensen som den forespørgsel, der skal modelleres. Tryk derefter på OK. Vælg en mutant model blandt de resulterende modeller, baseret på zDOPE score (typisk den laveste score) og visuel inspektion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For at forberede DEN ATP-bundne EGFR-kinasestruktur anvendes FBF-struktur 2ITX29 (2,98 Å) som hovedstruktur. Opbyg manglende segmenter (se tabel 1) ved hjælp af strukturerne 2GS625 (2.6 Å) og 3W2S efter proceduren i trin 1.2. Konverter ligand ANP i den resulterende struktur til ATP ved at åbne PDB-filen i en teksteditor og ændre N3B nitrogen atom af ANP til et iltatom.</li>
	<li>Åbn strukturen i trin 1.4 i Chimera som angivet i trin 1.1. Tilsæt en magnesiumion til denne struktur fra PDB struktur 2ITN29 (2.47 Å) for at opnå en lignende positionering for Mg2 + ion.</li>
	<li>Med den struktur, der er resultatet af trin 1.5, skal ΔELREA-mutantformen modelleres efter trin 1.3.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Apo aktiv EGFR</td>
			<td>Apo inaktiv EGFR</td>
			<td>ATP-bundet aktiv EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hovedstruktur</td>
			<td>2GS2</td>
			<td>2GS7</td>
			<td>2ITX</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Strukturer, der bruges til at bygge manglende sløjfer</td>
			<td>1M14 (723-725)</td>
			<td>3W2S (958-984)</td>
			<td>2GS6 (862-865)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3W2S (967-981)</td>
			<td>4HJO (848-850)</td>
			<td>3W2S (990-1001)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Strukturer, der bruges til at bygge sammensatte modeller af apo aktive, apo inaktive og ATP-bundet aktive strukturer. Manglende regioner (aminosyreområde i parentes) i hovedstrukturen blev bygget ud fra de anførte strukturer.
<ol start="7"><li>For at forberede den vilde apo inaktive EGFR kinase struktur, åbne FBF struktur 2GS725 (2,6 Å) som i trin 1.1 og slette de bundne ligander og krystallografiske farvande. De manglende segmenter i 2GS7 (se tabel 1) fra strukturerne 3W2S og 4HJO30 (2.75 Å) ved hjælp af proceduren i trin 1.2. På baggrund af den endelige inaktive EGFR-struktur skal den mutante model forberedes ved hjælp af proceduren i trin 1.3. BEMÆRK: For A702V-mutationsundersøgelsen undersøges EGFR-asymmetrisk dimerstruktur, da mutationen er placeret på sideting b-segmentet i kinasedomænet, der udgør en stor del af dimer-grænsefladen. De vilde egfr-strukturer af vildtype og A702V fremstilles på følgende måde:</li>
	<li>Den vilde asymmetriske dimer struktur er konstrueret af PDB struktur 2GS2, som oprindeligt vises i monomerisk form. Hvis du vil konvertere til den biologiske samling, der indeholder aktivatoren og modtagerenkinaser i det asymmetriske arrangement, skal du åbne 2GS2 i Chimera som i (1.1) og udføre symmetriberegninger ved at klikke på menuen Værktøjer → Højere ordensstruktur → Enhedscelle. Vælg 2GS2-strukturen , og angiv Lav kopier. Endelig skal du vælge og gemme en enkelt asymmetrisk dimer fra de mange kopier af dimeren, der er resultatet af symmetrihandlingerne.</li>
	<li>Brug den vilde asymmetriske EGFR struktur fra trin 1,8, bygge A702V mutant ved at erstatte alanin 702 med valline ved hjælp af Tools → Structure redigering → Rotamers mulighed i Chimera. BEMÆRK: Tilsammen fremstilles seks monomeriske og to dimeriske EGFR-strukturer til henholdsvis ΔELREA- og A702V-mutationsundersøgelserne. Hver struktur behandles efterfølgende til simulering ved hjælp af guiden til fremstilling af protein i Maestro-programmet31, og MD-simuleringer foretages med Amber-programmet32.</li>
	<li>Åbn strukturen i Maestro ved hjælp af indstillingen → importstruktur. Klik derefter protein preparation wizard på proteinforberedelsesguideknappen og vælg følgende: tilsæt brintatomer, byg manglende sidekædeatomer, bestemme protonation af ionizable rester ved pH 7.0 ved hjælp af PROPKA, optimere orienteringen af asparagine, glutamin og histidin rester til hydrogenbinding, og endelig minimere strukturen.</li>
</ol>2. Systemopsætning
<ol><li>Åbn springprogrammet i Amber-softwarepakken. Import ff14SB kraft felt33 (kilde leaprc.protein.ff14SB) og TIP3Pvandmolekyler 34 (kilde leaprc.water.tip3p). For de ATP-bundne systemer importeres også parametre for ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphat, loadamberprep ATP.prep). Derefter indlæse strukturen (mol = loadpdb structure.pdb).</li>
	<li>Solvate strukturen i en oktaedral kasse med eksplicit TIP3P vandmolekyler, der strækker sig 10 Å i alle retninger fra overfladen atomer af proteinet(solvateoct mol TIP3PBOX 10.0).</li>
	<li>Kontroller det indbyggede system (Check mol) og neutralisere det ved at tilføje nødvendige ioner(addions mol Na + 0). For tilstrækkeligt model biomolekylære systemer, tilføje yderligere Na+/ Cl- atomer til simulering boksen for at bringe systemet salt koncentration til 0,15 M(addions mol Na + X, addions mol Cl- X), hvor X er erstattet af resultatet af: ønskede salt koncentration * antallet af vandmolekyler * volumen pr vand molekyle * Avogadro nummer.</li>
	<li>Generer og gem systemets topologi og koordinatfiler, der fungerer som input til den efterfølgende produktionssimulering (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).</li>
</ol>3. Simulering af molekylær dynamik
<ol><li>Brug Amber, i første omgang underkaste simuleringssystemet til 5000 cyklusser af stejleste afstamning og konjugat gradient energi minimering at omgå ugunstige konfigurationer. Minimeringen udføres i flere trin og sænk gradvist fastholdelsesanordningen på opløste atomer fra 25 kcal mol-1 Å-2 til 0 kcal mol-1 Å-2.<ol>
<li>I inputfilen minimering skal min.in du justere maxcyc-variablen for den samlede minimeringscyklus (maxcyc = 5000) og ncyc for at angive antallet af cyklusser for den stejleste nedstigningsalgoritme. Brug restraint_wt til at anvende fastholdelseskraften på opløste atomer, der er angivet af parametren fastholdelsesmaske. Kør derefter minimeringen på følgende måde: $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd BEMÆRK: Den anvendte strategi og de faktiske parametre kan variere alt efter ens egne præferencer. Detaljer og vejledning kan findes fra Amber manual og hjemmeside (<a href="https://ambermd.org/index.php" target="_blank">https://ambermd.org/index.php</a>)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varm systemet til 100 ps fra 0 K til 300 K indstilling en 10 kcal mol-1 Å-2 tilbageholdenhed på opløste atomer. For at gøre dette skal du indstille tempi = 0,0, temp0 = 300,0, dt = 0,002 ps, nstlim = 50000 og restraint_wt = 10 i inputfilen heat.in i den heat.in. Udfør opvarmningen med følgende kommando: $AMBERHOME/bin/sander -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
</li>
	<li>Ligevægt af systemet for 900 ps under en NPT ensemble; konstant antal atomer, temperatur (temp0 = 300,0) og tryk (ntp = 1), der styrer det med Berendsen-metoden (ntt = 1). Indstil en 9 Å afstand cutoff (cut = 9,0) for langtrækkende elektrostatiske interaktioner. Sænk gradvist den opløste atomfastholdelse til 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Kør den kvitteringsinputfil, der equil.in, der beskriver ovenstående parametre på følgende måde: $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
</li>
	<li>Afslutter ekvilibrering med en uhæmmet 5 ns simulering (set dt = 0,002 ps, ntslim = 2500000). $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
</li>
	<li>Kontroller, at systemet er ligevægtigt ved at undersøge temperatur-, tryk-, tætheden og energiværdierne. $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out xmgrace resumé. TEMP/DENSITY/ETOT/EPTOT/EKTOT
</li>
	<li>Produktionssimuleringen for 100 ns (set dt = 0,002 ps, ntslim = 50000000 i prod.in ) og gem konformationerhver 10 ps (ntwx = 5000). $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst
</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Besigtigelse<ol>
<li>Visualiser de konformiteter, der er udtaget prøver af under simuleringerne af vildtype og mutant EGFR-kinasesimuleringer, ved at åbne X.prmtop amber topologi-filerne og de tilsvarende prod.mdcrd-banefiler i VMD36. Ved hjælp af bekvemme sekundære struktur repræsentationer, analysere den samlede strukturelle dynamik af proteiner fra den registrerede bane. Se specifikke interaktioner mellem atomer/restkoncentrationer af interesse, såsom den kataalytisk væsentlige K745 - E762 salt bro.</li>
		<li>Du kan også gemme flere konformeringer, der er indsamlet under simuleringen i PDB-format, og åbne dem ved hjælp af Chimera-programmet. Overlejr strukturerne på den oprindelige eller mediale struktur ved hjælp af MatchMaker mulighed. Vis den oprindelige/mediale struktur i fast stof og resten af de justerede strukturer i falmet hvid. Denne fremgangsmåde gør det muligt at visualisere de registrerede strukturelle bevægelser med større klarhed. BEMÆRK: Forslag til effektive repræsentationer og behandling af kropslige ensembler fra MDS kan findes i Melvin et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>RMSD- og RMSF-analyse<ol>
<li>Beregne rod-middel firkantede afvigelse (RMSD) og rod-mean firkantede udsving (RMSF) beregninger med Cpptraj program38 at analysere den globale stabilitet af proteiner og undersøge fleksibiliteten af de forskellige strukturelle enheder. I rmsd.in- rmsf.in-inputfiler angives backboneatomer (for RMSD) og Cα-atomer (for RMSF) i den oprindelige struktur som reference for RMS-montering. I rmsd/rmsf.in-filerne importeres de gule topologifiler (parm X.promtop) og de tilsvarende banefiler (trajin prod.mdcrd). Kør derefter kommandoen Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Afbilde outputdataene til analyse.</li>
		<li>Alternativt kan du justere kropslige ensembler og farve hver rest baseret på Cα atom RMSD. Det gør du ved at åbne konformeringer i Chimera og justere dem med Matchmaker-indstillingen.<ol>
<li>Gå til Værktøjer → Afbildning → Gengive efter attribut. Vælg Rester af det kropslige ensemble og Cα RMSD som attributter, og klik på OK. Kædesporene af konformiteterne vil derefter blive farvet af blå → hvide →, henholdsvis afspejler regioner med høj, medium og lav strukturel stabilitet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse af brintbinding<ol>
<li>Analysere hydrogenbindingsinteraktionen mellem ATP og vildtype/ΔELREA EGFRs. Forbered en Cpptraj script, hbond.in, til at udføre denne opgave. Definer en hydrogenbinding med en donor-acceptorafstand på mindre end eller lig med 3,5 Å og en bindingsvinkel på over eller lig med 135°. Der skal kun foretages analyse for intermolekylære hydrogenbindinger med nointramol-variablen, dvs. Kør scriptet som Cpptraj -i hbond.in.</li>
		<li>Brug dette script til at vurdere intramolekylære interaktioner, for eksempel mellem restkoncentrationer K745 og E762, som er vigtige rester for EGFR kinase aktivitet. For at gøre dette skal du angive K745 som hydrogenbindingsdonor og E762 som hydrogenbindingstager i hbond.in og køre scriptet i overensstemmelse hermed.</li>
	</ol></li>
	<li>Overvågningsafstand mellem atomer<ol>
<li>Fjern afstanden mellem K745 og E762 ved at åbne forløb for vildtype og ΔELREA apo EGFRs i VMD. Vælg Cδ af Glu762 og Nz i Lys745 ved at klikke på → på → obligation . Overvåg afstanden under simuleringen ved at afbilde en graf med grafik → etiketter → → båndgrafen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beregninger af gratis energi<ol>
<li>Brug de molekylære mekanikker (MM-GBSA) modul39, der findes i AMBER-pakken, til beregning af de estimerede bindende frie energier mellem ATP og wild-type/ΔELREA EGFR'er og mellem aktivator og modtagerkinaser af vildtype/A702V EGFR'er. Sæt ATP som ligand og EGFR som receptor i ΔELREA-studiet. I A702V-undersøgelsen angives modtagerenskina som ligand og aktivatorkinase som receptor.</li>
		<li>Først forberede ligand, receptor og ligand-receptor komplekse PDB filer separat i springet program indstilling PBRadii værdien til mbondi2. I FBF-filerne skal du gemme gasfasens gule topologi (.prmtop) og koordinere (.inpcrd)-filer.</li>
		<li>Derefter skal du i mmgbsa-inputfilen mmgbsa.in, indstille igb = 2, saltcon = 0,1. Udfør bindende energiberegninger ved hjælp af simuleringernes bane, de forberedte receptor/ligand-gule filer og parametrene i mmgbsa.in med MMPBSA.py-scriptet, der er tilgængeligt i Amber på følgende måde: $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
</li>
		<li>Analysér outputdataene output.csvved at afbilde grafer.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+ErbB+signalling+network.">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGFR+family:+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases.">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li><li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer:+Clinical+implications.">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li><li>. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.cbioportal.org">https://www.cbioportal.org</a> (2020)</li><li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations.">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li><li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+(EGF/ErbB)+Family+of+Receptors.">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB/HER+protein-tyrosine+kinases:+Structures+and+small+molecule+inhibitors.">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li><li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation.">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma.">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li><li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer.">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li><li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers.">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li><li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+ERBB4:+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer.">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li><li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function.">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li><li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms.">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li><li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+and+protein+function.">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li><li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase.">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor.">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li><li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor.">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li><li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based+EGFR+T790M/L858R+Mutant+Inhibitors.">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li><li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints.">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li><li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes:+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity.">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li><li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain.">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li><li>. Release 2018-3: Maestro Available from: <a target="_blank" href="https://www.schrodinger.com/maestro">https://www.schrodinger.com/maestro</a> (2018)</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2018. , (2018).</li><li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water.">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li><li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field.">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li><li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VMD:+Visual+molecular+dynamics.">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li><li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+ensembles+in+structural+biology.">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMPBSA.py:+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations.">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li><li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS.">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors.">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li><li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4/ErbB4+Kinase.">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse fokuserer på at bruge molekylær dynamik simuleringer til at undersøge lokale og globale strukturelle ændringer, der opstår fra aktivering somatiske mutationer af EGFR kinase domæne. Selv om røntgenkrystalstrukturer af vilde og mutante EGFR'er giver uvurderlig strukturel indsigt, skildrer de en eller nogle få statiske fremstillinger. Iboende for ErbBs' biologiske funktion er imidlertid de nødvendige overgange mellem enzymatisk inaktiv og aktiv tyrosinkinase, der påberåber sig dynamiske ændringer i både strukturen og de intramolekylære interaktioner mellem kinasemonomerer. Der blev således foretaget MD-simuleringer for at undersøge EGFR-tyrosinkinasedomænets dynamiske karakter, herunder den vilde struktur, den indførte ΔELREA-sletningsmutation og A702V-mutationen. Disse simuleringer var en succes med at belyse disse mutationers sandsynlige rolle i strukturerne, og hvordan deres virkninger på kropsbygning af tyrosinkinasedomænet ville føre til de eksperimentelt observerede stigninger i EGFR-kinaseaktiviteten.
Et afgørende skridt i denne protokol er brugen af en relevant struktur til at vurdere virkningen af mutationen. En måde at vælge en relevant simulering input struktur er at visualisere placeringen af mutationen i den statiske 3D-struktur og undersøge dens mulige indvirkning med hensyn til de omkringliggende aminosyrer og strukturelle enheder. I denne undersøgelse, for eksempel, da A702V EGFR mutation er placeret på den sidetøbiske B segment, der danner den asymmetriske dimer interface, brugen af dimer struktur for simuleringen i modsætning til monomer er kritisk. Anvendelsen af en monomerisk struktur ville have udsat modtagerens menekskinase-segmentet for opløsningsmidlet, hvilket ville have frataget det fra de stabiliserende interaktioner, forstærket af mutationen til en større hydrofobe rest og interaktioner med isoleucin 941 fra C-lobe rester af aktivatorkinaser. Det er desuden værd at bemærke, at den 3D-struktur, der udgøres af koordinaterne i en FBF-fil, ikke nødvendigvis svarer til den biologisk relevante struktur, der bør anvendes til undersøgelse. FBF-koordinaterne svarer f.eks. Matricer i FBF-filen kan bruges (f.eks. inden for Chimera) til at rekonstruere de krystallografisk relaterede strukturer, som kan visualiseres for at identificere kæder, der svarer til den biologisk relevante 3D-struktur som rapporteret i den oprindeligepublikation 42. Et andet vigtigt trin i protokollen er at forberede simuleringsinputstrukturen korrekt, såsom opbygning af manglende aminosyrer i forskellige loop-regioner, og især hvor de er placeret i nærheden af mutationen. Selv om der findes mange EGFR-strukturer af vildtypen i FBF, er der kun et begrænset antal mutante EGFR-strukturer til rådighed. Derfor skal de mutante strukturer også modelleres; for en enkelt restmutation som A702V blev Chimera brugt til at mutere restproduktet; der henviser til, at modeller blev anvendt til ΔELREA-sletningsmutationen.
De forskellige parametre, der anvendes i simuleringsinputfilerne - for eksempel antallet af minimeringscyklusser, opvarmning af systemet til den ønskede temperatur på én gang eller i stedet opvarmes langsomt gennem flere mellemliggende temperaturer, tidsperioden for ligevægt og for produktionssimuleringer - kan ændres baseret på studiemolekylet, arbejdets formål og ens egne præferencer. Mens du udfører MD simuleringer, er det også almindeligt at komme på tværs af fejl, der kan opstå fra input-filer, spørgsmål i forbindelse med simulering software i brug eller endda en brugerfejl. Derfor er det meget vigtigt at forstå kilden til fejlene ved nøje at undersøge eventuelle fejlmeddelelser. De fleste simuleringsprogrammer har en postliste, hvor brugerne kan stille spørgsmål til softwareudviklerne og andre brugere, som de fleste problemer kan løses. Derudover yder brugermanualer betydelig hjælp til at forstå detaljerne i simuleringsprotokollen, herunder antagelser og begrænsninger. Selvom MD-simulering er et vigtigt redskab til at udforske molekylernes dynamiske egenskaber, skal du huske, at beregningsresultater skal evalueres omhyggeligt sammen med andre informationskilder for at vurdere deres gyldighed. Når det er muligt, arbejde sammen med forskere, der er eksperter på de proteiner, der undersøges, især hvor det er relevant våd-lab eksperimentelle undersøgelser er lavet, som tjener til at give resultater for strukturel fortolkning samt at foreslå eksperimenter, der kan foretages baseret på strukturelle observationer for at teste hypoteser.
I denne undersøgelse var protokollen effektiv til at undersøge de dynamiske strukturelle virkninger af ΔELREA- og A702V-mutationerne på EGFR-kinasestrukturerne. Simuleringerne viste, at ΔELREA fastholder de funktionelt væsentlige αC helix og fremmer et konformationsskift fra den inaktive kinase til en stabiliseret aktiv kinase. Simuleringsresultaterne understøttes uafhængigt af data om lægemiddelrespons, der påviste virkningerne af tyrosinkinasehæmmere på lungekræftcellelinjer med ΔELREA-sletningsmutationen og den vilde EGFR, hvor der blev rapporteret større hæmning af lægemidler, der anerkendte den aktive kinase kropsbygning, for ΔELREA end for egfr12af vildtypen. Med A702V-mutationen indikerer MD-simuleringerne i forhold til den vilde type øget stabilisering af aktivator-modtagerkinasegrænsefladen samt højere affinitet mellem aktivator og modtagerkinase for hinanden, sammen understøtter vedligeholdelsen af den aktiverede kropsbygning af EGFR-kinase. A702V-mutationen, der er placeret på den sammenkædiske B-segment af modtagerens kinase, vil øge hydrofobe interaktioner med aktivatorkinase, hvilket vil forlænge varigheden af den aktiverede tilstand. A702V-mutationen understøtter absence celleoverlevelse uden vækstfaktor og blev identificeret i en in vitro-screening for EGFR-mutationer9.

Den humane epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie (ErbB) af receptor tyrosin kinaser (RTKs) omfatter fire medlemmer - EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 og ErbB4/HER4. ErbB-receptorerne regulerer grundlæggende cellulære processer såsom cellevækst og spredning, differentiering, migration og overlevelse1,2, og er således potente proto-onkogener. Afvigende aktivitet af ErbB receptorer, især EGFR og ErbB2, har været ofte forbundet med menneskelige kræftformer gør ErbB receptorer centrale mål for kræft terapeutiske2,3.
Flere somatiske ændringer af ERBB-gener er blevet rapporteret fra humanemaligniteter 3,4,5. De bedst karakteriserede eksempler omfatter tilbagevendende, aktiverende punktmutationer og korte in-frame sletninger i EGFR kinase domæne i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Disse EGFR-mutationer udgør de vigtigste drivkræfter bag kræftvækst og forudsiger følsomhed over for EGFR rettet modkræftlægemidler6,7,8. Men i de fleste kræftformer forekommer somatiske mutationer i EGFR uden for disse tilbagevendende "hotspots" og fordeles over hele receptorens 1210-restspænd. Faktisk har de fleste af resterne langs EGFR primærsekvensen vist sig at være muteret i human kræft9. Ikke desto mindre er den funktionelle betydning af langt størstedelen af de kræftrelaterede EGFR-mutationer fortsat ukendt, bortset fra de få hotspots.
ErbBs' monomeriske struktur består af et stort aminoterminal ekstracellulært domæne, efterfulgt af en enkelt transmembrane helix, der fører til det intracellulære tyrosinkinasedomæne og C-terminal haleregionen, der indeholder dockingsteder for intracellulære signalproteiner. Ligand binding udløser en dramatisk konformationsændring i det ekstracellulære domæne, som letter dannelsen af receptordæmpere ved at udsætte dimeriseringsarmene, der symmetrisk krydser over hinanden og interagerer med deres aromatiske/hydrofobe overflader. Ved receptordysningsdannelse kommer tyrosinkinasedomæderne asymmetrisk i kontakt (figur 1), hvilket resulterer i aktivering af de kinaser, der fosforlater receptormonommeres C-terminale haler og efterfølgende aktivering af nedstrømssignalering10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> Figur 1: Struktur af EGFR-dimer. EGFR dimerizes når de ekstracellulære domæner binde vækstfaktor (EGF, epidermal vækstfaktor). Modtageren kinase domæne aktiveres derefter gennem asymmetrisk interaktion med aktivator kinase domæne, og C-terminal haler er autophosphorylated på tyrosin rester (Ændret fra Tamirat et al.12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
På grund af de dynamiske strukturelle <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> omorganiseringer, der opstår under monomerdæmperovergangene, sammen med kinaseaktivering, der er forbundet med dannelsen af en asymmetrisk dimer, kan mutationer langs receptorstrukturens fulde længde potentielt have en effekt på receptorfunktionen. Her beskriver vi flere eksempler fra vores tidligere undersøgelser, hvor modellering af mutationen og visualiseringen var tilstrækkelig til at forklare konsekvenserne for funktion.
Eksempel 1: En rapporteret mutation, D595V i ErbB413, førte til øget ErbB4 dimerization og fosforylering14. Visualisering af placeringen af mutationen var en kritisk faktor i forståelsen af de observerede funktionelle virkninger: D595V opstod ved den symmetriske crossover af de dimeriske arme af ectodomain (Figur 2A). Armene er i vid udstrækning aromatiske og hydrofobe, og udskiftning af polære aspartinsyre med valin forventes at øge den "klæbrige" hydrofob interaktioner, stabilisere dimer og dermed øge længden af tid, når fosforylering finder sted14. Det var en overraskelse i starten at finde aspartate i hver arm, men set i bakspejlet kunne man tænke på det som en timing mekanisme for aktivitet, hvor polarsyre sidekæder reducere affinitet og levetid af intakt dimer og dermed begrænse kinase-medieret fosforylering og signalering. Udskiftning med valin ville derefter fjerne denne sikkerhedsforanstaltning ved yderligere at stabilisere ErbB4 dimer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> Figur 2: Placering af en ErbB4-aktiverende mutation og mutationer, der producerer kinasedød ErbB4. a) D595 (aktivering af D595V-mutationen) er placeret på erbBB4-modellens aromatiske/hydrofobiske dimeriske arme våben associeret på vækstfaktor bindende; (rester i nærheden vises som pinde). (B) I ErbB4 hjælper G802 (inaktiverende G802dup mutation) med at danne bindelommen omkring adeninringen af ATP og katalytisk D861 (inaktivering af D861Y-mutation) binder både Mg2+ (ikke vist) og γ-fosfatgruppen AF ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Eksempel 2: Man kunne forudse, at somatiske mutationer, der er målrettet ATP-bindende sted for kinase domæne ville ændre eller fjerne enzymatisk aktivitet, der fører til en nedsat eller kinase-døde receptor ude af stand til at signalere. Ud af ni rapporterede mutationer fra patienter med bryst, gastrisk, kolorektal eller NSCLC15, to af de ni mutationer, når de blev testet havde stærkt formindsket fosforylering aktivitet16: G802dup (G → GG) og D861Y. Begge inaktiverende somatiske mutationer blev fundet inden for ATP bindende sted af tyrosin kinase domæne struktur(Figur 2B):fleksibel glycin, duplikeret, ville ændre adenin ring site og små aspartisyre erstattet af volumin tyrosin nær terminal fosfater ville fysisk forhindre Mg2 +-ATP fra bindende. Dog da ErbB4 kan danne en heterodimer med ErbB2 - ErbB2 ikke binder en vækstfaktor og afhænger af tilknytning til en ErbB, der gør for at heterodimerize - ErbB2 (aktiv)-- ErbB4 (kinase-døde) heterodimer ville stimulere celleprolifererende via Erk / Akt signalering vej endnu celler ville ikke differentiere på grund af kinase-døde ErbB4 og mangel på STAT5 pathway aktivering16.
I nyere undersøgelser viste det sig, at ErbBs dynamiske bevægelser var relevante for at forstå nogle mutanters virkninger på ErbB-funktionen, især mutationer, der forekommer inden for tyrosinkinasedomænet. Den tyrosin kinase domæne består af en N-lap (hovedsagelig β-ark) og C-lap (stort set alfa spiralformet), som er adskilt af katalytisk sted, hvor ATP binder. N-lap omfatter αC helix og P-loop, mens aktivering (A-loop) og katalytiske sløjfer er til stede i C-lap17,18,19. Krystal strukturer af tyrosin kinase domæne afslørede to inaktive konformiteter, de fleste strukturer har Src-lignende inaktiv tilstand. I den aktive kropsbygning er den katalytiske aspartat af A-loop-punkterne mod ATP-bindingsstedet, og αC-helixen er orienteret mod ATP-bindingslommen ("αC-in"-kropsbygning), der danner en stærk glutamat-lysinion-par-interaktion.
Da ErbBs og det komponentkinedomæne er meget dynamiske enheder, og især i tilfælde, hvor mutationens virkninger på funktion og biologisk aktivitet sandsynligvis er tæt forbundet med Erbbbs' kropslige tilstande, er det vigtigt at vurdere mutationer med hensyn til de forskellige dynamiske ændringer, de ville opleve. Røntgenkrystalstrukturer af ErbBs giver statiske øjebliksbilleder af 3D-strukturen, som måske eller måske ikke er relevante for at forstå de dynamiske konsekvenser af en mutation. For at kunne undersøge de dynamiske ændringer, der svarer til det "energilandskab", der er tilgængeligt for en tredimensionel (3D) struktur, anvendes molekylære dynamikuleringer (MD) i vidudstrækning 20. I tilfælde af mutationer, der ville føre til lokale konformationelle ændringer inden for tyrosin kinase domæne eller stabilisering af et kompleks, simuleringer i rækkefølgen af 100 ns kan være tilstrækkelig. Men større konformationelle ændringer (f.eks overgange mellem den aktive og inaktive konformation af kinase domæne) kræver en længere simuleringstid - i størrelsesordenen mikrosekunder21.
Med hensyn til den protokol, der er beskrevet nedenfor, overvejer vi to aktiverende mutationer inden for tyrosinkinasedomænet (figur 3). Begge mutationer er placeret inden for kinase domæne på steder, der oplever lokale konformationelle ændringer, der dikterer, om kinasen er aktiv eller ej, og dermed MD simuleringer blev anvendt i begge tilfælde. I det første tilfælde, vi overveje ændringer, der direkte påvirker ATP bindende site og katalysator maskiner i EGFR modtager kinase domæne, specifikt undersøge konsekvenserne af en exon 19 sletning mutation, der er meget involveret i NSCLC4,7. Δ746ELREA750-mutationen, som reducerer længden af β3-αC-løkken forud for αC-helixen - den helix, der bevæger sig mod bindingen/det aktive sted ved kinaseaktivering og deltager i at danne det kritiske elektrostatiske samspil mellem Helix og K745 ved at placere lysinen til interaktion med ATP - prædisponerer domænet til aktivering12. I det andet tilfælde, vi anser A702V mutation af EGFR, vist sig at være en ny gevinst-of-funktion aktiverende mutation afsløret af iScream platform9 og identificeret i en NSCLC patient22. Alanine-702 på modtageren kinase domæne er placeret på sidekvarma segment B på grænsefladen af modtageren og aktivator kinase domæner, hvor denne asymmetriske kinase dimer kompleks og kinase kropsbygning ændringer er nødvendige for aktivering9.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> Figur 3: EgfR's asymmetriske kinasedomænegred. A702V-mutationen vil blive placeret på aktivator- og modtagerkinasedomædernes kritiske grænseflade, der støder op til αC-helix og tæt på isoleucin 941 af aktivatorkinase. Konformationelle ændringer induceret ved dannelse af den asymmetriske dimer føre til kinase aktivering. Β3-αC-løkken, der indeholder ELREA-sekvensen, går umiddelbart foran αC-helixen. under aktivering bevæger αC-helixen sig indad mod ATP-bindingsstedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

Talrige somatiske mutationer, der forekommer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie (ErbB) af receptor tyrosin kinaser (RTK) er blevet rapporteret fra kræftpatienter, selv om relativt få er blevet testet og vist sig at forårsage funktionelle ændringer i ErbBs. ErbB-receptorerne er nedtonede og aktiveres ved ligandbinding, og dynamiske konformationsmæssige ændringer af receptorerne er iboende til induktion af downstream-signalering. For to mutationer, der eksperimentelt er påvist for at ændre EGFR-funktion, A702V og Δ746ELREA 750-sletningsmutationen, illustrerer vi i følgende protokol, hvordan molekylær dynamik (MD) simuleringer kan sonde den (1) kropslige stabilitet af den mutante tyrosin kinasestruktur sammenlignet med egfr af vildtypen;750 2) strukturelle konsekvenser og kropslige overgange og deres forhold til observerede funktionelle ændringer 3) mutationers virkninger på styrken af bindende ATP samt til binding mellem kinasedomæderne i den aktiverede asymmetriske dimer og (4) mutationers virkninger på nøgleinteraktioner inden for EGFR-bindingsstedet i forbindelse med det aktiverede enzym. Protokollen giver en detaljeret trinvis procedure samt vejledning, der kan være mere generelt nyttige til undersøgelse af proteinstrukturer ved hjælp af MD simuleringer som et middel til at sonde strukturelle dynamik og forholdet til biologiske funktion.

Den beskrevne protokol blev anvendt til at undersøge de strukturelle virkninger af ΔELREA- og A702V-mutationerne på EGFR-kinasestrukturen. En anvendelse af protokollen var at undersøge mutationers indvirkning på den lokale strukturelle/konformationelle stabilitet ved at beregne RMSD- og RMSF-værdier fra MD-simuleringerne. Da A702V-mutationen er placeret ved segmentet sammen med den sammentrede B-segment, blev RMSD for dette segment af modtagerens kinase i forhold til startstrukturen beregnet for både de vilde og A702V EGFR'er. Resultatet (figur 4A) viste, at den juxtramembrane B-segment af mutanten har øget kropslig stabilitet under 100 ns simuleringen (gennemsnitlig RMSD 0,7 Å - 95% konfidensinterval (CI) 0,009) sammenlignet med egfrkine-domænet af vildtypen (gennemsnitligt RMSD 1,1 Å - 95% CI 0,001). Dette er meget sandsynligt resultatet af de strammere hydrofobe interaktioner på dimer interface på grund af udskiftning af alanin 702 (methylgruppe sidekæde) til en bulkier hydrofob rest, valin (isopropyl gruppe sidekæde), hvilket fører til øget hydrofobe interaktioner af V702 på modtageren kinase domæne med isoleucin 941 af aktivator kinase domæne.
ΔELREA-mutationen er placeret ved β3-αC-løkken, der støder op til den funktionelt kritiske αC helix. αC-helix'ens kropsbygning er nøglen til skift mellem egfrkinases aktive og inaktive tilstande. αC-helixens konformationsstabilitet i aktiv tilstand blev vurderet ved undersøgelse af RMSF'en over Cα-atomerne af restkoncentrationer i helix under MD-simuleringer (figur 4B): samlet set der er lavere udsving i mutanten (gennemsnitlig RMSF 1,1 Å - 95% CI 0,4) i forhold til vildtypen (gennemsnitlig RMSF 1,5 Å - 95% CI 0,57) med den højeste forskel i udsving, der registreres for N-terminalresterne. De prøver af henholdsvis konformationer, der er overlejret på medianstrukturen for vildlignende kinasedomæne og ΔELREA kinase-domænet, understøtter også disse resultater(figur 4C): både wild-type- og ΔELREA-kinase-domænerne har generelt samme stabilitet for de overlejrede konformiteter med undtagelse af β3-αC-løkken og αC-helix, som klart er mere stabile i ΔELREA EGFR. Disse resultater viser, at sletning af ELREA-sekvensen begrænser bevægelsen af den aktive tilstand αC helix, og dermed fastholde og dermed stabilisere den aktive kropsbygning. Da αC-helix desuden er en del af den asymmetriske dimergrænseflade, vil fastholdelsesanordningerne på αC-helix i mutanten højst sandsynligt stabilisere den asymmetriske dimer og forlænge varigheden af den aktiverede tilstand.
En anden anvendelse af protokollen er at undersøge adfærd centrale intra- og intermolekylære interaktioner, der finder sted under simuleringen. Samspillet mellem K745 og E762, som er afgørende for EGFR's enzymatiske blev analyseret for både den aktive form wild-type og ΔELREA EGFR kinase ved at måle den procentdel af belægningen af brintbindinger dannet mellem sidekædepolare atomer af de to restkoncentrationer under MD simuleringer (Figur 5A): denne centrale elektrostatiske interaktion blev dannet oftere i ΔELREA kinase domæne i forhold til wild-type kinase domæne, på grund af den mere stabile αC helix, der rummer E762. Samspillet mellem Mg2+-ATP og wild-typen og ΔELREA EGFR kinase-domænerne (figur 5B) under simuleringen blev også vurderet (figur 5C): Antallet af brintbindinger var større forΔELREA (gennemsnitsværdi 4,0 - 95% CI 0,03) end for egfr af vildtypen (gennemsnitsværdi 3,2 - 95% CI 0,04). En yderligere analyse af brintbindingerne viste, at K745 interagerer hyppigere med PHosphatgrupperne i ATP i ΔELREA EGFR, som er knyttet til den mere stabile K745-E762-interaktion, der er konstateret i simuleringen af ΔELREA mutant EGFR kinase domæne.
MD simuleringer som beskrevet i protokollen er også nyttige til at vurdere den relative frie energi binding for protein-protein og protein-ligand interaktioner. Bindingsenergierne mellem aktivator- og modtagerkinasedomæderne af vildtype og A702V EGFR'er og mellem ATP og wild-typen og ΔELREA mutant EGFR kinase domæner blev beregnet ud fra molekylærmekaniker generaliserede MmGBSA-beregninger (Born Surface Area) (Figur 6A):A702V-mutanten producerede en lavere gennemsnitlig ΔG-bindeværdi (gennemsnitlig ΔGbind bind = -76 kcal/mol - 9 5% CI 0,47), der repræsenterer mere gunstige dimer interaktioner, i modsætning til wild-type EGFR domæne (gennemsnit ΔGbinde = -61 kcal / mol - 95% CI 0,61). Denne observation er i overensstemmelse med den mere stabile sammenkædning B-segment og strammere dimer interface på grund af øget hydrofobe interaktioner observeret for A702V EGFR kinase domæne. For ATP's binding til wild-typen og ΔELREA EGFR kinase-domænerne (figur 6B) forudsiger MMGBSA-beregninger stærkere ATP-binding med ΔELREA-mutanten (gennemsnitlig ΔGbind -5 7 kcal/mol - 95% CI 0,43) i forhold til egfr af vildtypen (gennemsnitlig ΔG bind -48 kcal/mol - 95% CI 0,33).bind Dette resultat er i overensstemmelse med det større antal hydrogenbindinger, der er registreret mellem ATP og ΔELREA EGFR (figur 5C) i forhold til det vilde domæne.
Protokollen kan også anvendes til at undersøge kropslige ændringer observeret under en simulering. I den aktuelle undersøgelse blev virkningerne af ΔELREA-mutationen på den inaktive EGFR-kropsbygning undersøgt ved besigtigelse og superpositionering af de prøveemne konformationer fra simuleringen. Analysen afslørede en aktiv bevægelse af αC-helix i ΔELREA EGFR kinase-domænet (figur 7A), en strukturel ændring, der forventes under overgangen til aktiv tilstand. I modsætning hertil fastholdt αC-helix af inaktiv EGFR af vildtypen sin oprindelige kropsbygning (figur 7B). Således md simuleringer støtte forslaget om, at sletning mutation, vist eksperimentelt at øge kinase aktivitet40,41, fremmer en kropslig skift fra den inaktive kinase til den aktive tilstand.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> Figur 4: Vildtype- og mutant konformationsstabilitet for det aktive EGFR-kinasedomæne under MD-simuleringer. a) RMSD (backbone atomer) over sidetingtamembranE B segment af wild-type (blå) og A702V (rød) modtager kinase domæne. b) RMSF (Cα atomer) over rester af αC-helix: vildtype (blå) og ΔELREA (guld). cC) Overlejret prøveoverensstemmelser af vildtype (venstre) og ΔELREA (til højre) EGFR kinase domæne kædespor, der er farvet på basis af RMSD (Cα-atomer) af hver rest med hensyn til medianstrukturen. Farvelægning spænder fra blå til hvid til rød, der repræsenterer regioner med høj til lav kropslig stabilitet. Bemærk, at de "frie" N-terminalregioner i det isolerede kinasedomæne, farvet rødt, ikke ville udvise dette niveau af mobilitet i den intakte EGFR-struktur. Tal tilpasset fra Chakroborty et al.9 (Figur 4A gengivet med tilladelse fra Journal of Biological Chemistry) og Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> Figur 5: Nøglefunktioner, der ses i den aktive modtagerkinase under MD-simuleringer: Saltbroen K745-E762, αC-helixen og interaktioner med ATP. a)Procentdel af K745-E762-interaktionen under simulering af de vilde (blå) og ΔELREA (guld) EGFR-kinase-områder. bB) Restkoncentrationer af vildtypen og ΔELREA mutant, der interagerer med ATP (pinde). Mg2+ (grøn) koordinater med ATP og D855. cC) Antallet af brintbindinger, der dannes af ATP med både wild-typen og ΔELREA EGFR kinase-domænerne under MD-simuleringer. Figur fra Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> Figur 6: Lavere relative frie energier af binding er observeret for mutant kinase domæner under simuleringerne. AA) Bindende energier beregnet for samspillet mellem aktivator og modtager kinase domæner af wild-type (blå) og A702V (rød) EGFRs. BB) ΔGbinder ATP til wild-type (blå) og ΔELREA (guld) EGFR kinase domæner. Tal tilpasset fra Chakroborty et al.9 (Figur 6A gengivet med tilladelse fra Journal of Biological Chemistry) og Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> Figur 7: Overlejrede konformeringer fra det vilde egfr-kinasedomæne. Kropsbygning af αC helix og A-loop helix af (A) vildtype (medianstruktur i blåt) og (B) ΔELREA EGFRs (guld). Andre prøveformeringer, falmet hvid; oprindelige strukturer forud for MD simuleringer, pink. Figur fra Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Formålet med denne protokol er at anvende molekylærdynamiksimuleringer til at undersøge de dynamiske strukturelle ændringer, der opstår som følge af aktivering af mutationer af EGFR-kinaseproteinet.

Dechifrere de strukturelle virkninger af aktivering af EGFR somatiske mutationer med molekylær dynamik simulering

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

Molekylær dynamisk simulering er en beregningsteknik, der kan bruges til at udforske molekylære bevægelser og kan afsløre konformationelle ændringer afgørende for at forstå biokemiske og cellulære funktion. Det er vanskeligt at undersøge de dynamiske bevægelser, der er tilgængelige for et makromolekyle. Ved at bruge resultaterne fra molekylære dynamiske simuleringer i forbindelse med eksperimentelle data kan der foretages en vurdering af deres funktionelle betydning.Vi vil demonstrere ved hjælp af molekylære dynamiske simuleringer, hvordan mutationer observeret hos kræftpatienter påvirker EGFR målretning bekræftelser og ligand bindende. Hvis du vil forberede den aktive EGFR-struktur af vildtypen apo active EGFR, skal du åbne Kymera-visualiseringsprogrammet, og klik på Hent efter ID under filmenuen.Vælg databasen Protein Data Bank og angiv Protein Data Bank 2GS2-koden. For at opbygge de manglende strukturelle 2GS2-elementer skal du erhverve disse segmenter fra andre EGFR-strukturer.For at konstruere de fem rester glutamat 746 til alanin 750 ELREA sletning i EGFR, skal du klikke favorit, sekvens, og vise sekvens for at åbne wild-type 2GS2 sekvens. Og i det resulterende sekvensvindue skal du klikke på Rediger og tilføj sekvens for at vælge sletnings mutant FASTA-formatsekvensen. Vælg strukturen, modellen eller homologien i justeringsvinduet.I pop op-vinduet skal du angive 2GS2-kompositstrukturen som skabelon og mutantsekvensen som den forespørgsel, der skal modelleres, og vælg derefter en mutant model fra de resulterende modeller baseret på zDOPE-scoren og den visuelle inspektion. For at forberede den vilde apo inaktive EGFR kinase struktur, åbne Protein Data Bank struktur 2GS7 og tilføje de manglende segmenter fra de andre EGFR strukturer, modellering sletning mutant form som påvist. For at forberede den ATP-bundet wild-type aktive EGFR kinase struktur, bruge Protein Data Bank struktur 2ITX som den vigtigste struktur, opbygge de manglende segmenter ved hjælp af andre EGFR strukturer og modellering sletning mutant form ved hjælp af modeler som påvist.For at konstruere den vilde EGFR asymmetrisk dimer struktur, åbne 2GS2 i Kymera og klik værktøjer, højere orden struktur, og enhed celle til at konvertere strukturen til den biologiske samling, der indeholder aktivator og modtager kinaser i det asymmetriske arrangement. Vælg 2GS2-strukturen, og angiv nogle kopier, og vælg og gem derefter en enkelt asymmetrisk dimer fra de mange kopier af dimeren, der er resultatet af symmetrihandlingerne. For at bygge alanin 702 valin mutant, skal du vælge værktøjer, struktur redigering, og rotamers at erstatte alanin 702 med valin.Åbn strukturerne i Maestro, og klik på proteinforberedelsesguideknappen, vælg derefter tilføj brintatomer og udfyld manglende sidekædeatomer, og klik på forproces. For at bestemme protonation tilstande af ionizable rester på pH 7.0, klik forfine og bruge PROPKA at optimere orienteringen af asparagine, glutamin, og histamin rester til brint limning, derefter minimere strukturen. For at opsætte simuleringssystemet skal du åbne LEAP-programmet og importere Amber FF14SB-kraftfeltet og TIP3P-vandmolekyler.For de ATP-bundne systemer skal du importere parametre for ATP og indlæse strukturen. Solvate strukturen i en okahedral kasse med eksplicit TIP3P vandmolekyler, der strækker sig 10 angstroms i alle retninger fra overfladen atomer af proteinet. Kontroller selesystemet og tilsæt de nødvendige ioner til at neutralisere det.For tilstrækkeligt model biomolekylære systemer, tilføje yderligere natrium og klorid atomer til simulering boksen for at bringe systemet salt koncentration til 0,15 kindtand, derefter generere og gemme topologi og koordinere filer af systemet til at tjene som input til den efterfølgende produktion simulering. Brug Amber, i første omgang energi minimere simuleringssystemet til at omgå eventuelle ugunstige konfigurationer. I inputfilen minimering skal du justere den maksimale cyklusvariabel for den samlede minimeringscyklus og antallet af cyklusser for at angive antallet af cyklusser for den stejleste nedstigningsalgoritme.Brug fastholdelsesvægtvariablen til at anvende fastholdelseskraften på de opløste atomer, der er angivet i begrænsningsmaskeparameteren. Udfør minimering i flere trin, gradvist sænke tilbageholdenhed anvendes på de opløste atomer fra 25 til 0 kilokalorier pr mole angstrom firkantet, derefter bruge kommandoen til at køre minimering. Varm systemet i 100 picoseconds fra 0 til 300 Kelvin og bruge kommandoer til at indstille en 10 kilocalorie molar per kvadratisk angstrom tilbageholdenhed på opløste atomer.Brug derefter kommandoen til at udføre opvarmningen. Equilibrate systemet for 900 picoseconds under en isotermisk isobaric ensemble og sæt en ni angstrom afstand cutoff for langtrækkende elektrostatiske interaktioner, gradvist sænke opløst atom tilbageholdenhed til 0,1 kilocalorie per muldvarp angstrom firkantet og færdiggøre equilibration med en uhæmmet fem nanosekund simulering. Kør udligningen med kommandoen som angivet.Juster teksten, så produktionssimuleringen kan udføres for 100 nanosekunder med de konformeringer, der gemmes hvert 10 picosesekunder, og kør derefter simuleringen med kommandoen som angivet. For at visualisere kropsbygningsprøven under egfr-kinasesimuleringerne af vildtypen og mutanten skal du åbne Amber-topologifilerne og de tilsvarende banefiler i Visual Molecular Dynamics. Og ved hjælp af bekvemme sekundære struktur repræsentationer, analysere den samlede strukturelle dynamik af proteiner fra den registrerede bane.Derefter se specifikke interaktioner mellem atomer og rester af interesse, såsom katalytisk væsentlige lysin 745-glutamat 762 salt bro. Du kan også gemme flere konformeringer, der er udtaget prøver af under simuleringen i Protein Data Bank-format, og åbne konforme overensstemmelser i Kymera. Brug matchmaker mulighed for at overlejre strukturerne på den oprindelige eller median struktur og vise medianstrukturen i fast og resten af de justerede strukturer i falmet hvid for at tillade visualisering af de registrerede strukturelle bevægelser med mere klarhed.For at analysere den globale stabilitet af de vilde og mutante EGFR'er og undersøge fleksibiliteten i de forskellige strukturelle enheder, skal du importere Amber-typologien og de tilsvarende banefiler. I rod gennemsnitlige kvadratafvigelse inputfil, angive rygraden atomer af den oprindelige struktur som reference for roden gennemsnitlige firkantet montering. I rod gennemsnitlige firkantede udsving input-fil, angive C-alpha atomer af den oprindelige struktur som reference for roden gennemsnitlige firkantede montering.Kør derefter analysen med CPPTRAJ-programmet, og afbild outputdataene. Alternativt, at tilpasse kropslige ensembler og farve hver rest baseret på C-alpha atom rod gennemsnitlige firkantafvigelse, åbne konformeringer i Kymera og tilpasse dem med matchmaker mulighed. Vælg værktøjer, afbildning og gengivelse efter attribut.Vælg rester af de konformationelle ensembler, og angiv c-alpha-rodafslutningen som attributterne og klik derefter på OK. Kædesporene af konformiteterne vil være farvet blå, hvid eller rød, der afspejler de områder med henholdsvis høj, middel og lav strukturel stabilitet. For at analysere brintbindingsinteraktionerne mellem ATP og både egfr-filer af vildtype og sletning skal du udarbejde et CPPTRAJ-script til at udføre denne opgave. Analysen for de intermolekylære hydrogenbindinger angives kun med nointramolvariablen, og der defineres en hydrogenbinding med en donortagerafstand på mindre end eller lig med 3,5 angstroms og en bindingsvinkel på over eller lig med 135 grader.For at vurdere de intramolekylære interaktioner, for eksempel mellem katalytisk vigtige lysin og glutamatrester, skal lysin angives som brintdonor og glutamat som acceptorrester og køre scriptet som angivet for at muliggøre analyse af resultatet. For at beregne de bindende frie energier mellem ATP og både wild-type og sletning EGFR'er, forberede gasfase ligand receptor og ligand receptor kompleks Protein Data Bank filer i LEAP-programmet og sæt ATP som ligand og EGFR som receptor. Indstil den generaliserede fødte radioværdi til M Bond I2. Derefter generere Amber topologi og koordinere filer til gasfasen Protein Data Bank filer.På samme måde skal modtagerens kinase angives som ligand og aktivatorkinase som receptor, for at beregne bindende frie energier mellem aktivatoren og modtagerkiniderne af vildtype og alanin 702 vafliske EGFR'er, angive modtagerens kinase som ligand og aktivatorkinase som receptor og gemme de tilsvarende topologi- og koordinatfiler. Forbered en molekylær mekanik generaliseret født overfladeareal input fil og indstille IGB værdi til to og saltcon til 0,1. Derefter ved hjælp af mmpbsa.py script tilgængelig i Amber, skal du indtaste kommandoen som angivet for at udføre bindingen energi beregninger og analysere output data. Under denne repræsentative 100 nanosekundsimulering viste alanin 702 valin mutant øget kropslig stabilitet i sidetrium B-segmentet sandsynligvis på grund af strammere hydrofobe interaktioner sammenlignet med egfr af vildtypen. Den alanin 702 valin mutant også udstillet en lavere fri energi bindende mellem aktivator og modtager kinaser i forhold til den vilde type EGFR, der repræsenterer mere gunstige dimer interaktioner, der opretholder den aktive EGFR kinase kropsbygning.Simulering af sletningsmutationen resulterede i lavere C-alpha atomudsving af den funktionelt centrale alfa C-helix sammenlignet med den vilde EGFR, hvilket forlængede tidspunktet for EGFR's aktive tilstand. Sletningsmutationen resulterede også i hyppig dannelse af brintbindinger mellem sidekædens polære atomer af lysin 745 og glutamat 762, et vigtigt samspil for EGFR enzymatisk aktivitet sammenlignet med vildtype EGFR. Desuden var antallet af brintbindinger mellem ATP og EGFR større for sletningse mutanten end for EGFR af vildtypen.Sletningen mutation resulterede også i en aktiv bevægelse af EGFR inaktive tilstand alpha C-helix, en strukturel ændring forventes under overgangen til den aktive tilstand. I modsætning hertil opretholdt alfa C-helix af vildtype inaktiv EGFR sin oprindelige kropsbygning. For at vurdere virkningen af mutationerne er det afgørende at vælge de relevante konformationelle tilstande i strukturerne og for at forberede og ligevægte disse strukturer.Det er vigtigt at kombinere molekylære dynamiske simuleringer med eksperimentelle undersøgelser, da synergien mellem disse teknikker gavner fortolkningen af resultaterne og kan informere yderligere våde laboratorieforsøg.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion af rekombinante PRMT-proteiner ved hjælp af Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering af dynamikken i tværbundne og enkelte mikrotubuli in vitro ved hjælp af TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...