Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

מחקר זה ממומן על ידי מענקים ל-M.S.J מהאקדמיה של פינלנד (308317, 320005), קרן סיגריד יוסליוס וטור, ג'ו ופנטי בורג קרן זיכרון, וK.E. מהאקדמיה של פינלנד (274728, 316796), הקרן לסרטן של פינלנד, ואת בית החולים המרכזי של אוניברסיטת טורקו. M.Z.T. ממומן על ידי רשת הדוקטורט Åbo Akademi של ביולוגיה מידע ומבנית. אנו מודים למרכז ה-IT של CSC למדע על משאבי המחשוב ועל ד"ר Jukka Lehtonen על תמיכת ה-IT תחת רשת הביו-אינפורמטיקה של פינלנד; ו-Biocenter פינלנד רשת תשתית ביולוגיה מבנית.

<ol>
	<li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+ErbB+signalling+network.">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGFR+family:+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases.">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li><li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer:+Clinical+implications.">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li><li>. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.cbioportal.org">https://www.cbioportal.org</a> (2020)</li><li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations.">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li><li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+(EGF/ErbB)+Family+of+Receptors.">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB/HER+protein-tyrosine+kinases:+Structures+and+small+molecule+inhibitors.">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li><li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation.">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma.">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li><li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer.">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li><li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers.">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li><li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+ERBB4:+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer.">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li><li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function.">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li><li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms.">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li><li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+and+protein+function.">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li><li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase.">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor.">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li><li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor.">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li><li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based+EGFR+T790M/L858R+Mutant+Inhibitors.">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li><li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints.">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li><li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes:+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity.">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li><li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain.">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li><li>. Release 2018-3: Maestro Available from: <a target="_blank" href="https://www.schrodinger.com/maestro">https://www.schrodinger.com/maestro</a> (2018)</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2018. , (2018).</li><li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water.">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li><li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field.">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li><li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VMD:+Visual+molecular+dynamics.">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li><li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+ensembles+in+structural+biology.">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMPBSA.py:+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations.">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li><li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS.">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors.">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li><li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4/ErbB4+Kinase.">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מתמקד בשימוש בסימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לחקור שינויים מבניים מקומיים וגלובליים הנובעים מהפעלת מוטציות סומטיות של תחום קינאז EGFR. למרות מבני גביש רנטגן של סוג בר ומוטנט EGFRs לספק תובנה מבנית רבת ערך, הם מתארים אחד או כמה ייצוגים סטטיים. עם זאת, הטבוע בתפקוד הביולוגי של ErbBs הוא המעברים הדרושים בין kinase טירוסין פעיל אנזימטית פעיל, הפעלת שינויים דינמיים הן במבנה אינטראקציות פנים מולקולקולרי בין מונומרים קינאז. סימולציות MD בוצעו כך כדי לחקור את האופי הדינמי של תחום הקינז טירוסין EGFR, כולל מבנה מסוג בר, מוטציה המחיקה 3 002V הציג, ואת מוטציה A702V. סימולציות אלה הצליחו בהדרת התפקיד הסביר של מוטציות אלה במבנים ואיך ההשפעות שלהם על ההתאמה של תחום קינאז טירוסין יובילו לעליות שנצפו באופן ניסיוני בפעילות קינאז EGFR.
צעד מכריע בפרוטוקול זה הוא השימוש במבנה רלוונטי כדי להעריך את ההשפעה של המוטציה. דרך אחת לבחור מבנה קלט סימולציה רלוונטי היא לדמיין את המיקום של המוטציה במבנה 3D סטטי ולבחון את ההשפעה האפשרית שלה ביחס חומצות אמינו השכנות ויחידות מבניות. במחקר זה, למשל, מאז מוטציה A702V EGFR ממוקם במקטע juxtamembrane B שיוצר את ממשק dimer אסימטרי, השימוש במבנה dimer עבור הסימולציה בניגוד מונומר הוא קריטי. השימוש במבנה מונומרי היה חשף את קטע juxtamembrane B של kinase מקלט לממס, מניעתו מן האינטראקציות ייצוב, משופר על ידי המוטציה שאריות הידרופוביות גדול יותר ואינטראקציות עם isoleucine 941 מssicdues c-אונה של kinase מפעיל. יתר על כן, ראוי לציין כי המבנה 3D המיוצג על ידי הקואורדינטות בקובץ PDB אינם בהכרח תואמים את המבנה הרלוונטי ביולוגית שיש להשתמש בו למחקר. לדוגמה, עם המבנה של ErbB4, קוד PDB 3BCE, קואורדינטות PDB תואמות לטרימר, אך הסיבה לכך היא אנשי קשר גבישיים (מעט אנשי קשר בין המונומרים נראים בעת צפייה חזותית של מבנה זה). ניתן להשתמש במטריצות בתוך קובץ PDB (לדוגמה, בתוך כימרה) כדי לשחזר את המבנים הקשורים גבישי, אשר ניתן לדמיין כדי לזהות שרשראות התואמות למבנה 3D הרלוונטי ביולוגית כפי שדווח בפרסום המקורי42. שלב חיוני נוסף של הפרוטוקול הוא להכין כראוי את מבנה קלט הסימולציה, כגון בניית חומצות אמינו חסרות באזורי לולאה שונים, ובמיוחד היכן ממוקם בקרבת המוטציה. למרות שמבני EGFR רבים מסוג פראי קיימים ב-PDB, רק מספר מוגבל של מבני EGFR מוטנטים זמינים. כתוצאה מכך, המבנים המוטנטים גם צריכים להיות מודל; עבור מוטציה משקע יחיד כמו A702V, כימרה שימשה כדי mutmut את השאריות; בעוד שלמוטציה של המחיקה של 300 00:00:00,000 -------------------------------
הפרמטרים השונים המנוצלים בקבצי קלט הסימולציה - לדוגמה, מספר מחזורי מזעור, חימום המערכת לטמפרטורה הרצויה בדרך אחת או במקום חימום איטי באמצעות מספר טמפרטורות ביניים, פרק הזמן לשיווי המשקל ולסימולציות הייצור - ניתן לשנות בהתבסס על מולקולת המחקר, מטרת העבודה וההעדפות של האדם עצמו. בעת ביצוע סימולציות MD, זה גם נפוץ להיתקל בשגיאות שיכולות לנבוע מקבצי הקלט, בעיות הקשורות תוכנת הסימולציה בשימוש או אפילו שגיאת משתמש. לפיכך, חשוב מאוד להבין את מקור השגיאות על ידי בחינה קפדנית של הודעות שגיאה. רוב תוכניות הסימולציה כוללות רשימת דיוור שבה משתמשים יכולים להציב שאלות למפתחי התוכנה ולאנשים אחרים שלעובריהם ניתן לפתור את רוב הבעיות. בנוסף, מדריכי משתמשים מספקים סיוע משמעותי להבנת פרטי פרוטוקול הסימולציה, כולל הנחות ומגבלות. למרות סימולציה MD הוא כלי חשוב כדי לחקור את המאפיינים הדינמיים של מולקולות, לזכור כי תוצאות חישוביות צריך להיות מוערך בקפידה בשילוב עם מקורות אחרים של מידע כדי להעריך את תוקפם. במידת האפשר, לעבוד יחד עם חוקרים כי הם מומחים על החלבונים במחקר, במיוחד שבו מחקרים ניסיוניים מעבדה רטובה רלוונטית נעשות, אשר משמשים כדי לספק תוצאות עבור פרשנות מבנית, כמו גם להציע ניסויים שעשויים להיעשות בהתבסס על תצפיות מבניות כדי לבדוק השערות.
במחקר זה, הפרוטוקול היה יעיל בבדיקת ההשפעות המבניות הדינמיות של מוטציות EGELREA ו- A702V על מבני קינאז EGFR. הסימולציות חשפו כי ΑELREA מרסן את סליל αC חיוני מבחינה פונקציונלית ומקדם שינוי קונפורמציה מהקין הלא פעיל לקינאז פעיל מיוצב. תוצאות הסימולציה נתמכות באופן עצמאי על ידי נתוני תגובה לתרופות שהדגימו את ההשפעות של מעכבי קינאז טירוסין על קווי תא סרטן ריאות שיש מוטציה מחיקה EGFR מסוג פראי, שם עיכוב גדול יותר על ידי תרופות זיהוי קונפורמציה קינאז פעיל דווח עבור EGFR מסוג בר12. עם מוטציה A702V, סימולציות MD מצביעות, בהשוואה לסוג הפראי, ייצוב מוגבר של ממשק kinase מקלט מפעיל, כמו גם זיקה גבוהה יותר של מפעיל מקלט kinase אחד לשני, יחד תמיכה תחזוקה של קונפורמציה מופעלת של קינאז EGFR. מוטציה A702V, ממוקם על קטע juxtamembrane B של kinase מקלט, יגביר אינטראקציות הידרופוביות עם kinase מפעיל, מתפקד כדי להאריך את משך המצב מופעל. מוטציה A702V תומך בהישרדות תאים בהיעדר גורם גדילה וזוהה בהקרנה במבחנה עבור מוטציות EGFR9.

קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי (EGFR) משפחה (ErbB) של קינאזים טירוסין קולטן (RTKs) כולל ארבעה חברים - EGFR / ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 ו ErbB4/HER4. קולטני ErbB לווסת תהליכים תאיים בסיסיים כגון צמיחת תאים והתפשטות,בידול, הגירה והישרדות 1,,2 ,ולכןהם פרוטו-oncogenes חזק. פעילות חריגה של קולטני ErbB, במיוחד EGFR ו ErbB2, נקשר לעתים קרובות עם סרטן אנושי ביצוע קולטני ErbB מטרות מפתח עבור סרטן therapeutics2,,3.
מספר שינויים סומטיים של גנים ERBB דווחו מממאירותאנושית 3,,4,,5. הדוגמאות המאופיינות הטובות ביותר כוללות את המוטציות החוזרות ונשנות, נקודת ההפעלה מחיקות קצרות במסגרת בתחום קינאז EGFR בסרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC). מוטציות EGFR אלה מייצגות נהגים מרכזיים של צמיחת סרטן, ולנבא רגישות EGFR מיקודתרופות לסרטן 6,7,8. עם זאת, ברוב סוגי הסרטן, מוטציות סומטיות ב EGFR להתרחש מחוץ אלה חוזרים ונשנים "נקודות חמות" ומופצות על פני כל 1210-שאריות טווח של הקולטן. אכן, רוב השאריות לאורך הרצף הראשי EGFR נמצאו מוטציה בסרטן אנושי9. אף על פי כן, מלבד נקודות חמות מעטות, המשמעות הפונקציונלית של הרוב המכריע של מוטציות EGFR הקשורות לסרטן נשאר לא ידוע.
המבנה המונומרי של ErbBs מורכב מתחום חוץ-תאי גדול של מסוף אמינו, ואחריו סליל טרנסמברנה יחיד המוביל לתחום טירוסין קינאז תאי ואזור זנב C-terminal המכיל אתרי עגינה לחלבונים איתות תאיים. כריכת ליגנד מפעילה שינוי קונפורמציה דרמטי בתחום החוץ-תאי, המאפשר היווצרות של דימרים קולטנים על ידי חשיפת זרועות dimerization כי באופן סימטרי לחצות אחד את השני ואינטראקציה עם המשטחים ארומטי / הידרופובי שלהם. על היווצרות דימר קולטן התחומים קינאז טירוסין לבוא במגע אסימטרי(איור 1),וכתוצאה מכך ההפעלה של kinases כי phosphorylate זנבות C-מסוף של מונומרים קולטן, ולאחר מכן בהפעלה של במורד הזרם איתות10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> איור 1: מבנה דימר EGFR. EGFR מתעמעם כאשר התחומים חוץ תאיים לאגד גורם גדילה (EGF, גורם גדילה אפידרמיס). תחום kinase מקלט מופעל לאחר מכן באמצעות אינטראקציה אסימטרית עם תחום kinase מפעיל, וזנבות C-מסוף הם autophosphorylated בשאריות טירוסין (שונה מ תמיראת ואח'12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
בגלל סידורים מבניים דינמיים המתרחשים במהלך המעברים <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> dimer מונומר, יחד עם הפעלת קינאז המשויך להיווצרות של דימר אסימטרי, מוטציות לאורך כל מבנה הקולטן יכול להיות השפעה על תפקוד הקולטן. כאן אנו מתארים מספר דוגמאות מהמחקרים הקודמים שלנו, שבהם המודל של המוטציה וההדמיה הספיק כדי להסביר את ההשלכות של התפקוד.
דוגמה 1: מוטציה אחת שדווחה, D595V ב ErbB413, הובילה לדילום מוגבר של ErbB4 ופוספורילציה14. הדמיה של מיקום המוטציה הייתה גורם קריטי בהבנת ההשפעות הפונקציונליות שנצפו: D595V התרחשה בהצלבה הסימטרית של הזרועות העמומות של האקטודומיין(איור 2א'). הזרועות הן בעיקר ארומטיות והידרופוביות, והחלפת חומצה אספרטית קוטבית על ידי ואלין צפויה להגדיל את האינטראקציות ההידרופוביות "דביקות", לייצב את העמים ומכאן להגדיל את משך הזמן שבו phosphorylationמתרחש 14. זו הייתה הפתעה בהתחלה למצוא אספרטה בכל זרוע, אבל במבט לאחור אפשר לחשוב על זה כמנגנון תזמון לפעילות, שבו שרשראות צד חומצה קוטבית להפחית את הזיקה ואת החיים של dimer שלם ולכן להגביל את פוספורילציה מתווכים קינאז ואיתות. החלפה על ידי valine לאחר מכן להסיר הגנה זו על ידי ייצוב נוסף של dimer ErbB4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> איור 2: מיקום של מוטציה מפעילה ErbB4 ומוטציות המייצרות קינאז מת ErbB4. (A) D595 (הפעלת מוטציה D595V) ממוקם על הזרועות הארומטיות / הידרופוביות dimeric של מודל ectodomain ErbB4; שותף הנשק על גורם גדילה מחייב; (שאריות סמוכות מוצגות כמקלות). (ב)ב ErbB4, G802 (השבתת מוטציה G802dup) עוזר ליצור את הכיס המחייב סביב טבעת אדנין של ATP וקטליה D861 (השבתת מוטציה D861Y) קושר הן Mg2+ (לא מוצג) ואת קבוצת γ-פוספט של ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
דוגמה 2: ניתן לצפות כי מוטציות סומטיות המתמקדות באתר איגוד ATP של תחום kinase ישנה או לחסל פעילות אנזימטית המובילה קולטן לקוי או kinase מת אינו מסוגל לאותת. מתוך תשע מוטציות שדווחו מחולים עם שד, קיבה, המעי גס, או NSCLC15, שתיים מתוך תשע מוטציות כאשר נבדקו היו פעילות זרחןמופחתת מאוד 16: G802dup (G → GG) ו D861Y. שתי מוטציות סומטיות השבתה נמצאו בתוך אתר איגוד ATP של מבנה תחום קינאז טירוסין(איור 2B):גליסין גמיש, משוכפל, ישנה את אתר טבעת אדנין וחומצה אספרטית קטנה הוחלף טירוסין מגושם ליד פוספטים מסוף היה מונע פיזית Mg2+-ATP מאיגוד. עם זאת, מאז ErbB4 יכול ליצור הטרודימר עם ErbB2 - ErbB2 אינו כבול גורם גדילה ותלוי בשיתוף עם ErbB כי עושה על מנת הטרודימר - ErbB2(פעיל)---- ErbB4 (kinase-מת) הטרודימר יעורר התפשטות תאים באמצעות מסלול איתות Erk / Akt עדיין תאים לא להבדיל בגלל קינאז מת ErbB4 וחוסר הפעלת מסלול STAT516.
במחקרים עדכניים יותר, התברר כי התנועות הדינמיות של ErbBs היו רלוונטיים להבנת ההשפעות של כמה מוטציות על תפקוד ErbB, במיוחד מוטציות המתרחשות בתוך תחום קינאז טירוסין. תחום הקינאז טירוסין מורכב N-אונה (בעיקר β גיליונות) ו C-האונה (בעיקר אלפא helical), אשר מופרדים על ידי האתר הקטליטי שבו ATP נקשר. האונה כוללת את סליק αC ו-P-loop, בעוד שההפעלה (A-loop) ולולאות קתליטיות נמצאות ב-C-lobe17,18,19. מבני גביש של תחום קינאז טירוסין חשפו שני קונפורמציות לא פעילות, רוב המבנים יש מצב לא פעיל כמו SRC. בהתאמה הפעילה, ההתלת הקטאליטית של ה-A-loop מצביעה על אתר איגוד ATP והסליל αC מונחה כלפי כיס הכריכה של ATP ("αC-in" conformation), ויוצר אינטראקציה חזקה של זוג יון גלוטמט-ליסין.
מכיוון ש-ErbBs ותחום הקינאז של הרכיב הם ישויות דינמיות ביותר, ובמיוחד במקרים שבהם ההשפעות של מוטציות על תפקוד ופעילות ביולוגית צפויות להיות קשורות בחוזקה ל מצבים הקונפורמיים של ה-ErbBs, חשוב להעריך מוטציות ביחס למגוון השינויים הדינמיים שהם יחוו. מבני גביש רנטגן של ErbBs מספקים תמונות סטטיות של מבנה תלת-מית-מיו, שעשויות להיות רלוונטיות או לא כדי להבין את ההשלכות הדינמיות של מוטציה. על מנת לבדוק את טווח השינויים הדינמיים המתאימים ל"נוף האנרגיה" הזמין למבנה תלת מימדי (תלת-ממדי), סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) נמצאות בשימושנרחב 20. במקרה של מוטציות שיובילו לשינויים קונפורמציה מקומיים בתוך תחום קינאז טירוסין או ייצוב של מורכב, סימולציות על סדר של 100 ns עשוי להיות מספיק. עם זאת, שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול יותר (לדוגמה, מעברים בין ההתאמות הפעילות ולא פעילות של תחום הקינאז) דורשים זמן סימולציה ארוך יותר - בסדר שלמיקרו-שניות 21.
ביחס לפרוטוקול המתואר להלן אנו שוקלים שתי מוטציות מפעילות בתוך תחום קינאז טירוסין(איור 3). שתי המוטציות ממוקמות בתוך תחום kinase במקומות החווים שינויים קונפורמיים מקומיים המכתיבים אם הקינאז פעיל או לא, ולכן סימולציות MD הוחלו בשני המקרים. במקרה הראשון, אנו שוקלים שינויים המשפיעים ישירות על אתר איגוד ATP ומכונות קטליה של תחום kinase מקלט EGFR, במיוחד לבחון את ההשלכות של מוטציה exon 19 מחיקה כי הוא מעורב נרחב NSCLC4,,7. מוטציה746ELREA750, אשר מקטין את אורך לולאת β3-αC לפני סלילי αC - סלילי נע לכיוון האתר מחייב / פעיל על הפעלת kinase ומשתתף בגימת האינטראקציה האלקטרוסטטית הקריטית בין E762 של סליר K745 על ידי מיקום ליסין לאינטראקציה עם ATP - מונע את התחוםלהפעלה 12. במקרה השני, אנו מחשיבים את מוטציה A702V של EGFR, מוצג להיות מוטציה חדשנית רווח-של פונקציה הפעלת גילה על ידי פלטפורמת iScream9 וזוהה בחולה NSCLC22. אלנין-702 על תחום kinase מקלט ממוקם על קטע juxtamembrane B בממשק של המקלט ואת המתחומים kinase מפעיל, שבו זה אסימטרי kinase dimer מורכבים kinase שינויים קונפורמציה קינאז נדרשים להפעלה9.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> איור 3: דימר תחום הקינאז האסימטרי של EGFR. מוטציה A702V יהיה ממוקם בממשק הקריטי של מפעיל ומקלט kinase תחומים, סמוך סליל αC וקרוב isoleucine 941 של kinase מפעיל. שינויים קונפורמיים המושרים על ידי היווצרות של דימר אסימטרי להוביל להפעלת קינאז. לולאת β3-αC המכילה את רצף ELREA מקדימה ישירות את סליל αC; במהלך ההפעלה, סליר αC נע פנימה לכיוון אתר איגוד ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

מוטציות סומטיות רבות המתרחשות קולטן גורם גדילה אפידרמיס (EGFR) משפחה (ErbB) של קינאזים טירוסין קולטן (RTK) דווחו מחולים בסרטן, למרות יחסית מעט נבדקו והוכחו לגרום לשינויים פונקציונליים ErbBs. קולטני ErbB הם dimerized ומופעל על איגוד ליגנד, ושינויים קונפורמציה דינמיים של הקולטנים הם טבועים אינדוקציה של איתות במורד הזרם. עבור שתי מוטציות המוצגות באופן ניסיוני כדי לשנות את פונקציית EGFR, A702V ומוטציית המחיקה746ELREA750, אנו ממחישים בפרוטוקול הבא כיצד סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) יכולות לחקור את היציבות הקונפורמציה (1) של מבנה הקינאז מוטציה טירוסין בהשוואה EGFR מסוג פראי; (2) השלכות מבניות ומעברים קונפורמיים ומערכת היחסים שלהם לשינויים פונקציונליים שנצפו; (3) השפעות של מוטציות על הכוח של ATP מחייב, כמו גם על קשירה בין תחומי קינאז ב dimer אסימטרי מופעל; ו-(4) השפעות המוטציות על אינטראקציות מפתח בתוך אתר איגוד EGFR המשויך לאנזים המופעל. הפרוטוקול מספק הליך מפורט שלב אחר שלב, כמו גם הדרכה שיכולה להיות שימושית יותר בדרך כלל לחקירה של מבני חלבון באמצעות הדמיות MD כאמצעי לבדיקה של דינמיקה מבנית ואת הקשר לתפקוד הביולוגי.

הפרוטוקול המתואר שימש כדי ללמוד את ההשפעות המבניות של מוטציות ΑELREA ו A702V על מבנה קינאז EGFR. יישום אחד של הפרוטוקול היה לחקור את ההשפעה של המוטציות על יציבות מבנית/קונפורמציה מקומית על ידי חישוב ערכי RMSD ו- RMSF מסימולציות MD. כמו מוטציה A702V ממוקם במקטע juxtamemembrane B, RMSD של קטע זה של kinase מקלט ביחס למבנה ההתחלתי חושב הן עבור סוג פראי A702V EGFRs. התוצאה (איור 4A) חשפה כי קטע juxtramembrane B של המוטנט הגדיל את היציבות הקונפורמציה במהלך סימולציה 100 ns (ממוצע RMSD 0.7 Å - Å מרווח ביטחון של 95% (CI) 0.009) בהשוואה לתחום הקינאז EGFR מסוג פראי (ממוצע RMSD 1.1 Å - 95% CI 0.01). סביר להניח כי זוהי תוצאה של אינטראקציות הידרופוביות הדוקות יותר בממשק dimer עקב החלפת אלנין 702 (שרשרת צד קבוצת מתיל) למשקע הידרופובי מגושם יותר, ואלין (שרשרת צד קבוצת isopropyl), המוביל אינטראקציות הידרופוביות מוגברת של V702 על תחום kinase מקלט עם isoleucine 941 של תחום קינאז מפעיל.
מוטציה ΑELREA ממוקם בלולאה β3-αC, סמוך סליל αC קריטי מבחינה פונקציונלית; ההתאמה של סלילי αC היא המפתח לשינויים בין מצבים פעילים ולא פעילים של קינאז EGFR. היציבות הקונפורמציה של סלילי αC במצב הפעיל הוערכה על ידי בדיקת RMSF מעל אטומי Cα של שאריות בתוך סלילי במהלך סימולציות MD(איור 4B):בסך הכל, יש תנודות נמוכות יותר במוטציה (ממוצע RMSF 1.1 Å - 95% CI 0.4) בהשוואה לסוג הפראי (ממוצע RMSF 1.5 Å - 95% CI 0.57); עם ההפרש הגבוה ביותר בתנודות שנרשמו עבור שאריות N-terminal. הקונפורמציות שנדגמו בהתאמה על המבנה החציוני של תחום kinase מסוג פראי של תחום kinase 3 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000Figure 4C ממצאים אלה מצביעים על כך שמוחק רצף ELREA מרסן את תנועת סליל αC של המדינה הפעילה, ומכאן ריסון ובכך ייצוב הקונפורמציה הפעילה. יתר על כן, מאז סליק αC מהווה חלק ממשק dimer אסימטרי, המגבלות על סליר αC בmutant סביר מאוד לייצב את dimer אסימטרי, הארכת משך של המצב מופעל.
יישום נוסף של הפרוטוקול הוא לחקור את ההתנהגות של אינטראקציות פנים-מולקולריות מפתח המתרחשות במהלך הסימולציה. לכן, האינטראקציה בין K745 ו E762, שהוא בסיסי לפעילות אנזימטית EGFR, נותח הן עבור הצורה הפעילה מסוג פראי והן עבור קינאז EGFR של EGFR על ידי מדידת התפוסה באחוזים של קשרי מימן שנוצרו בין אטומי הקוטב של שתי השאריות במהלך סימולציות MD (איור ( איור 5A): אינטראקציה אלקטרוסטטית מרכזית זו נוצרה לעתים קרובות יותר בתחום קינאז ΑELREA בהשוואה לתחום kinase מסוג פראי, בשל סליל αC יציב יותר התואם E762. האינטראקציות בין Mg2+-ATP לבין התחומים מסוג פראי ו-EGFR (איור 5ב') במהלך הסימולציה הוערכוגם (איור 5ג'):מספר איגרות החוב של המימן היה גדול יותר עבור 3ELREA (ערך ממוצע 4.0 - 95% CI 0.03) מאשר עבור EGFR מסוג פראי (ערך ממוצע 3.2 - 95% CI 0.04). ניתוח נוסף של איגרות החוב מימן גילה כי K745 אינטראקציה בתדירות גבוהה יותר עם קבוצות פוספט של ATP ב EGFR EGFR, אשר מקושר לאינטראקציה יציבה יותר K745-E762 ציין בסימולציה של תחום קינאז מוטציה EGFR EGFR.
סימולציות MD כמתואר בפרוטוקול שימושיות גם בהערכת האנרגיה החופשית היחסית של קשירה לאינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד. האנרגיות המחייבות בין מפעיל ומקלט קינאז תחומים של סוג פראי ו- A702V EGFRs, ובין ATP ואת סוג פראי ו EGFR מוטציה EGFR kinase תחומים, היו מחושבים מן המכניקה המולקולרית כללי נולד שטח הפניםbind (MMGBSA) חישובים (איור 6A): מוטציה A702V הפיק ערך איגוד ממוצע נמוך יותר (איגוד 3G ממוצע = -76 קק"ל / מול - ערך 95% CI 0.47), המייצג אינטראקציות dimer חביבות יותר, בניגוד לתחום EGFR מסוג פראי (איגוד ממוצע 3G = -61 קק"ל/מול - 95% CI 0.61).bind bind תצפית זו עולה בקנה אחד עם קטע juxtamembrane B יציב יותר ממשק dimer הדוק יותר בשל אינטראקציות הידרופוביות מוגברת שנצפו עבור תחום קינאז EGFR A702V. במקרה של איגוד ATP לתחומים מסוג פראי ו- EGFR קינאז(איור 6ב'),חישובי MMGBSA מנבאים איגוד ATP חזק יותר עם מוטציה ת"א (איגוד ממוצעשל EgG -5 7 קק"ל/מול - 95% CI 0.43) בהשוואה ל-EGFR מסוג פראי (איגוד ממוצעשל 38 קק"ל/מול - 95% CI 0.33). תוצאה זו עומדת בקנה אחד עם המספר הגדול יותר של איגרות חוב מימן שנרשמו בין ATP ו- EGFR (איור 5C) בהשוואה לתחום מסוג פראי.
הפרוטוקול יכול גם להיות מועסק כדי לחקור שינויים קונפורמציה שנצפו במהלך סימולציה. במחקר הנוכחי, ההשפעות של מוטציית EGFR הלא פעילה נחקרו על ידי בדיקה חזותית ומיקום על של הקונפורמציות שנדגמו מהסימולציה. הניתוח חשף תנועה פנימית של סליל αC בתחום קינאז EGFR ΑELREA (איור 7A), שינוי מבני הצפוי במהלך המעבר למצב הפעיל. In contrast, the αC helix of wild-type inactive EGFR maintained its initial conformation (Figure 7B). לפיכך, סימולציות MD תומכות בהצעה כי מוטציית המחיקה, המוצגתבאופן ניסיוני כדי להגדילאת פעילות kinase 40,41, מקדמת שינוי קונפורמציה מן kinase לא פעיל כלפי המצב הפעיל.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> איור 4: יציבות קונפורמציה מסוג פראי ומוטנטי של תחום הקינאז הפעיל EGFR במהלך הדמיות MD. (A) RMSD (אטומי עמוד שדרה) מעל מקטע juxtamembrane B של סוג פראי (כחול) ו- A702V (אדום) מקלט kinase תחום. (ב)RMSF (אטומי Cα) על שאריות של סליל αC: סוג פראי (כחול) ו- ΑELREA (זהב). (ג)קונפורמציות שנדגמו על-ידי סוג פראי (משמאל) ו- EGFR kinase (מימין) ; עקבות שרשרת צבעוניות המבוססות על RMSD (אטומי Cα) של כל שאריות ביחס למבנה החציוני. צביעה נעה בין כחול ללבן לאדום, המייצג אזורים של יציבות קונפורמציה גבוהה עד נמוכה. שים לב כי האזורים "חינם" N-מסוף של תחום kinase מבודד, אדום צבעוני, לא יציג רמה זו של ניידות במבנה EGFR שלם. נתונים מותאמים מתוך Chakroborty ואח '9 (איור 4א שוחזר באישור כתב העת לכימיה ביולוגית) ו תמירת ואח'12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> איור 5: תכונות מפתח שנראו קינאז מקלט פעיל במהלך סימולציות MD: K745-E762 גשר מלח, סלילי αC ואינטראקציות עם ATP. (א)תפוסת אחוזים של האינטראקציה K745-E762 במהלך הסימולציה של סוג פראי (כחול) ו EGFR (זהב) EGFR קינאז תחומים. (ב)שאריות של סוג פראי ומוטנט ים-100 אינטראקציה עם ATP (מקלות). Mg2+ (ירוק) קואורדינטות עם ATP ו- D855. (ג)מספר איגרות החוב של מימן שנוצרו על ידי ATP הן עם סוג פראי והן עם תחומים קינאז EGFR מסוג פראי במהלך סימולציות MD. איור מאת תמירת ואח'12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> איור 6: אנרגיות חופשיות יחסית נמוכות יותר של כריכה נצפו עבור תחומי קינאז מוטציה במהלך הסימולציות. (א)אנרגיות איגוד מחושבות עבור האינטראקציה בין המחשבים kinase מפעיל מקלט של סוג פראי (כחול) ו- A702V (אדום) EGFRs. (ב)איגודbind של ATP לתחומים מסוג פראי (כחול) ו- EGFR kinase מסוג פראי. נתונים מותאמים מ-Chakroborty ואח'9 (איור 6א' שוחזר באישור כתב העת לכימיה ביולוגית) ותמיראטואח' 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> איור 7: התאמות על-פי הסוג הפראי ותחום הקינאז הלא פעיל של EGFR. התאמה של סליל αC וסליל לולאה של (A) סוג בר (מבנה חציון בכחול) ו -(B)EGFRs ΡELREA (זהב). קונפורמציות אחרות שנדגמו, לבן דהוי; מבנים ראשוניים לפני סימולציות MD, ורוד. איור מאת תמירת ואח'12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

מטרת הפרוטוקול היא להשתמש בסימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לבחון את השינויים המבניים הדינמיים המתרחשים עקב הפעלת מוטציות של חלבון קינאז EGFR.

פענוח ההשפעות המבניות של הפעלת מוטציות סומטיות EGFR עם סימולציה דינמיקה מולקולרית

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

סימולציה דינמית מולקולרית היא טכניקה חישובית שניתן להשתמש בה כדי לחקור תנועות מולקולריות והוא יכול לחשוף שינויים קונפורמיים החיוניים להבנת תפקוד ביוכימי ותאי. קשה לתדרך את טווח התנועות הדינמיות הנגישות למאקרומולקול. שימוש בתוצאות מסימולציות דינמיות מולקולריות בשילוב עם נתונים ניסיוניים מאפשר הערכה של משמעותם התפקודית.אנו נדגים באמצעות סימולציות דינמיות מולקולריות כיצד מוטציות שנצפו אצל חולי סרטן משפיעות על אישורי מיקוד EGFR וקשירת ליגנד. כדי להכין את EGFR פעיל apo מסוג פראי מבנה kinase שלנו, לפתוח את תוכנית הדמיה קימרה, ותחת תפריט הקובץ, לחץ להביא על ידי ID.Select את מסד הנתונים של בנק נתוני חלבון ולציין את קוד בנק נתוני חלבון 2GS2. כדי לבנות את האלמנטים המבניים החסרים של 2GS2, רכוש מקטעים אלה ממבני EGFR אחרים.כדי לבנות את חמש שאריות גלוטמט 746 כדי אלנין 750 ELREA מחיקה ב EGFR, לחץ על מועדף, רצף, ולהראות רצף כדי לפתוח את רצף 2GS2 מסוג פראי. ובחלון הרצף שנוצר, לחץ על ערוך והוסף רצף כדי לבחור את רצף תבנית FASTA המוטנטי למחיקה. בחלון היישור, בחר את המבנה והמודל או הומולוגיה.בחלון המוקפץ, ציין את המבנה המורכב של 2GS2 כתבנית ואת רצף המוטנטים כשאילתה שיש לדגמן ולאחר מכן בחר מודל מוטנט מהמודלים המתקבלים בהתבסס על ציון zDOPE ובדיקה חזותית. כדי להכין את מבנה ה- EGFR קינאז הלא פעיל מסוג פראי, פתח את מבנה בנק הנתונים של החלבון 2GS7 והוסף את המקטעים החסרים ממבני EGFR האחרים, מידול טופס מוטנט המחיקה כפי שהוכח. כדי להכין את מבנה הקינאז הפעיל EGFR מסוג ATP, השתמש במבנה בנק הנתונים של חלבון 2ITX כמבנה העיקרון, בניית המקטעים החסרים באמצעות מבני EGFR אחרים ומידול טופס מוטנט המחיקה באמצעות המדגים כפי שהוכח.כדי לבנות את מבנה העמעום האסימטרי מסוג Wild-TYPE EGFR, פתח את 2GS2 בקימרה ולחץ על כלים, מבנה מסדר גבוה יותר ותא יחידה כדי להמיר את המבנה להרכבה הביולוגית המכילה את המפעיל והמקלט kinases בסידור האסימטרי. בחר את מבנה 2GS2 והזן ליצור עותקים, ולאחר מכן בחר ושמור עמעום אסימטרי יחיד מהעותקים המרובים של העמעום הנובע מפעולות הסימטריה. כדי לבנות את מוטציית הולין אלנין 702, בחר כלים, עריכת מבנה ורוטמרים כדי להחליף את אלנין 702 בולין.פתחו את המבנים ב-Maestro ולחצו על כפתור אשף הכנת החלבון, ולאחר מכן בחרו להוסיף אטומי מימן ולמלא אטומי שרשרת צדדיים חסרים ולחצו על תהליך מקדים. כדי לקבוע את מצבי הפרוטונציה של שאריות יוניות ב- pH 7.0, לחץ על עידון ולהשתמש PROPKA כדי לייעל את האוריינטציה של אספרג'ין, גלוטמין, שאריות היסטמין עבור מליטה מימן, ולאחר מכן למזער את המבנה. כדי להגדיר את מערכת הסימולציה, פתח את תוכנית LEAP וייבא את שדה כוח FF14SB ענבר ומולקולות מים TIP3P.עבור המערכות המאוגדות ל- ATP, יבא פרמטרים עבור ATP וטען את המבנה. לתפוך את המבנה בקופסת אוקטהדרל עם מולקולות מים TIP3P מפורשות המשתרעת על פני 10 אנגסטרום לכל הכיוונים מאטומי פני השטח של החלבון. בדוק את מערכת החגורה ולהוסיף את היונים הדרושים כדי לנטרל אותו.כדי מודל מספיק מערכות biomolecular, להוסיף נתרן נוסף אטומי כלוריד לתיבת הסימולציה כדי להביא את ריכוז מלח המערכת 0.15 טוחנת, ולאחר מכן ליצור ולשמור את הטופולוגיה ולתאם קבצים של המערכת כדי לשמש תשומות עבור סימולציית הייצור הבאה. באמצעות אמבר, בתחילה אנרגיה למזער את מערכת הסימולציה כדי לעקוף את כל תצורות שליליות. בקובץ קלט המזעור, התאם את משתנה המחזור המרבי עבור מחזור המזעור הכולל ואת מספר המחזורים כדי לציין את מספר המחזורים עבור אלגוריתם הירידה התלול ביותר.השתמש במשתנה משקל הריסון כדי להחיל את כוח הריסון על האטומים המסיסים שצוינו על ידי הפרמטר מסיכת ריסון. בצע את המזעור בצעדים מרובים, בהדרגה להוריד את האיפוק להחיל על אטומים מסיסים מ 25 כדי 0 קילוקלוריות לכל כיכר אנגסטרום שומה, ולאחר מכן להשתמש בפקודה כדי להפעיל את מזעור. מחממים את המערכת עבור 100 picoseconds מ 0 עד 300 קלווין ולהשתמש בפקודות כדי להגדיר 10 טוחן kilocalorie לכל איפוק אנגסטרום מרובע על אטומים מסיסים.לאחר מכן השתמש בפקודה כדי לבצע את החימום. לצייד את המערכת עבור 900 picoseconds תחת אנסמבל isothermal isobaric ולהגדיר ניתוק מרחק אנגסטרום תשעה עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות לטווח ארוך, בהדרגה להוריד את ריסון האטום מסיס ל 0.1 kilocalorie לכל ריבוע אנגסטרום שומה ולגבש את שיווי המשקל עם סימולציה ננו-שנייה ללא מעצורים. הפעל את הה השוויון עם הפקודה כפי שצוין.התאם את הטקסט כדי לאפשר את הדמיית הייצור להתבצע במשך 100 ננו שניות עם הקונפורמציות נשמר כל 10 picoseconds, ולאחר מכן להפעיל את הסימולציה עם הפקודה כפי שצוין. כדי להמחיש את דגימת הקונפורמציה במהלך הדמיות EGFR קינאז מסוג פראי ומוטנטים, פתח את קבצי הטופולוגיה של Amber ואת קבצי המסלול המתאימים בדינמיקה מולקולרית חזותית. ובשימוש בייצוגי מבנה משני נוח, לנתח את הדינמיקה המבנית הכוללת של החלבונים מהמסלול המתועד.לאחר מכן הצג אינטראקציות ספציפיות בין אטומים ושאריות של עניין, כגון lysine חיוני קטליטטית 745-גלוטמט 762 גשר מלח. לחלופין, שמרו קונפורמציות מרובות שנדגמו במהלך הסימולציה בפורמט Protein Data Bank ופתחו את הקונפורמציות בקימרה. השתמש באפשרות השדכן כדי להמחיש את המבנים על המבנה הראשוני או החציוני ולהציג את המבנה החציוני מוצק ואת שאר המבנים מיושר בלבן דהוי כדי לאפשר הדמיה של תנועות מבניות מוקלטות בבהירות רבה יותר.כדי לנתח את היציבות הגלובלית של EGFRs מסוג פראי ומוטנטים ולבחון את הגמישות של היחידות המבניות השונות, יבא את טיפולוגיית הענבר ואת קבצי המסלול המתאימים. בקובץ הקלט של סטיית ריבוע השורש, ציין את אטומי עמוד השדרה של המבנה ההתחלתי כהפניה להתאמה הריבועית הממוצעת של השורש. בקובץ קלט התנודות הריבועיות של ממוצע השורש, ציין את אטומי C-alpha של המבנה ההתחלתי כהפניה להתאמה הריבועית הממוצעת של השורש.לאחר מכן הפעל את הניתוח באמצעות תוכנית CPPTRAJ והתוות את נתוני הפלט. לחלופין, כדי ליישר את ההרכבים הקונפורמיים ולצבע כל שאריות בהתבסס על השורש C-alpha אטום פירושו סטייה ריבועית, לפתוח את הקונפורמציות בקימרה וליישר אותן עם אפשרות השדכן. בחר כלים, תיאור ועיבוד לפי תכונה.בחרו שאריות של ההרכבים הקונפורמיים והגדירו את הסטייה הריבועית הממוצעת של שורש C-alpha כתכונות ולחצו על הלחצן 'אשר'. עקבות השרשרת של הקונפורמציות יהיו בצבע כחול, לבן או אדום המשקף את אזורי היציבות המבנית הגבוהה, הבינונית והנמוכה בהתאמה. כדי לנתח את אינטראקציות קשר המימן בין ATP לבין EGFRs מסוג פראי ומחיקה, הכן סקריפט CPPTRAJ לביצוע משימה זו. ציין את הניתוח עבור קשרי המימן הבין-תאיים רק עם משתנה הנוינדרמול והגדר קשר מימן עם מרחק מקבל תורם של פחות או שווה ל- 3.5 אנגסטרום וזווית קשר של גדול או שווה ל - 135 מעלות.כדי להעריך את האינטראקציות התוך-מולקולריות, למשל, בין שאריות ליזין וגלוטמט חשובות מבחינה קטליטטית, ציין ליזין כתורם המימן וגלוטמט כשאריות המקבל והפעל את התסריט כפי שצוין כדי לאפשר ניתוח של התוצאה. כדי לחשב את האנרגיות החופשיות המחייבות בין ATP לבין EGFRs מסוג פראי ומחיקה, הכן את קולטן ליגנד שלב הגז וקבצי בנק נתוני חלבון מורכבים של קולטן ליגנד בתוכנית LEAP והגדר את ATP כליגנד ו- EGFR כ הקולטן. הגדר את ערך הרדיו שנולד באופן כללי ל- M Bond I2. לאחר מכן ליצור את הטופולוגיה אמבר לתאם קבצים עבור שלב הגז חלבון נתונים קבצי בנק.באופן דומה, כדי לחשב אנרגיות חופשיות מחייבות בין מפעיל ומקלט kinases של סוג פראי ואלנין 702 valine EGFRs, לציין את kinase המקלט כמו הליגנד ואת kinase מפעיל כמו הקולטן ולשמור את הטופולוגיה המתאימה לתאם קבצים. הכן קובץ קלט שטח פנים מוכלל של מכניקה מולקולרית והגדר את ערך ה- IGB לשניים ואת ה- saltcon ל- 0.1. ואז להשתמש באמפבסה.py סקריפט זמין ענבר, הזן את הפקודה כפי שצוין כדי לבצע את חישובי האנרגיה מחייב לנתח את נתוני הפלט. במהלך סימולציה זו נציג 100 ננו שנייה, מוטציה ולין אלנין 702 הראה יציבות קונפורמציה מוגברת של קטע B juxtamembrane ככל הנראה בשל אינטראקציות הידרופוביות הדוקות יותר בהשוואה EGFR מסוג פראי. המוטנט אלנין 702 ולין גם הפגין אנרגיה חופשית נמוכה יותר של קשירה בין המפעיל לבין kinases מקלט יחסית EGFR מסוג פראי, המייצג אינטראקציות עמעום נוח יותר לשמור על קונפורמציה EGFR קינאז פעיל.הדמיה של מוטציית המחיקה הביאה לתנודות אטומיות C-alpha נמוכות יותר של סליל אלפא C-helix של מפתח תפקודי בהשוואה ל- EGFR מסוג פראי, והאריך את זמן המצב הפעיל של EGFR. מוטציית המחיקה הביאה גם להיווצרות תכופה של קשרי מימן בין אטומי הקוטב של השרשרת הצדדית של ליזין 745 וגלוטמט 762, אינטראקציה מרכזית עבור פעילות אנזימטית EGFR בהשוואה ל- EGFR מסוג פראי. בנוסף, מספר קשרי המימן בין ATP ל- EGFR היה גדול יותר עבור מוטציית המחיקה מאשר עבור EGFR מסוג פראי.מוטציית המחיקה הביאה גם לתנועה פנימית של מצב EGFR לא פעיל אלפא C-סליל, שינוי מבני צפוי במהלך המעבר למצב פעיל. לעומת זאת, סליל אלפא C של EGFR לא פעיל מסוג פראי שמר על הקונפורמציה הראשונית שלו. כדי להעריך את ההשפעה של המוטציות, חיוני לבחור את המצבים הקונפורמיים המתאימים של המבנים כדי להכין כראוי לצייד מבנים אלה.חשוב לשלב סימולציות דינמיות מולקולריות עם מחקרים ניסיוניים, גם כאשר הסינרגיה בין טכניקות אלה מועילה לפרשנות התוצאות ומודיעה על ניסויי מעבדה רטובים נוספים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...