Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
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この研究は、フィンランドアカデミー(308317、320005)、シグリッド・ジュリウス財団とTor、ジョーとペンティ・ボーグ記念基金、フィンランドの癌財団(274728、316796)、トルコ大学中央病院からのK.E.への助成金によって資金提供されています。M.Z.T.は、情報構造生物学のオーボ・アカデミ博士ネットワークによって資金提供されています。我々は、コンピューティングリソースのためのCSC ITセンターとバイオセンターフィンランドバイオインフォマティクスネットワークの下でのITサポートのためのユッカ・レフトネン博士に感謝します。バイオセンターフィンランド構造生物学インフラネットワーク。

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著者らは開示するものは何もない。

本研究で説明するプロトコルは、分子動力学シミュレーションを用いて、EGFRキナーゼドメインの体細胞変異を活性化することから生じる局所的および全体的な構造変化を調査することに焦点を当てている。野生型および変異型EGOFのX線結晶構造は、非常に貴重な構造洞察を提供するが、それらは、1つまたはいくつかの静的表現を描写する。しかし、ErbBsの生物学的機能に固有のは、酵素的に不活性なチロシンキナーゼと活性チロシンキナーゼの間の必要な移行であり、キナーゼモノマー間の構造および分子内相互作用の両方の動的変化を引き起こす。このようにMDシミュレーションは、野生型構造、導入されたΔELREA欠失突然変異、およびA702V突然変異を含むEGFRチロシンキナーゼドメインの動的性質をプローブするために実施した。これらのシミュレーションは、これらの突然変異の構造における可能性の高い役割を解明し、チロシンキナーゼドメインの立体構造に及ぼす影響が、EGFRキナーゼ活性の実験的に観察された増加をもたらす方法を解明することに成功した。
このプロトコルの重要なステップは、突然変異の影響を評価するために関連する構造を使用することです。関連するシミュレーション入力構造を選択する方法の1つは、静的な3D構造における突然変異の位置を可視化し、隣接するアミノ酸および構造単位に対するその影響を調べることである。本研究では、例えば、A702V EGFR突然変異が非対称ダイマー界面を形成する並膜Bセグメントに位置しているため、単量体とは対照的にシミュレーション用のダイマー構造の使用が重要である。単量体構造の使用は、レシーバキナーゼの並膜Bセグメントを溶媒に露出させ、安定化相互作用から奪い、より大きな疎水性残基への突然変異および活性化剤キナーゼのC-lobe残基からのイソロイシン941との相互作用によって増強されたであろう。また、PDBファイル内の座標によって表される3D構造は、必ずしも研究に使用されるべき生物学的関連構造に対応していないことに注目に値する。例えば、ErbB4、PDBコード3BCEの構造では、PDB座標は三量体に対応するが、これは結晶接触によるものである(この構造を視覚化する際にモノマー間の接触が少ない)。PDBファイル内の行列は、結晶関連構造を再構築するために(例えば、キメラ内)使用することができ、これは、元の出版物42で報告されるように生物学的に関連する3D構造に対応する鎖を識別するために視覚化することができる。プロトコルのもう一つの重要なステップは、異なるループ領域で欠損アミノ酸を構築する、特に突然変異の近くに位置する場所で、シミュレーション入力構造を適切に準備することです。PDBには数多くの野生型EGFR構造が存在するが、利用可能な変異型EGFR構造の数は限られている。したがって、変異構造もモデル化する必要があります。A702Vのような単一の残基突然変異のために、キメラは残基を突然変異させるために使用された。一方、ΔELREA欠失変異については、モデラーが使用された。
シミュレーション入力ファイルで利用される様々なパラメータ(例えば、最小化サイクルの数、システムを一度に所望の温度に加熱する、またはいくつかの中間温度を通してゆっくりと加熱する、平衡化と生産シミュレーションのための期間)は、研究の分子、作業の目的と自分の好みに基づいて変更することができます。MDシミュレーションを行う間、入力ファイル、使用中のシミュレーションソフトウェアに関連する問題、あるいはユーザエラーから発生する可能性のあるエラーに遭遇することも一般的です。したがって、エラー メッセージを注意深く調べることによって、エラーの原因を理解することが非常に重要です。ほとんどのシミュレーションプログラムにはメーリングリストがあり、ユーザーはソフトウェア開発者や他のユーザーに質問を投げかけ、ほとんどの問題を解決することができます。さらに、ユーザーマニュアルは、仮定や制限を含むシミュレーションプロトコルの詳細を理解するための重要な支援を提供します。MDシミュレーションは分子の動的特性を探索する重要なツールですが、その有効性を評価するためには、計算結果を他の情報源と組み合わせて慎重に評価する必要があります。可能な限り、研究中のタンパク質の専門家である研究者、特に関連する湿式実験研究が行われる場合は、構造解釈の結果を提供し、仮説をテストするために構造観察に基づいて行われる可能性のある実験を提案するのに役立ちます。
本研究では、このプロトコルは、ΔELREAおよびA702V変異がEGFRキナーゼ構造に及ぼす動的構造への影響を調べる上で有効であった。このシミュレーションにより、ΔELREAは機能的に本質的なαCヘリックスを抑制し、非アクティブキナーゼから安定化された活性キナーゼへの立体シフトを促進することが明らかになった。このシミュレーション結果は、ΔELREA欠失変異および野生型EGFRを有する肺癌細胞株に対するチロシンキナーゼ阻害剤の効果を実証した薬物応答データによって独立して支持され、野生型EGFR12よりもΔELREAに対して活性キナーゼ立体構造を認識する薬剤によるより大きな阻害が報告された。A702V突然変異により、MDシミュレーションは、野生型と比較して、活性化剤と受信機キナーゼ界面の安定化の増加、ならびに活性化剤と受信機キナーゼの互いの親和性の高さを示し、共にEGFRキナーゼの活性化された立体構造の維持を支持する。A702V突然変異は、受信機キナーゼの並膜Bセグメントに位置し、活性化キナーゼとの疎水性相互作用を増加させ、活性化状態の持続時間を延長するように機能する。A702V変異は、増殖因子 の存在しない 細胞生存を支持し、EGFR変異9のインビトロスクリーニングで同定された。

受容体チロシンキナーゼ(RTKs)のヒト上皮成長因子受容体(EGFR)ファミリー(ErbB)には、EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3およびErbB4/HER4の4つのメンバーが含まれています。ErbB受容体は、細胞の増殖および増殖、分化、移動および生存11、22などの基本的な細胞プロセスを調節し、したがって強力な原始腫瘍遺伝子である。ErbB受容体の異常な活性は、特にEGFRおよびErbB2は、癌治療のための主要な標的であるErbB受容体を作るヒト癌にしばしば関連している22、3。3
ERBB遺伝子のいくつかの体細胞変化は、ヒト悪性腫瘍33、4、54,5から報告されている。最も特徴ある例としては、非小細胞肺癌(NSCLC)におけるEGFRキナーゼドメインにおける再発、活性化点突然変異および短いフレーム内欠失が含まれる。これらのEGFR突然変異は、癌増殖の主要な要因を表し、癌治療薬66、7、87を標的とするEGFRに対する感受性を8予測する。しかし、ほとんどの癌において、EGFRにおける体細胞突然変異は、これらの再発性の「ホットスポット」の外で起こり、受容体の全1210残基スパンにわたって分布している。実際、EGFRの一次配列に沿った残基のほとんどは、ヒト癌9において変異することが判明している。それにもかかわらず、いくつかのホットスポットとは別に、癌関連EGFR突然変異の大部分の機能的意義は不明のままである。
ErbBsの単量体構造は、細胞外の大きなアミノ末端から構成され、続いて細胞内チロシンキナーゼドメインとC末端の尾部領域に至る膜貫通ヘリックスが、細胞内シグナル伝達タンパク質のドッキング部位を含む。リガンド結合は細胞外ドメインの劇的な立体構造変化を引き起こし、互いに対称的に交差し、それらの芳香/疎水性表面と相互作用する二量体化アームを露出させることによって受容体二量体の形成を促進する。受容体二量体形成の際にチロシンキナーゼドメインが非対称的に接触し(図1)、受容体モノマーのC末端尾をリン酸化するキナーゼの活性化をもたらし、その後、下流シグナル10,11,11の活性化を行う。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> 図1:EGFRダイマーの構造。EGFRは、細胞外ドメインが成長因子(EGF、上皮成長因子)に結合すると二量体化する。次いで、受信機キナーゼドメインは活性化因子キナーゼドメインとの非対称相互作用によって活性化され、C末端尾部はチロシン残基で自己リン酸化される(タミラットらから改変)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
単量体二量体移行中に起こる動的な構造再調整のために <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> 、非対称二量体の形成に関連するキナーゼ活性化と共に、受容体構造の全長に沿った突然変異は、受容体機能に影響を及ぼす可能性がある。ここでは、変異と可視化のモデリングが機能の結果を説明するのに十分であった我々の以前の研究からいくつかの例を説明する。
実施例1:報告された変異の1つ、ErbB413におけるD595Vは、ErbB4二量体化およびリン酸化14の増加につながった。変異の位置の可視化は、観察された機能的効果を理解する上で重要な要因であった:D595Vは、エクストドメインの二量体アームの対称的な交差で起こった(図2A)。腕は主に芳香族および疎水性であり、そして、バリンによる極性アスパラギン酸の置換は、二量体を安定させ、したがってリン酸化が起こる時間の長さを増加させる「粘着性」疎水性相互作用を増加させることが期待されるであろう。最初は各腕にアスパラギン酸塩を見つけることは驚きでしたが、振り返ってみると、極酸側鎖が無傷の二量体の親和性と寿命を低下させ、キナーゼ媒介リン酸化とシグナル伝達を制限する活動のタイミングメカニズムと考えるかもしれません。valineによる交換は、ErbB4ダイマーをさらに安定化させることによってこのセーフガードを取り除くだろう。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> 図2:キナーゼ死死性ErbB4を産生するErbB4活性化突然変異および突然変異の位置。 (A) D595 (活性化D595V突然変異) ErbB4エクトドメインモデルの芳香族/疎水性二量体アームに位置しています。成長因子結合に関連する武器;(近くの残基は棒として示される)。(B)ErbB4において、G802(G802dup突然変異を不活性化)は、ATPおよび触媒D861(不活性化D861Y突然変異)のアデニン環の周りに結合ポケットを形成するのに役立つ (D861Y突然変異を不活化する)とATPのγ-リン酸基の両方に結合する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
例2:キナーゼドメインのATP結合部位を標的とする体細胞突然変異が、シグナル伝達ができない障害またはキナーゼ死んだ受容体につながる酵素活性を変化または排除すると予想される。乳房、胃、大腸、またはNSCLC15の患者からの9つの報告された突然変異のうち、試験時の9つの突然変異のうち2つは、リン酸化活性16(G→GG)およびD861Yを非常に減少させた。16両方の不活性化体変異は、チロシンキナーゼドメイン構造のATP結合部位内で発見された(図2B):フレキシブルグリシン、複製された、アデニン環部位を改変し、末端リン酸塩付近の嵩高いチロシンに置き換えられた小さなアスパラギン酸は、Mg2+-ATPの結合を物理的に妨げるだろう。しかし、 ErbB4はErbB2とヘテロダイマーを形成することができるので-ErbB2は成長因子を結合せず、ヘテロ二次化するために行うErbBとの関連に依存する - ErbB2(活性)-ErbB4(キナーゼ死死)ヘテロダイマーは、Erk/Aktシグナル伝達経路を介して細胞増殖を刺激するが、キナーゼ死性ErbB4およびSTAT5経路活性化16の欠如のために細胞は分化しない。
最近の研究では、ErbBの動的な動きは、ErbB機能、特にチロシンキナーゼドメイン内で起こる突然変異に対するいくつかの突然変異の影響を理解することに関連することが明らかになった。チロシンキナーゼドメインは、AtPが結合する触媒部位によって分離されたN-lobe(主にβシート)とC-lobe(主にアルファヘリカル)で構成されています。N-lobeはαCヘリックスとPループを含み、活性化(Aループ)と触媒ループはC-lobe17、18、19,に17,存在する。19チロシンキナーゼドメインの結晶構造は2つの不活性な立体構造を明らかにし、構造の大部分はSrc様不活性状態を有する。アクティブな立体構造では、AtP結合部位に向かうAループ点の触媒的なアスパラギンスとαCヘリックスがATP結合ポケット(「αC-in」の立体構造)に向き、強いグルタミン酸リジンイオンペア相互作用を形成する。
Erbおよび成分キナーゼドメインは非常に動的な実体であり、特に機能および生物学的活性に対する突然変異の影響がErbBsの立体構造状態と密接に関連している可能性が高い場合、それらが経験する動的変化の範囲に関して突然変異を評価することが重要である。ErbBsのX線結晶構造は、突然変異の動的な結果を理解するのに関連する場合と関係ない3D構造の静的スナップショットを提供します。3次元(3D)構造に利用可能な「エネルギーランドスケープ」に対応する動的変化の範囲を探査するために、分子動力学(MD)シミュレーションは広く用いられている20。チロシンキナーゼドメイン内の局所的な立体構造変化または複合体の安定化につながる突然変異の場合、100nsの順序でのシミュレーションで十分であろう。しかしながら、より大きなスケールの立体構造変化(例えば、キナーゼドメインの能動と不活性な立体間の遷移)は、より長いシミュレーション時間を必要とする-マイクロ秒21の順に。
以下に説明するプロトコルに関して、チロシンキナーゼドメイン内の2つの活性化変異を考慮する(図3)。両方の突然変異はキナーゼドメイン内に位置し、キナーゼが活性かどうかを決定する局所的な立体構造変化が発生し、MDシミュレーションは両方のインスタンスに適用された。最初のケースでは、EGFR受信機キナーゼドメインのATP結合部位および触媒機械に直接影響する変化を検討し、NSCLC4,7に広く関与しているエキソン19欠失変異の結果を具体的に調べる。4,7δ746ELREA750突然変異は、αCヘリックスの前のβ3-αCループの長さを減少させる - キナーゼ活性化上の結合/活性部位に向かって移動し、ATPとの相互作用のためのリジンを配置することによって、らせんのE762とK745の間の重要な静電相互作用の形成に関与するらせん-12第2のケースでは、EGFRのA702V突然変異を考慮し、iScreamプラットフォーム9によって明らかにされた新規の機能獲得活性化突然変異であることを示し、NSCLC患者22で同定した。受信機キナーゼドメイン上のアラニン-702は、受信機と活性化剤キナーゼドメインの界面で並膜セグメントB上に位置し、この非対称キナーゼダイマー複合体およびキナーゼ立体構造変化が活性化9に必要である。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> 図3:EGFRの非対称キナーゼドメインダイマー。 A702V突然変異は、活性化剤および受信機キナーゼドメインの重要な界面に位置し、αCヘリックスに隣接し、アクチベータキナーゼのイソロイシン941に近い。非対称二量体の形成によって誘導される立体構造変化はキナーゼ活性化を導く。ELREAシーケンスを含むβ3-αCループは、αCヘリックスの直前に起きます。活性化中、αCのらせんはATP結合部位に向かって内側に移動します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

表皮成長因子受容体(EGFR)ファミリーの受容体チロシンキナーゼ(RTK)の多くの体細胞変異が癌患者から報告されているが、比較的少数の試験が行われ、Erbに機能的変化を引き起こすことが示されている。ErbB受容体はリガンド結合時に二量体化され活性化され、受容体の動的な立体構造変化は下流シグナル伝達の誘導に固有である。EGFR関数を変化させるために実験的に示された2つの変異、A702VおよびΔ746ELREA750 欠失変異について、分子動力学(MD)シミュレーションが野生型EGFRと比較して変異型チロシンキナーゼ構造の(1)立体構造安定性を探査する方法を次のプロトコルで示す。(2)構造的な結果と立体構造の推移と、観察された機能的変化との関係(3) 結合ATPの強度に及ぼす変異の影響、ならびに活性化された非対称二量体におけるキナーゼドメイン間の結合に対する影響;(4)活性化酵素に関連するEGFR結合部位内の主要な相互作用に対する突然変異の影響。このプロトコルは、構造力学と生物学的機能との関係を調査する手段として、MDシミュレーションを用いたタンパク質構造の調査に役立つ詳細なステップバイステップの手順とガイダンスを提供します。

記載されたプロトコルは、EGFRキナーゼ構造に対するΔELREAおよびA702V突然変異の構造的効果を研究するために使用された。このプロトコルの応用の一つは、MDシミュレーションからRMSD値とRMSF値を計算することによって、局所的な構造/立体構造の安定性に対する突然変異の影響を調査することでした。A702V突然変異がジャクスタメ膜Bセグメントに位置するので、開始構造に対する受信機キナーゼのこのセグメントのRMSDは、野生型およびA702V EGfrsの両方について計算された。結果(図4A)は、変異体の並生膜Bセグメントが、野生型EGFRキナーゼドメイン(平均RMSD1.1Å-95%CI 0.01)と比較して、100nsシミュレーション中に立体安定性を増加させたことを明らかにした(平均RMSD 0.7Å-95%信頼区間(CI)0.009)。これは、アラニン702(メチル基側鎖)を嵩高い疎水性残基に置き換え、バリン(イソプロピル基側鎖)によるダイマー界面での疎水性相互作用の引き締まりの結果である可能性が非常に高く、イソロイシン941のイソロイシンドメインでV702の疎水性相互作用が増加する。
ΔELREA突然変異は、機能的に重要なαCヘリックスに隣接するβ3-αCループに位置する。αCヘリックスの立体構造は、EGFRキナーゼの活性状態と非アクティブ状態の間をシフトする鍵となる。活性状態におけるαCヘリックスの立体安定性は、MDシミュレーション中にヘリックス内の残基のCα原子に対するRMSFを調べることによって評価された(図4B):全体として、変異体(平均RMSF 1.1Å - 95%CI 0.4)の変動が低い。N末端残基に対して記録された変動の差が最も高い。野生型キナーゼドメインの中央値構造とΔELREAキナーゼドメインの中央値構造に重ね合わせたサンプリングされた立体構造は、それぞれこれらの結果を支持する(図4C):野生型およびΔELREAキナーゼドメインは、β3-αCループおよびαCヘリックスを除いて、重ね合わせた立体構造に対して全体的に類似した安定性を有する。これらの知見は、ELREA配列の欠失が活性状態αC螺旋の動きを抑制し、したがって活性立体構造を抑制し、安定化することを示している。さらに、αCヘリックスは非対称ダイマー界面の一部を形成するので、変異体におけるαCヘリックスの拘束は、不斉二量体を安定化させる可能性が非常に高く、活性化状態の持続時間を延長する。
このプロトコルのもう一つの応用は、シミュレーション中に起こる主要な分子内および分子間相互作用の挙動を調査することです。従って、EGFR酵素活性の基本であるK745とE762の相互作用は、 MDシミュレーション中に2つの残基の側鎖極性原子間に形成された水素結合の占有率を測定することによって活性型野生型およびΔELREA EGFRキナーゼの両方について分析した(図5A):この主要な静電相互作用は、ΔELREAキナーゼドメインと比較してより頻繁に形成された。シミュレーション中のMg2+-ATPと野生型とΔELREA EGFRキナーゼドメイン(図5B)の相互作用も評価された(図5C):水素結合の数は、野生型EGFR(平均値3.2-95%CI.04)よりもΔELREA(平均値4.0〜95%CI 0.03)の方が大きかった。水素結合のさらなる分析は、K745がΔELREA EGFRにおけるATPのリン酸基とより頻繁に相互作用することを明らかにした。
プロトコルに記載されているMDシミュレーションは、タンパク質とタンパクリガンド相互作用に対する結合の相対的な自由エネルギーを評価するのにも有用である。野生型とA702V EGfrsのアクチベーターとレシーバキナーゼドメイン間の結合エネルギーと、ATPと野生型とΔELREA変異体キナーゼドメインとの間の結合エネルギーは、 分子力学の一般化された生まれた表面積(MMGBSA)計算(図6A):A702V突然変異体は、より低い平均ΔG結合値(平均ΔG結合=-76kcal/mol-95%CI 0.47)を産生し、野生型EGFRドメイン(平均ΔG結合=-61k/0.61)とは対照的に、より良好な二量体相互作用を表す。この観察は、A702V EGFRキナーゼドメインに対して観察された疎水性相互作用の増加による、より安定な並膜Bセグメントおよびより緊密な二量体界と一致する。野生型およびΔELREA EGFRキナーゼドメインにATP結合する場合(図6B)、MMGBSA計算は、野生型EGFR(ΔG結合-平均-48kcal/mol-95%CI.03)と比較して、ΔELREA突然変異体(平均ΔG結合-57kcal/molbind - 95%CI.43)と比較してより強いATP結合を予測する。この結果は、野生型ドメインと比較してATPとΔELREA EGFR(図5C)の間で記録された水素結合の数が多いと一致しています。
このプロトコルは、シミュレーション中に観測された立体構造の変化を調査するためにも使用できます。現在の研究では、ΔELREA突然変異が不活性なEGFR立体構造に及ぼす影響を、シミュレーションからのサンプル立体構造の目視検査および重ね合わせによって検討した。この解析により、ΔELREA EGFRキナーゼドメイン(図7A)におけるαCヘリックスの内向きの動きが明らかになった。これに対し、野生型不活性EGFRのαCらせんは、その初期の立体構造を維持した(図7B)。このように、MDシミュレーションは、キナーゼ活性40,41,41を増加させるという欠失突然変異を実験的に示す提案を支持し、非活性キナーゼから活性状態への立体シフトを促進する。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> 図4:MDシミュレーション中の活性EGFRキナーゼドメインの野生型および変異体の立体構造安定性。(A)野生型(青)とA702V(赤)受信機キナーゼドメインの並膜Bセグメント上のRMSD(バックボーン原子)。(B) αCヘリックスの残基に対する RMSF (Cα原子): 野生型 (青) および ΔELREA (金)(C)野生型(左)およびΔELREA(右)EGFRキナーゼドメインの重ね合わせたサンプリングされた立体構造;連鎖痕跡は、中央値構造に対して各残基のRMSD(Cα原子)に基づいて着色される。色彩は青から白、赤までさまざまで、高い立体構造の安定性を表します。なお、孤立キナーゼドメインの「遊離」N末端領域は、赤色で着色され、無傷のEGFR構造においてこのレベルの移動性を示さないであろう。チャクロボルティら9(図4Aは、生物化学雑誌の許可を得て再現)およびタミラットらから適応した図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> 図5:MDシミュレーション中のアクティブレシーバーキナーゼに見られる主な特徴:K745-E762塩ブリッジ、αCヘリックス、ATPとの相互作用。(A)野生型(青)およびΔELREA(金)EGFRキナーゼドメインのシミュレーション中のK745-E762相互作用の占有率。(B) 野生型およびΔELREA変異体の残基がATPと相互作用する(スティック)。Mg2+ (緑) は ATP と D855 の座標です。(C) MDシミュレーション中に野生型およびΔELREA EGFRキナーゼドメインの両方を用いてATPによって形成される水素結合の数。タミラットらから図12.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> 図6:シミュレーション中に変異型キナーゼドメインに対して結合の低い相対自由エネルギーが観察される。(A)野生型(青色)とA702V(赤)EGfrsのアクチベーターとレシーバキナーゼドメインとの相互作用について計算された結合エネルギー。(B)野生型(青)およびΔELREA(金)のEGFRキナーゼドメインへのATPのΔG結合。チャクロボルティら9(図6Aは生物化学雑誌の許可を得て再現)およびタミラットらから適応した図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> 図7:野生型およびΔELREA非活性EGFRキナーゼドメインからの上置された立体構造。αCヘリックスの立体構造(A)の野生型(青の中央値構造)および(B)ΔELREABEGfrs(金)。他のサンプリングされた立体構造、色あせた白色;MDシミュレーション前の初期構造、ピンク色。タミラットらから図12.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

このプロトコルの目的は、分子動力学シミュレーションを用いて、EGFRキナーゼタンパク質の活性化変異に起因する動的構造変化を調べることである。

分子動力学シミュレーションによるEGFR体型変異の活性化の構造効果の解読

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

分子動態シミュレーションは、分子運動を探索するために使用できる計算技術であり、生化学的および細胞機能を理解するために重要な立体構造の変化を明らかにすることができる。高分子にアクセスできる動的運動の範囲を探査することは困難である。分子動的シミュレーションの結果を実験データと組み合わせて使用することで、その機能の重要性を評価できます。がん患者に認められた変異がEGFR標的化の確認とリガンド結合に及ぼす影響を、分子動的シミュレーションを用いて実証します。野生型アポ活性EGFRのキナーゼ構造を準備するには、Kymera視覚化プログラムを開き、ファイルメニューの下で[IDでフェッチ]をクリックします。不足している構造2GS2要素を構築するには、他のEGFR構造からこれらのセグメントを取得します。5残基のグルタミン酸746をEGFRでアラニン750 ELREA欠失に構築し、お気に入り、配列、および野生型2GS2配列を開く示し配列をクリックする。そして、結果のシーケンスウィンドウで、編集をクリックし、シーケンスを追加して、削除ミュータント FASTA 形式シーケンスを選択します。整列ウィンドウで、構造とモデルまたは相同性を選択します。ポップアップウィンドウで、2GS2複合構造をテンプレートとして指定し、モデル化するクエリーとしてミュータントシーケンスを指定し、zDOPE スコアと目視検査に基づいて、生成されたモデルから変異モデルを選択します。野生型アポ非活性EGFRキナーゼ構造を調製するために、タンパク質データバンク構造2GS7を開き、他のEGFR構造から欠損セグメントを追加して、示されるように欠失変異体形態をモデル化する。ATP結合野生型活性EGFRキナーゼ構造を調製するには、タンパク質データバンク構造2ITXを原理構造として使用し、他のEGFR構造を用いて欠損セグメントを構築し、モデラーを使用して欠失変異体形態をモデリングする。野生型EGFR非対称ダイマー構造を構築するには、Kymeraで2GS2を開き、ツール、高次構造、およびユニットセルを開き、非対称配置でアクチベーターとレシーバーキナーゼを含む生物学的アセンブリに構造を変換する。2GS2構造を選択して、コピーを作成して入力し、対称操作から得られたダイマーの複数コピーから単一の非対称ダイマーを選択して保存します。アラニン702バリン変異体を構築するには、アラニン702をバリンに置き換えるツール、構造編集、およびロータマーを選択する。Maestroで構造を開き、タンパク質調製ウィザードボタンをクリックし、水素原子を追加し、不足している側鎖原子を充填し、プレプロセスをクリックします。pH 7.0でイオン化可能な残基のプロトンネーション状態を決定するには、PROPKAをクリックして、水素結合のためのアスパラギン、グルタミン、ヒスタミン残基の向きを最適化し、構造を最小限に抑えます。シミュレーションシステムを設定するには、LEAPプログラムを開き、アンバーFF14SB力場とTIP3P水分子をインポートします。ATP バインド システムの場合は、ATP のパラメータをインポートし、構造をロードします。タンパク質の表面原子から全方向に10オングストロームを拡張する明示的なTIP3P水分子を持つ八面体ボックス内の構造をソルベートします。ベルトシステムをチェックし、それを中和するために必要なイオンを追加します。生体分子系を十分にモデル化するには、さらにナトリウムと塩化物の原子をシミュレーションボックスに追加して、システムの塩濃度を0.15モルにし、次に、システムのトポロジと座標ファイルを生成して保存し、その後の生産シミュレーションの入力として機能させます。アンバーを使用すると、最初のエネルギーは、好ましくない構成を回避するためにシミュレーションシステムを最小化します。最小化入力ファイルで、最小最小化サイクルの最大サイクル変数とサイクル数を調整して、最も急な降下アルゴリズムのサイクル数を示します。拘束マスク パラメータで指定された溶質原子に拘束力を適用するには、拘束ウェイト変数を使用します。複数のステップで最小化を実行し、溶質原子に適用される拘束をモルオングストロームの正方形あたり25から0キロカロリーに徐々に下げ、そのコマンドを使用して最小化を実行します。0から300ケルビンまでの100ピコ秒のシステムを加熱し、溶質原子に正方形のオングストロームの拘束あたり10キロカロリーモルを設定するコマンドを使用します。その後、加熱を行うためにコマンドを使用します。等熱等圧アンサンブルの下で900ピコ秒のシステムを平衡化し、長距離静電相互作用のために9つのオングストローム距離カットオフを設定し、溶質原子拘束をモルオングストローム四方あたり0.1キロカロリーに徐々に下げ、拘束されていない5ナノ秒のシミュレーションで平衡を確定します。指定されたコマンドを使用してイコライゼーションを実行します。10 ピコ秒ごとに保存される立体構造で 100 ナノ秒の生産シミュレーションを実行できるようにテキストを調整し、指示に示されたコマンドでシミュレーションを実行します。野生型および変異型の EGFR キナーゼシミュレーション中に立体構造サンプルを視覚化するには、アンバートポロジ ファイルと対応する軌道ファイルを Visual Molecular Dynamics で開きます。便利な二次構造表現を用いて、記録された軌道からタンパク質の全体的な構造ダイナミクスを解析する。次に、触媒的に本質的なリジン745-グルタミン酸762塩架橋などの原子と目的の残基との間の特定の相互作用を見る。あるいは、シミュレーション中にサンプリングした複数の立体構造をプロテインデータバンク形式で保存し、Kymeraで立体構造を開きます。マッチメーカーオプションを使用して、初期構造または中央値構造に構造を重ね合わせ、中央値構造をソリッドで表示し、残りの位置合わせ構造を色あせた白色で表示することで、記録された構造の動きを見やすく表示できます。野生型および変異型の EGGFR のグローバル安定性を分析し、さまざまな構造単位の柔軟性を調べるには、アンバーの類型と対応する軌道ファイルをインポートします。二乗平均平方偏差入力ファイルでは、初期構造のバックボーン原子を、二乗平均平方継手の基準として示します。平方平方根の入力ファイルで、初期構造のC-α原子を、二乗平均平方継手の基準として示します。次に、CPPTRAJ プログラムを使用して分析を実行し、出力データをプロットします。また、立体構造アンサンブルを整列させ、C-α原子の平均平方偏差に基づいて各残基を色付けするには、Kymeraで立体構造を開き、マッチメーカーオプションに合わせます。ツール、描写、および属性によるレンダリングを選択します。立体構造アンサンブルの残基を選択し、C-αの二乗平均平方偏差を属性として設定し、[OK]をクリックします。立体構造の鎖跡は、それぞれ高、中、低構造安定性の領域を反映して青色、白色、または赤色になります。ATP と野生型および削除 EGfr の間の水素結合相互作用を分析するには、CPPTRAJ スクリプトを用意してこの作業を実行します。分子間水素結合の分析をノイントラモル変数でのみ指定し、ドナーアクセクサ距離が3.5オングストローム以下、結合角が135度以上の水素結合を定義します。分子内相互作用を評価するには、例えば、触媒的に重要なリジンとグルタミン酸残基の間で、リジンを水素供与剤として指定し、グルタミン酸をアクセプター残基として指定し、その結果の分析を可能にするように示されたスクリプトを実行する。ATPと野生型と欠失性EGFRの間の結合自由エネルギーを計算するには、LEAPプログラムで気相リガンド受容体およびリガンド受容体複合体タンパク質データバンクファイルを調製し、ATPをリガンド、EGFRを受容体として設定します。一般化された生まれの無線値をMボンドI2に設定します。次に、オレンジ色のトポロジを生成し、ガス相のタンパク質データバンクファイルの座標ファイルを作成します。同様に、野生型とアラニン702バリンEGRSのアクチベーターキナーゼとレシーバキナーゼとの間の結合自由エネルギーを計算するために、レセプターとしてリガンドとアクチベータキナーゼとして受信機キナーゼを指定し、対応するトポロジと座標ファイルを保存する。分子力学を一般化した生まれた表面積入力ファイルを準備し、IGB 値を 2 に、saltcon を 0.1 に設定します。その後、mmpbsaを使用します。amber で使用可能な py スクリプトは、示されたとおりにコマンドを入力して、バインディングエネルギー計算を実行し、出力データを分析します。この代表的な100ナノ秒のシミュレーションの間に、アラニン702バリン変異体は、野生型EGFRと比較してより緊密な疎水性相互作用による可能性が高い並膜Bセグメントの立体構造安定性の増加を示した。アラニン702バリン変異体はまた、野生型EGFRに対するアクチベーターとレシーバキナーゼ間の結合のより低い自由エネルギーを示し、活性EGFRキナーゼの立体構造を維持するより良好な二量体相互作用を表す。欠失変異のシミュレーションは、野生型EGFRと比較して機能的にキーαC-らせんのC-α原子変動が低くなり、EGFR活性状態の時間を延長した。また、欠失変異は、リジン745とグルタミン酸762の側鎖極性原子との間に頻繁に水素結合を形成することとなり、野生型EGFRと比較してEGFR酵素活性の重要な相互作用であった。さらに、野生型EGFRに比べて、ATPとEGFR間の水素結合数が欠失変異体に対して大きかった。また、欠失変異は、EGFR不活性状態αC-helixの内向きの動きをもたらし、活性状態への移行中に予想される構造的変化である。対照的に、野生型不活性EGFRのαCヘリックスは、その初期の立体構造を維持した。突然変異の影響を評価するには、構造の適切な立体構造状態を選択し、これらの構造を適切に準備し、平衡化することが重要です。これらの技術間の相乗効果が結果の解釈に役立ち、追加のウェットラボ実験を知らせることができるので、分子動的シミュレーションと実験研究を組み合わせることが重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...