Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Denne forskningen er finansiert av tilskudd til M.S.J fra Academy of Finland (308317, 320005), Sigrid Juselius Foundation og Tor, Joe og Pentti Borg minnefond, og til K.E. fra Academy of Finland (274728, 316796), Cancer Foundation of Finland, og Turku University Central Hospital. M.Z.T. er finansiert av Åbo Akademi Doktorgradsnettverk for informasjons- og strukturbiologi. Vi takker CSC IT Center for Science for databehandlingsressursene og Dr. Jukka Lehtonen for IT-støtten under Biocenter Finland bioinformatikk nettverk; og Biocenter Finland strukturell biologi infrastruktur nettverk.

MERK: De detaljerte trinnene som er tatt for å undersøke effekten av ΔELREA- og A702V-mutasjonen på EGFR-strukturen ved hjelp av MD-simuleringer, diskuteres som følger:
1. Struktur forberedelse
MERK: For å studere de strukturelle konsekvensene av ΔELREA-mutasjonen, er villtype og muterte former for apo aktive, ATP-bundne aktive og apo inaktive EGFR monomerstrukturer utarbeidet som følger.
<ol><li>Åpne Chimera23 visualiseringsprogrammet (<a href="https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/" target="_blank">https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a>) for å forberede den ville apo aktive EGFR kinasestrukturen. I Fil-menyen klikker du på Hent etter ID-alternativet og velger Protein Data Bank (PDB24) database og angi PDB-kode 2GS225 (2,8 Å oppløsning). PDB er et repositorium for 3D-strukturer løst ved ulike eksperimentelle teknikker, inkludert røntgenkrystallografi, kjernefysisk magnetisk resonansspektroskopi, kryoelektronmikroskopi og nøytrondiffraksjon.</li>
	<li>Bygg de manglende strukturelle elementene i 2GS2 ved å ta disse segmentene fra EGFR PDB strukturer 1M1426 (2,6 Å) og 3W2S27 (1,9 Å). For å gjøre dette, åpne 1M14 og 3W2S og legge dem på 2GS2 ved hjelp av MatchMaker alternativet i Verktøy → Struktur sammenligning menyen.<ol>
<li>Beskjær ut segmentene som skal legges til fra 1M14 og 3W2S. Velg terminalatomer av rester før hullene i 2GS2 og atomer som skal legges til fra 1M14 og 3W2S (for detaljert informasjon om de tilføyde segmentene, se tabell 1). På kommandolinjen type bond sel og trykk enter. Denne strukturen er malstrukturen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk malstrukturen fra trinn 1.2 til å konstruere ΔELREA sletting mutert form av EGFR kinase domenet. Produser FASTA-formatsekvensen til ΔELREA EGFR ved å lagre sekvensen av malstrukturen (Favorite → Sequence → File → save as) og deretter slette ELREA-sekvensen ved resttall 746-750.<ol>
<li>Åpne ΔELREA EGFR-sekvensen i Chimera, og juster den etter sekvensen av 2GS2-malstrukturen ved hjelp av Sekvens-menyen. I justeringsvinduet velger du alternativet Struktur → Modeller (homology)28.</li>
		<li>I popup-vinduet angir du 2GS2-komposittstrukturen som malen og mutantsekvensen som spørringen som skal modelleres. Trykk deretter på OK. Velg en mutantmodell blant de resulterende modellene, basert på zDOPE-poengsummen (vanligvis den laveste poengsummen) og visuell inspeksjon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For å forberede DEN ATP-bundne wild-type EGFR kinase struktur, bruk PDB struktur 2ITX29 (2,98 Å) som hovedstruktur. Bygg manglende segmenter (se tabell 1) ved hjelp av strukturene 2GS625 (2,6 Å) og 3W2S etter fremgangsmåten i trinn 1.2. Konverter ligand ANP i den resulterende strukturen til ATP ved å åpne PDB-filen i et tekstredigeringsprogram og endre N3B nitrogenatomet til ANP til et oksygenatom.</li>
	<li>Åpne strukturen i trinn 1.4 i Chimera som angitt i trinn 1.1. Tilsett en magnesiumion i denne strukturen fra PDB-strukturen 2ITN29 (2,47 Å) for å oppnå en lignende posisjonering for Mg2 + ion.</li>
	<li>Med strukturen som følge av trinn 1.5, modeller ΔELREA mutant form etter trinn 1.3.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Apo aktiv EGFR</td>
			<td>Apo inaktiv EGFR</td>
			<td>ATP-bundet aktiv EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hovedstruktur</td>
			<td>2. 2.</td>
			<td>2. 2. mars kl.</td>
			<td>2ITX</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Strukturer som brukes til å bygge manglende løkker</td>
			<td>1M14 (723-725)</td>
			<td>3W2S (958-984)</td>
			<td>2GS6 (862-865)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3W2S (967-981)</td>
			<td>4HJO (848-850)</td>
			<td>3W2S (990-1001)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Strukturer som brukes til å bygge sammensatte modeller av apo aktive, apo inaktive og ATP-bundne aktive strukturer. Manglende regioner (aminosyreområde i parentes) i hovedstrukturen ble bygget fra de oppførte strukturene.
<ol start="7"><li>For å forberede den vilt-type apo inaktiv EGFR kinase struktur, åpne PDB struktur 2GS725 (2,6 Å) som i trinn 1.1 og slette de bundne ligander og krystallografiske farvann. Legg til de manglende segmentene i 2GS7 (se tabell 1) fra strukturer 3W2S og 4HJO30 (2,75 Å) ved hjelp av fremgangsmåten i trinn 1.2. Basert på den endelige inaktive EGFR-strukturen, klargjør mutantmodellen ved hjelp av prosedyren i trinn 1.3. MERK: For A702V mutasjonsstudien studeres EGFR asymmetrisk dimerstruktur da mutasjonen ligger på juxtamembrane B-segmentet av kinasedomenet som utgjør en stor del av dimergrensesnittet. Wild-type og A702V mutant EGFR strukturer er utarbeidet som følger:</li>
	<li>Den ville asymmetriske dimerstrukturen er konstruert av PDB-strukturen 2GS2, som i utgangspunktet vises i monomerisk form. Hvis du vil konvertere til den biologiske forsamlingen som inneholder aktivatoren og mottakeren kinaser i asymmetrisk arrangement, åpne 2GS2 i Chimera som i (1.1) og utføre symmetri beregninger ved å klikke på Verktøy → Higher-Order Structure → Unit Cell menyen. Velg 2GS2-strukturen, og angi Lag kopier. Til slutt velger og lagrer du en enkelt asymmetrisk dimer fra flere kopier av dimeren som følge av symmetrioperasjonene.</li>
	<li>Bruk den asymmetriske EGFR-strukturen av villtype fra trinn 1.8, og bygg A702V-mutanten ved å erstatte alanine 702 med valine ved hjelp av tools → structure redigering → Rotamers-alternativet i Chimera. MERK: Samlet er seks monomeriske og to dimeriske EGFR-strukturer klargjort for henholdsvis ΔELREA- og A702V-mutasjonsstudiene. Hver struktur behandles deretter for simulering ved hjelp av proteinpreparatveiviseren i Maestro-programmet31 og MD-simuleringer er laget med Amber-programmet32.</li>
	<li>Åpne strukturen i Maestro ved hjelp av alternativet → importstruktur. Klikk deretter på proteinpreparatveiviserknappen og velg følgende: legg til hydrogenatomer, bygg manglende sidekjedeatomer, bestem protonasjonsstater av ioniserbare rester på pH 7.0 ved hjelp av PROPKA, optimaliser orienteringen av asparagin, glutamin og histidinrester for hydrogenbinding, og til slutt minimere strukturen.</li>
</ol>2. Systemoppsett
<ol><li>Åpne sprangprogrammet som er inkludert i Amber-programvarepakken. Importer ff14SB kraftfelt33 (kilde leaprc.protein.ff14SB) og TIP3Pvannmolekyler 34 (kilde leaprc.water.tip3p). For ATP-bundne systemer importerer også parametere for ATP35 (loadamberparams frcmod.fosfat, loadamberprep ATP.prep). Deretter laster du strukturen (mol = loadpdb structure.pdb).</li>
	<li>Solvate strukturen i en oktahedral boks med eksplisitte TIP3P vannmolekyler som strekker 10 Å i alle retninger fra overflaten atomer av proteinet (solvateoct mol TIP3PBOX 10.0).</li>
	<li>Kontroller det innebygde systemet (Kontroller mol) og nøytraliser det ved å legge til nødvendige ioner (addions mol Na + 0). For å tilstrekkelig modellere biomolekylære systemer, legg til ekstra Na+/ Cl- atomer i simuleringsboksen for å bringe systemets saltkonsentrasjon til 0,15 M (addions mol Na + X, addions mol Cl- X), hvor X erstattes av resultatet av: ønsket saltkonsentrasjon * antall vannmolekyler * volum per vannmolekyl * Avogadros nummer.</li>
	<li>Generere og lagre topologi og koordinere filer av systemet, som fungerer som innganger for den påfølgende produksjonssimulering (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).</li>
</ol>3. Molekylær dynamikk simulering
<ol><li>Ved hjelp av Amber, først utsette simuleringssystemet til 5000 sykluser av bratteste nedstigning og konjugere gradient energiminimering for å omgå ugunstige konfigurasjoner. Utfør minimeringen i flere trinn, og senk gradvis sikkerhetsbegrensningen på oppsnevelige atomer fra 25 kcal mol-1 Å-2 til 0 kcal mol-1 Å-2.<ol>
<li>Iminimeringsinndatafilen, min.in , justerer du maxcyc-variabelen for den totale minimeringssyklusen (maxcyc = 5000) og ncyc for å angi antall sykluser for den bratteste nedstigningsalgoritmen. Bruk restraint_wt til å bruke sikkerhetsstyrken på løse atomer som er angitt av sikkerhetsmaskparameteren. Kjør deretter minimeringen som følger: $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd MERK: Strategien og de faktiske parameterne som brukes, kan variere i henhold til egne preferanser. Detaljer og veiledning finner du fra Amber-håndboken og nettsiden (<a href="https://ambermd.org/index.php" target="_blank">https://ambermd.org/index.php</a>)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varm systemet for 100 hk fra 0 K til 300 K sette en 10 kcal mol-1 Å-2 tilbakeholdenhet på løse atomer. Hvis du vil gjøre dette, sett tempi = 0,0, temp0 = 300,0, dt = 0,002 ps, nstlim = 50000 og restraint_wt = 10 i heat.in inndatafilen. Utfør oppvarmingen med følgende kommando: $AMBERHOME/bin/sander -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
</li>
	<li>Likevekt systemet for 900 ps under en NPT ensemble; konstant antall atomer, temperatur (temp0 = 300,0) og trykk (ntp = 1), kontrollere den med Berendsen-metoden (ntt = 1). Sett en 9 Å avstand cutoff (cut = 9.0) for lang rekkevidde elektrostatiske interaksjoner. Senk gradvis den løse atomsikringen til 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Kjør likevektsinndatafilen som beskriver equil.in parameterne ovenfor på følgende måte: $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
</li>
	<li>Fullføre likevekt med en uhemmet 5 ns simulering (sett dt = 0,002 ps, ntslim = 2500000). $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
</li>
	<li>Kontroller at systemet har likevekt ved å undersøke temperatur- og trykk-, tetthets- og energiverdiene. $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out xmgrace sammendrag. TEMP/TETTHET/ETOT/EPTOT/EKTOT
</li>
	<li>Utfør produksjonssimuleringen for 100 ns (sett dt = 0,002 hk, ntslim = 5000000 i prod.in) og lagre konformasjoner hver 10.ntwx = 5000 $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst
</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Visuell inspeksjon<ol>
<li>Visualiser konformasjonene som ble samplet under wild-type og muterte EGFR kinase simuleringer ved å åpne X.prmtop amber topology filer og tilsvarende prod.mdcrd banefiler i VMD36. Ved hjelp av praktiske sekundære strukturrepresentasjoner, analyser den generelle strukturelle dynamikken til proteinene fra den registrerte banen. Vis spesifikke interaksjoner mellom atomer/rester av interesse, for eksempel den katalytisk essensielle K745 - E762 saltbroen.</li>
		<li>Alternativt kan du lagre flere konformasjoner som ble samplet under simuleringen i PDB-format og åpne dem ved hjelp av Chimera-programmet. Overimponer strukturene på den første eller medianstrukturen ved hjelp av MatchMaker-alternativet. Vis den første/medianstrukturen i fast stoff og resten av de justerte strukturene i falmet hvitt. Denne tilnærmingen gjør det mulig å visualisere de registrerte strukturelle bevegelsene med mer klarhet. MERK: Forslag til effektive representasjoner og behandling av konformasjonelle ensembler fra MDS finnes i Melvin et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>RMSD- og RMSF-analyse<ol>
<li>Beregne rot-gjennomsnittlige kvadratavvik (RMSD) og rot-gjennomsnittlige kvadratsvingninger (RMSF) beregninger med Cpptraj program38 for å analysere den globale stabiliteten av proteiner og undersøke fleksibiliteten til de ulike strukturelle enheter. I rmsd.in- og rmsf.in inndatafiler angir du ryggraden atomer (for RMSD) og Cα atomer (for RMSF) av den opprinnelige strukturen som referanse for RMS-tilpasning. I rmsd/rmsf.in-filene importerer du de gule topologifilene (parm X.promtop) og de tilsvarende banefilene (trajin prod.mdcrd). Kjør deretter kommandoen Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Plott utdata for analyse.</li>
		<li>Alternativt kan du justere konformasjonsensemer og farge hver rest basert på Cα atom RMSD. For å gjøre dette, åpne konformasjonene i Chimera og juster dem etter Matchmaker-alternativet.<ol>
<li>Gå til Verktøy → Avbilding → Gjengi etter attributt. Velg Rester av konformasjonsensemblet og Cα RMSD som attributtene, og klikk OK. Kjedespor av konformasjonene vil da bli farget fra blå → hvit →, henholdsvis reflekterer regioner med høy, middels og lav strukturell stabilitet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse av hydrogenbinding<ol>
<li>Analyser hydrogenbindingsinteraksjonen mellom ATP og villtype/ΔELREA EGFRs. Forbered et Cpptraj-skript, hbond.in, for å utføre denne oppgaven. Definer et hydrogenbånd med en donor-akseptor avstand på mindre enn eller lik 3,5 Å og en bindingsvinkel på større enn eller lik 135°. Spesifiser analyse kun for intermolekylære hydrogenbindinger med nointramolvariabelen, det vil vil at hydrogenbindinger mellom ATP og EGFR (hbond All nointramol dist 3.5 ut nhb.agr avgout avghb.dat). Kjør skriptet som Cpptraj -i hbond.in.</li>
		<li>Bruk dette skriptet til å vurdere intramolekylære interaksjoner, for eksempel mellom rester K745 og E762, som er viktige rester for EGFR kinaseaktivitet. For å gjøre dette, spesifiser K745 som hydrogenbindingsgiver og E762 som hydrogenbindingsrådgiver i hbond.in og kjør skriptet deretter.</li>
	</ol></li>
	<li>Overvåke avstanden mellom atomer<ol>
<li>Mål avstanden mellom K745 og E762 ved å åpne banene til villtype og ΔELREA apo EGFRs i VMD. Velg Cδ av Glu762 og Nz av Lys745 ved å klikke → etikett → binding. Overvåk avstanden under simuleringen ved å plotte en graf med grafikk → etiketter → lim → grafen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gratis energiberegninger<ol>
<li>For å beregne de estimerte bindingsfrie energiene mellom ATP og wild-type/ΔELREA EGFRs, og mellom aktivatoren og mottakeren kinaser av villtype/A702V EGFRs, bruk molekylærmekanikk generalisert Born overflateareal (MM-GBSA)modul 39 tilgjengelig i AMBER-pakken. Sett ATP som ligand og EGFR som reseptor i ΔELREA-studien. I A702V-studien angir du mottakeren kinase som ligand og aktivator kinase som reseptor.</li>
		<li>Først forberede ligand, reseptor og ligand-reseptor komplekse PDB-filer separat i spranget programmet sette PBRadii verdien til mbondi2. For PDB-filene lagrer du gassfasens ambertopologi (.prmtop) og koordinerer filer (INPCRD).</li>
		<li>Deretter, i mmgbsa inndatafilen, mmgbsa.in, sett igb = 2, saltcon = 0,1. Utfør bindende energiberegninger ved hjelp av banene til simuleringene, de forberedte reseptor/ligand-gule filene og parametrene i mmgbsa.in med MMPBSA.py-skriptet tilgjengelig i Amber som følger: $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
</li>
		<li>Analyser utdata, output.csv, ved å plotte grafer.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+ErbB+signalling+network.">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGFR+family:+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases.">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li><li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer:+Clinical+implications.">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li><li>. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.cbioportal.org">https://www.cbioportal.org</a> (2020)</li><li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations.">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li><li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+(EGF/ErbB)+Family+of+Receptors.">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB/HER+protein-tyrosine+kinases:+Structures+and+small+molecule+inhibitors.">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li><li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation.">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma.">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li><li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer.">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li><li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers.">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li><li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+ERBB4:+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer.">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li><li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function.">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li><li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms.">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li><li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+and+protein+function.">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li><li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase.">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor.">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li><li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor.">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li><li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based+EGFR+T790M/L858R+Mutant+Inhibitors.">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li><li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints.">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li><li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes:+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity.">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li><li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain.">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li><li>. Release 2018-3: Maestro Available from: <a target="_blank" href="https://www.schrodinger.com/maestro">https://www.schrodinger.com/maestro</a> (2018)</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2018. , (2018).</li><li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water.">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li><li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field.">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li><li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VMD:+Visual+molecular+dynamics.">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li><li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+ensembles+in+structural+biology.">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMPBSA.py:+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations.">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li><li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS.">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors.">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li><li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4/ErbB4+Kinase.">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollen som er beskrevet i denne studien fokuserer på å bruke molekylære dynamikksimuleringer for å undersøke lokale og globale strukturelle endringer som oppstår ved aktivering av somatiske mutasjoner av EGFR kinasedomenet. Selv om røntgenkrystallstrukturer av villtype og muterte EGFRs gir uvurderlig strukturell innsikt, skildrer de en eller noen få statiske representasjoner. Imidlertid er iboende til den biologiske funksjonen til ErbBs de nødvendige overgangene mellom enzymatisk inaktive og aktive tyrosinkinase, og påkaller dynamiske endringer i både strukturen og intramolekylære interaksjoner mellom kinasemonomerer. MD-simuleringer ble dermed utført for å undersøke den dynamiske naturen til EGFR tyrosinkinasedomenet, inkludert villtypestrukturen, den introduserte ΔELREA-slettingsmutasjonen og A702V-mutasjonen. Disse simuleringene var vellykkede i å belyse den sannsynlige rollen disse mutasjonene i strukturene og hvordan deres effekter på konformasjonen av tyrosinkinasedomenet ville føre til de eksperimentelt observerte økningene i EGFR kinaseaktivitet.
Et avgjørende skritt i denne protokollen er bruken av en relevant struktur for å vurdere virkningen av mutasjonen. En måte å velge en relevant simuleringsinndatastruktur på er å visualisere plasseringen av mutasjonen i den statiske 3D-strukturen og undersøke dens mulige innvirkning med hensyn til de nærliggende aminosyrene og strukturelle enhetene. I denne studien, for eksempel, siden A702V EGFR mutasjonen ligger på juxtamembrane B-segmentet som danner det asymmetriske dimergrensesnittet, er bruken av dimerstrukturen for simuleringen i motsetning til monomeren kritisk. Bruken av en monomerisk struktur ville ha utsatt juxtamembrane B-segmentet av mottakeren kinase til løsningsmidlet, frata det fra stabiliserende interaksjoner, forbedret av mutasjonen til en større hydrofobe rester og interaksjoner med isoleucine 941 fra C-lobe rester av aktivator kinase. Videre er det bemerkelsesverdig at 3D-strukturen representert ved koordinatene i en PDB-fil ikke nødvendigvis samsvarer med den biologisk relevante strukturen som skal brukes til studier. For eksempel, med strukturen til ErbB4, PDB-kode 3BCE, tilsvarer PDB-koordinatene en trimer, men dette skyldes krystallkontakter (få kontakter mellom monomerene ses når man visualiserer denne strukturen). Matriser i PDB-filen kan brukes (f.eks. innenfor Chimera) for å rekonstruere krystallografisk relaterte strukturer, som kan visualiseres for å identifisere kjeder som tilsvarer den biologisk relevante 3D-strukturen som rapportert i den opprinneligepublikasjonen 42. Et annet viktig trinn i protokollen er å forberede simuleringsinndatastrukturen på riktig måte, for eksempel å bygge manglende aminosyrer i forskjellige sløyferegioner, og spesielt der den ligger i nærheten av mutasjonen. Selv om det finnes mange egfr-strukturer av villtype i PDB, er det bare et begrenset antall muterte EGFR-strukturer tilgjengelig. Følgelig må mutantstrukturene også modelleres; for en enkelt restmutasjon som A702V ble Chimera brukt til å mutere rester; Mens, for ΔELREA sletting mutasjon, Modeller ble brukt.
De ulike parametrene som benyttes i simuleringsinndatafilene - for eksempel antall minimeringssykluser, oppvarming av systemet til ønsket temperatur på en gang eller i stedet varmes sakte gjennom flere mellomtemperaturer, tidsperioden for likevekt og for produksjonssimuleringene - kan endres basert på studiemolekylet, målet med arbeidet og ens egne preferanser. Mens du utfører MD-simuleringer, er det også vanlig å komme over feil som kan oppstå fra inndatafilene, problemer knyttet til simuleringsprogramvaren som er i bruk eller til og med en brukerfeil. Derfor er det svært viktig å forstå kilden til feilene ved å nøye undersøke eventuelle feilmeldinger. De fleste simuleringsprogrammer har en adresseliste der brukerne kan stille spørsmål til programvareutviklerne og til andre brukere der de fleste problemer kan løses. I tillegg gir brukerhåndbøker betydelig hjelp til å forstå detaljene i simuleringsprotokollen, inkludert forutsetninger og begrensninger. Selv om MD-simulering er et viktig verktøy for å utforske molekylenes dynamiske egenskaper, må du huske at beregningsresultatene må evalueres nøye sammen med andre informasjonskilder for å vurdere gyldigheten. Når det er mulig, samarbeid med forskere som er eksperter på proteiner som studeres, spesielt når relevante våt-lab eksperimentelle studier er gjort, som tjener til å gi resultater for strukturell tolkning samt å foreslå eksperimenter som kan gjøres basert på strukturelle observasjoner for å teste hypoteser.
I denne studien var protokollen effektiv i å undersøke de dynamiske strukturelle konsekvensene av ΔELREA- og A702V-mutasjonene på EGFR kinasestrukturer. Simuleringene viste at ΔELREA begrenser den funksjonelt essensielle αC-helixen og fremmer et konformasjonsskifte fra inaktiv kinase til en stabilisert aktiv kinase. Simuleringsresultatene støttes uavhengig av legemiddelresponsdata som viste effekten av tyrosinkinasehemmere på lungekreftcellelinjer som har ΔELREA-slettingsmutasjonen og gEFR av typen EGFR, hvor større hemming av legemidler som anerkjenner den aktive kinase conformation ble rapportert for ΔELREA enn for villtype EGFR12. Med A702V-mutasjonen indikerer MD-simuleringene, i forhold til den ville typen, økt stabilisering av aktivator-mottaker kinase-grensesnittet, samt høyere affinitet for aktivatoren og mottakeren kinase for hverandre, sammen støtter vedlikehold av aktivert konformasjon av EGFR kinase. A702V mutasjonen, som ligger på juxtamembrane B-segmentet av mottakeren kinase, ville øke hydrofobe interaksjoner med aktivator kinase, som fungerer for å forlenge varigheten av aktivert tilstand. A702V mutasjonen støtter celleoverlevelse i fravær av vekstfaktor og ble identifisert i en in vitro screening for EGFR mutasjoner9.

Den humane epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) av reseptortyrosinkinaser (RTKs) inkluderer fire medlemmer - EGFR/ ErbB1 / HER1, ErbB2 / HER2, ErbB3 / HER3 og ErbB4 / HER4. ErbB-reseptorene regulerer grunnleggende cellulære prosesser som cellevekst og spredning, differensiering, migrasjonog overlevelse 1,2, og er dermed potente proto-onkogener. Avvikende aktivitet av ErbB reseptorer, spesielt EGFR og ErbB2, har vært ofte forbundet med menneskelige kreftformer gjør ErbB reseptorer viktige mål for kreftterapeutiske 2,3.
Flere somatiske endringer av ERBB-gener er rapportert fra humanmaligniteter 3,4,5. De best karakteriserte eksemplene inkluderer tilbakevendende, aktiverende punktmutasjoner og korte in-frame slettinger i EGFR kinase domenet i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Disse EGFR mutasjonene representerer viktige drivere for kreftvekst, og forutsi følsomhet for EGFR rettet mot kreft medisiner6,7,8. Men i de fleste kreftformer forekommer somatiske mutasjoner i EGFR utenfor disse tilbakevendende "hotspots" og distribueres over hele 1210-restspanet til reseptoren. Faktisk har de fleste rester langs EGFR primære sekvensen vist seg å være mutert i human kreft9. Likevel, bortsett fra de få hotspots, er den funksjonelle betydningen av det store flertallet av de kreftrelaterte EGFR-mutasjonene fortsatt ukjent.
Den monomeriske strukturen til ErbBs består av et stort aminoterminal ekstracellulært domene, etterfulgt av en enkelt transmembrane helix som fører til intracellulær tyrosin kinase domene og C-terminal hale regionen som inneholder docking steder for intracellulære signalproteiner. Ligand binding utløser en dramatisk konformasjonsendring i det ekstracellulære domenet, noe som letter dannelsen av reseptordiderner ved å utsette dimeriseringsarmene som symmetrisk krysser over hverandre og samhandler med deres aromatiske / hydrofobe overflater. Ved reseptordyderdannelse kommer tyrosinkinasedomenene i kontakt asymmetrisk (figur 1), noe som resulterer i aktivering av kinasene som fosforyler C-terminalhalene til reseptormonomerene, og deretter i aktivering av nedstrøms signalering10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> Figur 1: Strukturen til EGFR-dimeren. EGFR dimmes når de ekstracellulære domenene binder vekstfaktor (EGF, epidermal vekstfaktor). Mottakeren kinase domenet aktiveres deretter gjennom asymmetrisk interaksjon med aktivator kinase domene, og C-terminal haler er autofosforyler på tyrosin rester (Modifisert fra Tamirat et al.12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
På grunn av de dynamiske strukturelle omorganiseringene som oppstår under monomer <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> dimer overganger, sammen med kinase aktivering som er forbundet med dannelsen av en asymmetrisk dimer, mutasjoner langs hele lengden av reseptorstrukturen kan potensielt ha en effekt på reseptorfunksjon. Her beskriver vi flere eksempler fra våre tidligere studier der modellering av mutasjon og visualisering var tilstrekkelig til å forklare konsekvensene for funksjon.
Eksempel 1: En rapportert mutasjon, D595V i ErbB413, førte til økt ErbB4-dimerisering og fosforylering14. Visualisering av mutasjonens plassering var en kritisk faktor for å forstå de observerte funksjonelle effektene: D595V forekom ved symmetrisk kryssing av de dimeriske armene i ektodomenet (figur 2A). Armene er i stor grad aromatiske og hydrofobe, og utskifting av polaraspartikkelsyre ved valin forventes å øke de "klissete" hydrofobe interaksjonene, stabilisere dimeren og dermed øke tiden når fosforylering finner sted14. Det var først en overraskelse å finne aspartat i hver arm, men i ettertid kan man tenke på det som en timingmekanisme for aktivitet, hvor polarsyresidekjedene reduserer affiniteten og levetiden til den intakte dimeren og dermed begrenser kinasemediert fosforylering og signalisering. Erstatning av valine ville da fjerne denne sikringen ved ytterligere å stabilisere ErbB4 dimer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> Figur 2: Plassering av en ErbB4 aktiverende mutasjon og mutasjoner som produserer kinasedøde ErbB4. (A) D595 (aktivere D595V mutasjon) ligger på aromatiske / hydrofobe dimeriske armer av ErbB4 ektodomene modellen; armene forbinder på vekstfaktorbinding; (rester i nærheten vises som pinner). (B)I ErbB4 bidrar G802 (inaktiverende G802dup mutasjon) til å danne bindingslommen rundt adeninringen til ATP og katalytisk D861 (inaktiverende D861Y mutasjon) binder både Mg2+ (ikke vist) og γ-fosfatgruppen av ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Eksempel 2: Man kan forutse at somatiske mutasjoner som retter seg mot det ATP-bindende stedet for kinasedomenet, vil endre eller eliminere enzymatisk aktivitet som fører til en svekket eller kinasedød reseptor som ikke er i stand til å signalisere. Av ni rapporterte mutasjoner fra pasienter med bryst, mage, kolorektal eller NSCLC15hadde to av de ni mutasjonene når de ble testet, svært redusert fosforyleringsaktivitet16: G802dup (G → GG) og D861Y. Begge inaktiverende somatiske mutasjoner ble funnet innenfor ATP bindingsstedet for tyrosin kinase domenestruktur (Figur 2B): fleksibel glycin, duplisert, ville endre adenin ring området og liten aspartiksyre erstattet av den store tyrosin nær terminalfosfater ville fysisk hindre Mg2 +-ATP fra binding. Men, siden ErbB4 kan danne en heterodimer med ErbB2 - ErbB2 binder ikke en vekstfaktor og avhenger av tilknytning til en ErbB som gjør det for å heterodimerisere - ErbB2 (aktiv)-ErbB4 (kinase-død) heterodimer ville stimulere cellespredning via Erk / Akt signalveien ennå celler ville ikke skille på grunn av kinase-død ErbB4 og mangel på STAT5 pathway aktivering16.
I nyere studier ble det klart at de dynamiske bevegelsene til ErbB-er var relevante for å forstå effekten av noen mutanter på ErbB-funksjonen, spesielt mutasjoner som forekommer innenfor tyrosinkinasedomenet. Tyrosinkinasedomenet består av en N-lobe (hovedsakelig β-ark) og C-lobe (i stor grad alfa spiralisk), som er adskilt av det katalytiske stedet der ATP binder seg. N-lobe inkluderer αC helix og P-loop, mens aktiveringen (A-sløyfe) og katalytiske løkker er til stede i C-lobe17,,18,,19. Krystallstrukturer av tyrosinkinasedomenet avslørte to inaktive konformasjoner, de fleste strukturer har den Src-lignende inaktive tilstanden. I den aktive konformasjonen peker det katalytiske aspartatet av A-sløyfen mot ATP-bindingsstedet, og αC-helixen er orientert mot ATP-bindingslommen ("αC-in" konformasjon), og danner en sterk glutamat-lysinion-pair interaksjon.
Fordi ErbBs og komponentkinasedomenet er svært dynamiske enheter, og spesielt for tilfeller der effekten av mutasjoner på funksjon og biologisk aktivitet sannsynligvis vil være tett knyttet til erbBs konformasjonsmessige tilstander, er det viktig å vurdere mutasjoner med hensyn til omfanget av dynamiske endringer de ville oppleve. Røntgenkrystallstrukturer av ErbB gir statiske øyeblikksbilder av 3D-strukturen, som kan eller ikke kan være relevante for å forstå de dynamiske konsekvensene av en mutasjon. For å undersøke omfanget av dynamiske endringer som tilsvarer "energilandskapet" som er tilgjengelig for en tredimensjonal (3D) struktur, er molekylær dynamikk (MD) simuleringer myebrukt 20. Ved mutasjoner som vil føre til lokale konformasjonsendringer innenfor tyrosinkinasedomenet eller stabilisering av et komplekst, kan simuleringer i rekkefølgen på 100 ns være tilstrekkelige. Imidlertid krever større samsvarsendringer (f.eks. overganger mellom de aktive og inaktive konformasjonene til kinasedomenet) en lengre simuleringstid - i rekkefølgen av mikrosekunder21.
Med hensyn til protokollen beskrevet nedenfor anser vi to aktiverende mutasjoner innenfor tyrosinkinasedomenet (figur 3). Begge mutasjonene ligger innenfor kinasedomenet på steder som opplever lokale konformasjonsendringer som dikterer om kinase er aktiv eller ikke, og dermed ble MD-simuleringer brukt i begge tilfeller. I det første tilfellet vurderer vi endringer som direkte påvirker ATP bindingsstedet og katalytiske maskiner i EGFR-mottakeren kinasedomenet, spesielt undersøke konsekvensene av en exon 19 sletting mutasjon som er mye innblandet i NSCLC4,7. Δ746ELREA750 mutasjon, som reduserer lengden på β3-αC-sløyfen før αC helix - helixen som beveger seg mot bindingen / aktive stedet på kinaseaktivering og deltar i å danne den kritiske elektrostatiske interaksjonen mellom E762 av helix og K745 ved å plassere lysinen for interaksjon med ATP - predisponerer domenet for aktivering12. I det andre tilfellet anser vi A702V mutasjonen av EGFR, vist seg å være en ny funksjonsgevinstaktiverende mutasjon avslørt av iScream-plattformen9 og identifisert i en NSCLC-pasient22. Alanine-702 på mottakeren kinase domenet ligger på juxtamembrane segment B på grensesnittet til mottakeren og aktivator kinase domener, der denne asymmetriske kinase dimer kompleks og kinase konformasjonsendringer er nødvendig for aktivering9.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> Figur 3: Asymmetrisk kinasedomenedyr av EGFR. A702V mutasjonen ville være plassert på det kritiske grensesnittet til aktivator- og mottakerkinasedomenene, ved siden av αC helix og nær isoleucine 941 av aktivator kinase. Konformasjonsendringer indusert ved dannelse av asymmetrisk dimer fører til kinaseaktivering. β3-αC-sløyfen som inneholder ELREA-sekvensen rett foran αC-helixen; under aktiveringen beveger αC-helixen seg innover mot ATP-bindingsstedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

Tallrike somatiske mutasjoner som forekommer i epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) familie (ErbB) av reseptor tyrosin kinaser (RTK) er rapportert fra kreftpasienter, selv om relativt få har blitt testet og vist seg å forårsake funksjonelle endringer i ErbB. ErbB-reseptorene er dimerized og aktivert ved ligand binding, og dynamiske konformasjonsendringer av reseptorene er iboende for induksjon av nedstrøms signalering. For to mutasjoner vist eksperimentelt for å endre EGFR-funksjonen, A702V og Δ746ELREA750-slettingsmutasjonen, illustrerer vi i følgende protokoll hvordan molekylær dynamikk (MD) simuleringer kan undersøke (1) konformasjonsstabiliteten til den muterte tyrosinkinasestrukturen sammenlignet med villtype EGFR; (2) strukturelle konsekvenser og konformasjonsoverganger og deres forhold til observerte funksjonelle endringer; (3) effekter av mutasjoner på styrken av bindende ATP samt for binding mellom kinasedomenene i den aktiverte asymmetriske dimeren; og (4) effekter av mutasjonene på viktige interaksjoner innenfor EGFR bindingsstedet forbundet med det aktiverte enzymet. Protokollen gir en detaljert trinnvis prosedyre samt veiledning som kan være mer generelt nyttig for undersøkelse av proteinstrukturer ved hjelp av MD-simuleringer som et middel til å sondere strukturell dynamikk og forholdet til biologisk funksjon.

Den beskrevne protokollen ble brukt til å studere de strukturelle effektene av ΔELREA- og A702V-mutasjonene på EGFR-kinasestrukturen. En anvendelse av protokollen var å undersøke effekten av mutasjonene på lokal strukturell/konformasjonsstabilitet ved å beregne RMSD- og RMSF-verdier fra MD-simuleringene. Siden A702V-mutasjonen ligger på juxtamemembrane B-segmentet, ble RMSD for dette segmentet av mottakeren kinase i forhold til startstrukturen beregnet for både wild-type og A702V EGFRs. Resultatet (Figur 4A) viste at juxtramembrane B-segmentet av muteratoren har økt konformasjonsstabiliteten under 100 ns simulering (gjennomsnittlig RMSD 0,7 Å - 95% konfidensintervall (KI) 0,009) sammenlignet med det ville EGFR kinase domenet (gjennomsnittlig RMSD 1,1 - 95% CI 0,01). Dette er svært sannsynlig et resultat av de strammere hydrofobe interaksjonene i dimergrensesnittet på grunn av utskifting av alanin 702 (metylgruppesidekjede) til en større hydrofobe rester, valin (isopropylgruppesidekjede), noe som fører til økt hydrofobe interaksjoner av V702 på mottakeren kinase domene med isoleucine 941 av aktivator kinase domene.
ΔELREA mutasjonen ligger ved β3-αC-sløyfen, ved siden av den funksjonelt kritiske αC-helixen; konformasjonen av αC helix er nøkkelen til skifte mellom de aktive og inaktive tilstander av EGFR kinase. Den konformasjonelle stabiliteten til αC-helixen i aktiv tilstand ble vurdert ved å undersøke RMSF over Cα-atomer av rester i helixen under MD-simuleringer (figur 4B): samlet sett, det er lavere svingninger i mutant (gjennomsnittlig RMSF 1,1 Å - 95% CI 0,4) i forhold til wild-type (gjennomsnittlig RMSF 1,5 Å - 95% CI 0,57); med den høyeste forskjellen i svingninger registrert for N-terminalrester. De samplede konformasjonene som henholdsvis er lagt på medianstrukturen til det ville kinasedomenet og ΔELREA kinasedomenet støtter også disse resultatene (figur 4C): både vilttype- og ΔELREA kinasedomenene har generell lignende stabilitet for de oversatte konformasjonene, med unntak av β3-αC-sløyfen og αC helix, som er klart mer stabile i ΔELREA EGFR. Disse funnene indikerer at sletting av ELREA-sekvensen begrenser bevegelsen av den aktive tilstanden αC helix, og dermed begrenser og dermed stabiliserer den aktive konformasjonen. Videre, siden αC helix utgjør en del av det asymmetriske dimergrensesnittet, vil begrensningene på αC-helixen i muteringen sannsynligvis stabilisere asymmetrisk dimer, og forlenge varigheten av den aktiverte tilstanden.
En annen anvendelse av protokollen er å undersøke oppførselen til viktige intra- og intermolekylære interaksjoner som finner sted under simuleringen. Interaksjonen mellom K745 og E762, som er grunnleggende for EGFR enzymatisk aktivitet, ble analysert for både den aktive formen villtype og ΔELREA EGFR kinase ved å måle prosentandelen belegg av hydrogenbindinger dannet mellom sidekjede polaratomer av de to rester under MD-simuleringene (Figur 5A): denne viktige elektrostatiske interaksjonen ble dannet oftere i ΔELREA kinasedomenet i forhold til det ville kinasedomenet, på grunn av det mer stabile αC-helix som rommer E762. Interaksjonene mellom Mg2+-ATP og wild-type og ΔELREA EGFR kinase domener (Figur 5B) under simuleringen ble også vurdert (Figur 5C): antall hydrogenbindinger var større for ΔELREA (gjennomsnittlig verdi 4,0 - 95% KI 0,03) enn for villtypen EGFR (gjennomsnittlig verdi 3,2 - 95% KI 0,04). Videre analyse av hydrogenbindingene viste at K745 samhandler oftere med fosfatgruppene i ATP i ΔELREA EGFR, som er knyttet til den mer stabile K745-E762-interaksjonen som er nevnt i simuleringen av ΔELREA mutert EGFR kinasedomene.
MD-simuleringer som beskrevet i protokollen er også nyttige for å vurdere den relative frie energien til binding for protein-protein og protein-ligand interaksjoner. Bindingen gir energi mellom aktivatoren og mottakeren kinase domener av wild-type og A702V EGFRs, og mellom ATP og wild-type og ΔELREA mutant EGFR kinase domener, ble beregnet fra molekylære mekanikk generaliserte Beregninger av Born overflateareal (MMGBSA)(figur 6A):A702V mutert produserte en lavere gjennomsnittlig ΔG-bindeverdi (gjennomsnittlig ΔGbind = -76 kcal/mol - 2 95 % KI 0,47), som representerer gunstigere dimmerinteraksjoner, i motsetning til egfr-domenet av villtype (gjennomsnittlig ΔGbind = -61 kcal/mol – 95 % KI 0,61).bind Denne observasjonen er konsistent med det mer stabile juxtamembrane B-segmentet og strammere dimer-grensesnittet på grunn av økte hydrofobe interaksjoner observert for A702V EGFR kinasedomenet. Når det gjelder ATP-binding til wild-type- og ΔELREA EGFR kinasedomenene (figur 6B),forutsier MMGBSA-beregninger sterkere ATP-binding med ΔELREA-mutanten (gjennomsnittlig ΔGbind -57 kcal/mol - 95 % KI 0,43) sammenlignet med gVENFR av villtype (gjennomsnittlig ΔGbind -48 kcal/mol - 95 % KI 0,33). Dette resultatet er i tråd med det større antallet hydrogenbindinger registrert mellom ATP og ΔELREA EGFR (figur 5C) sammenlignet med wild-type-domenet.
Protokollen kan også brukes til å undersøke konformasjonsendringer observert under en simulering. I den nåværende studien ble effekten av ΔELREA-mutasjonen på den inaktive EGFR-konformasjonen studert ved visuell inspeksjon og superposisjonering av de samplede konformasjonene fra simuleringen. Analysen avdekket en indre bevegelse av αC helix i ΔELREA EGFR kinase domene (Figur 7A), en strukturell endring forventet under overgangen til aktiv tilstand. I motsetning opprettholdt αC-helixen av villtype inaktiv EGFR sin første konformasjon (figur 7B). Dermed støtter MD-simuleringene forslaget om at slettingsmutasjonen, vist eksperimentelt for å øke kinaseaktiviteten40,41, fremmer et konformasjonsskifte fra den inaktive kinase mot den aktive tilstanden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> Figur 4: Villtype og mutert konformasjonsstabilitet for det aktive EGFR kinasedomenet under MD-simuleringer. (A) RMSD (ryggradatomer) over juxtamembrane B-segmentet av wild-type (blå) og A702V (rød) mottaker kinase domene. (B) RMSF (Cα atomer) over rester av αC helix: villtype (blå) og ΔELREA (gull). (C) Superposed samplet konformasjoner av villtype (venstre) og ΔELREA (høyre) EGFR kinase domene; kjedespor farget basert på RMSD (Cα atomer) av hver rest med hensyn til medianstrukturen. Fargestoffer varierer fra blått til hvitt til rødt, noe som representerer områder med høy til lav konformasjonsstabilitet. Vær oppmerksom på at de "gratis" N-terminalområdene i det isolerte kinasedomenet, farget rødt, ikke ville vise dette mobilitetsnivået i den intakte EGFR-strukturen. Tall tilpasset fra Chakroborty et al.9 (Figur 4A gjengitt med tillatelse fra Journal of Biological Chemistry) og Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> Figur 5: Viktige funksjoner sett i den aktive mottakeren kinase under MD simuleringer: K745-E762 saltbro, αC helix og interaksjoner med ATP. (A) Prosent belegg for K745-E762-interaksjonen under simuleringen av wild-type (blå) og ΔELREA (gull) EGFR kinase domener. (B)Rester av villtype og ΔELREA mutant i samspill med ATP (pinner). Mg2+ (grønn) koordinater med ATP og D855. (C) Antall hydrogenbindinger dannet av ATP med både wild-type og ΔELREA EGFR kinase domener under MD simuleringer. Figur fra Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> Figur 6: Lavere relative frie energier for binding observeres for muterte kinasedomener under simuleringene. (A) Bindingsenergier beregnet for samspillet mellom aktivatoren og mottakeren kinase domener av wild-type (blå) og A702V (rød) EGFRs. (B) ΔGbind av ATP til villtype (blå) og ΔELREA (gull) EGFR kinase domener. Tall tilpasset fra Chakroborty et al.9 (Figur 6A gjengitt med tillatelse fra Journal of Biological Chemistry) og Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> Figur 7: Oversatte konformasjoner fra wild-type og ΔELREA inaktiv EGFR kinase domene. Konformasjon av αC helix og A-loop helix av (A) villtype (median struktur i blått) og (B) ΔELREA EGFRs (gull). Andre samplede konformasjoner, falmet hvit; før MD-simuleringene, rosa. Figur fra Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Målet med denne protokollen er å bruke molekylære dynamikksimuleringer for å undersøke de dynamiske strukturelle endringene som oppstår på grunn av aktivering av mutasjoner av EGFR kinaseproteinet.

Dechiffrere de strukturelle effektene av aktivering av EGFR somatiske mutasjoner med molekylær dynamikksimulering

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

Molekylær dynamisk simulering er en beregningsteknikk som kan brukes til å utforske molekylære bevegelser og kan avsløre konformasjonsendringer som er avgjørende for å forstå biokjemisk og cellulær funksjon. Det er vanskelig å granske utvalget av dynamiske bevegelser som er tilgjengelige for en makromolekyl. Ved hjelp av resultatene fra molekylære dynamiske simuleringer i forbindelse med eksperimentelle data gjør det mulig å vurdering av deres funksjonelle betydning.Vi vil demonstrere ved hjelp av molekylære dynamiske simuleringer hvordan mutasjoner observert hos kreftpasienter påvirker EGFR målrettingsbekreftelser og ligandbinding. For å forberede wild-type apo aktiv EGFR vår kinase struktur, åpne Kymera visualisering program, og under fil-menyen, klikk hent av ID.Velg Protein Data Bank database og angi Protein Data Bank 2GS2 kode. For å bygge de manglende strukturelle 2GS2-elementene, hent disse segmentene fra andre EGFR-strukturer.For å konstruere de fem rester glutamat 746 til alanine 750 ELREA sletting i EGFR, klikk favoritt, sekvens, og vis sekvens for å åpne wild-type 2GS2 sekvens. Og i det resulterende sekvensvinduet klikker du rediger og legg til sekvens for å velge slettemutant FASTA-formatsekvensen. Velg strukturen og modellen ellerhomologien i justeringsvinduet.I popup-vinduet angir du 2GS2-komposittstrukturen som malen og mutantsekvensen som spørringen som skal modelleres, og deretter velger du en mutantmodell fra de resulterende modellene basert på zDOPE-poengsummen og visuell inspeksjon. For å forberede den ville apo inaktive EGFR kinasestrukturen, åpne Protein Data Bank struktur 2GS7 og legge til de manglende segmentene fra de andre EGFR strukturer, modellering sletting mutant form som demonstrert. For å forberede den ATP-bundne villtypeaktive EGFR kinasestrukturen, bruk Protein Data Bank struktur 2ITX som prinsippstruktur, bygge de manglende segmentene ved hjelp av andre EGFR strukturer og modellering sletting mutant form ved hjelp av modelleren som demonstrert.For å konstruere den ville EGFR asymmetriske dimerstrukturen, åpne 2GS2 i Kymera og klikk verktøy, høyere ordrestruktur og enhetscelle for å konvertere strukturen til den biologiske samlingen som inneholder aktivatoren og mottakeren kinases i asymmetrisk arrangement. Velg 2GS2-strukturen og skriv inn lag kopier, og velg deretter og lagre en enkelt asymmetrisk dimer fra flere kopier av dimeren som følge av symmetrioperasjonene. For å bygge alanine 702 valine mutant, velg verktøy, strukturredigering og rotamers for å erstatte alanine 702 med valin.Åpne strukturene i Maestro og klikk på knappen for proteinforberedelsesveiviser, velg deretter legg til hydrogenatomer og fyll ut manglende sidekjedeatomer og klikk på forhåndsprosessen. For å bestemme protonasjonsstatene til irmelige rester ved pH 7.0, klikk avgrense og bruk PROPKA for å optimalisere orienteringen av asparagin, glutamin og histaminrester for hydrogenbinding, og deretter minimere strukturen. Hvis du vil konfigurere simuleringssystemet, åpner du LEAP-programmet og importerer det gule FF14SB-kraftfeltet og TIP3P-vannmolekylene.Importer parametere for ATP for ATP-bundet systemer og laster inn strukturen. Solvate strukturen i en oktahedral boks med eksplisitte TIP3P vannmolekyler som strekker 10 angstroms i alle retninger fra overflaten atomer av proteinet. Kontroller beltesystemet og legg til de nødvendige ionene for å nøytralisere det.For å tilstrekkelig modellere biomolekylære systemer, legg til ekstra natrium- og kloridatomer i simuleringsboksen for å bringe systemets saltkonsentrasjon til 0,15 molar, og deretter generere og lagre topologien og koordinere filene til systemet for å tjene som innganger for den påfølgende produksjonssimuleringen. Ved hjelp av Amber minimerer energi i utgangspunktet simuleringssystemet for å omgå eventuelle ugunstige konfigurasjoner. I minimeringsinndatafilen justerer du den maksimale syklusvariabelen for den totale minimeringssyklusen og antall sykluser for å angi antall sykluser for den bratteste nedstigningsalgoritmen.Bruk sikkerhetsvektvariabelen til å bruke sikkerhetsstyrken på de løse atomene som er angitt av sikkerhetsmaskeparameteren. Utfør minimeringen i flere trinn, og senking av sikkerhetsbegrensningen som påføres på de løse atomene fra 25 til 0 kilokalorier per mole angstrom square, og bruk deretter kommandoen til å kjøre minimeringen. Varm systemet for 100 picosekunder fra 0 til 300 Kelvin og bruk kommandoene til å sette en 10 kilocalorie molar per firkantet angstrom tilbakeholdenhet på løse atomer.Bruk deretter kommandoen til å utføre oppvarmingen. Likevekt systemet for 900 picoseconds under en isotermisk isobar ensemble og sette en ni angstrom avstand cutoff for lang rekkevidde elektrostatiske interaksjoner, gradvis senke den solute atom tilbakeholdenhet til 0,1 kilocalorie per mole angstrom square og fullføre likevekt med en uhemmet fem nanosekund simulering. Kjør utjevning med kommandoen som angitt.Juster teksten slik at produksjonssimuleringen kan utføres for 100 nanosekunder med konformasjonene som lagres hver 10 picoseconds, og kjør deretter simuleringen med kommandoen som angitt. Hvis du vil visualisere konformasjonsprøven under de ville og muterte EGFR kinasesimuleringene, åpner du Amber topologi-filene og de tilsvarende banefilene i Visual Molecular Dynamics. Og ved hjelp av praktiske sekundære strukturrepresentasjoner, analyser den generelle strukturelle dynamikken til proteinene fra den registrerte banen.Vis deretter spesifikke interaksjoner mellom atomer og rester av interesse, for eksempel katalytisk essensiell lysin 745-glutamat 762 saltbro. Alternativt kan du lagre flere konformasjoner som ble samplet under simuleringen i Protein Data Bank-format og åpne konformasjonene i Kymera. Bruk matchmaker-alternativet til å legge strukturene på den første eller medianstrukturen og vise medianstrukturen i fast stoff og resten av de justerte strukturene i falmet hvitt for å tillate visualisering av de registrerte strukturelle bevegelsene med mer klarhet.For å analysere den globale stabiliteten til de ville og muterte EGFRs og for å undersøke fleksibiliteten til de forskjellige strukturelle enhetene, importer du Amber typologi og tilsvarende banefiler. I roten gjennomsnittlig kvadratavvik inndatafil, angi ryggraden atomer av den opprinnelige strukturen som referanse for roten gjennomsnittlig firkantet montering. I roten gjennomsnittlig kvadratsvingninger inndatafilen, angi C-alfa atomer av den opprinnelige strukturen som referanse for roten gjennomsnittlig firkantet montering.Kjør deretter analysen med CPPTRAJ-programmet og plott utdata. Alternativt, for å justere konformasjonsensemblene og farge hver rest basert på C-alfa atom rot gjennomsnittlig firkantet avvik, åpne konformasjonene i Kymera og justere dem med matchmaker alternativet. Velg verktøy, skildring og gjengivelse etter attributt.Velg rester av konformasjonsensemblene, og angi C-alfa-rotens gjennomsnittlige firkantavvik som attributtene, og klikk deretter OK. Kjedesporet av konformasjonene vil være farget blå, hvit eller rød som reflekterer regionene med henholdsvis høy, middels og lav strukturell stabilitet. For å analysere hydrogenbindingsinteraksjonene mellom ATP og både villtype og sletting EGFRs, klargjør du et CPPTRAJ-skript for å utføre denne oppgaven. Spesifiser analysen for intermolekylære hydrogenbindinger bare med nointramolvariabelen og definer en hydrogenbinding med en donoraksjeavstand på mindre enn eller lik 3,5 angstroms og en bindingsvinkel på større enn eller lik 135 grader.For å vurdere intramolekylære interaksjoner, for eksempel mellom katalytisk viktige lysin og glutamatrester, spesifiser lysin som hydrogendonor og glutamat som acceptorrester og kjøre skriptet som angitt for å tillate analyse av resultatet. For å beregne de bindende frie energiene mellom ATP og både wild-type og sletting EGFRs, forberede gassfasen ligand reseptor og ligand reseptor komplekse Protein Data Bank filer i LEAP-programmet og sette ATP som ligand og EGFR som reseptor. Sett den generaliserte fødte radioverdien til M Bond I2. Deretter generere Amber topologi og koordinere filer for gassfasen Protein Data Bank filer.Tilsvarende, for å beregne bindende frie energier mellom aktivatoren og mottakeren kinases av villtype og alanin 702 valine EGFRs, angi mottakeren kinase som ligand og aktivator kinase som reseptoren og lagre tilsvarende topologi og koordinere filer. Forbered en molekylær mekanikk generalisert født overflateområdeinndatafil og sett IGB-verdien til to og saltkonen til 0,1. Deretter bruker mmpbsa.py script tilgjengelig i Amber, skriver du inn kommandoen som angitt for å utføre bindingsenergiberegningene og analysere utdata. I løpet av denne representative 100 nanosekundersimuleringen viste alanin 702 valinemutanten økt konformasjonsstabilitet av juxtamembrane B-segmentet sannsynligvis på grunn av strammere hydrofobe interaksjoner sammenlignet med den ville egfr. Alanine 702 valine mutant viste også en lavere fri energi av binding mellom aktivator og mottaker kinases i forhold til vill-type EGFR, som representerer mer gunstige dimer interaksjoner som opprettholder den aktive EGFR kinase konformasjon.Simulering av slettingmutasjonen resulterte i lavere C-alfa atomsvingninger i den funksjonelt viktige alfa C-helixen sammenlignet med den ville egfr, og forlenget tiden for EGFR aktiv tilstand. Slettingsmutasjonen resulterte også i hyppig dannelse av hydrogenbindinger mellom sidekjedepolare atomer av lysin 745 og glutamat 762, en viktig interaksjon for EGFR enzymatisk aktivitet sammenlignet med villtype EGFR. I tillegg var antall hydrogenbindinger mellom ATP og EGFR større for slettingmutanten for den villtypen EGFR.Slettingsmutasjonen resulterte også i en indre bevegelse av EGFR inaktiv tilstand alfa C-helix, en strukturell endring forventet under overgangen til aktiv tilstand. I motsetning opprettholdt alfa C-helix av villtype inaktiv EGFR sin første konformasjon. For å vurdere virkningen av mutasjonene, er det viktig å velge de riktige konformasjonsmessige tilstander av strukturene og å forberede og likevekte disse strukturene på riktig måte.Det er viktig å kombinere molekylære dynamiske simuleringer med eksperimentelle studier som synergi mellom disse teknikkene nytte tolkningen av resultatene og kan informere flere våte laboratorieeksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produksjon av rekombinante PRMT-proteiner ved hjelp av Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering av dynamikken i krysskoblede og enkle mikrotubuler in vitro av TIRF mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...