Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Это исследование финансируется за счет грантов M.S.J от Академии Финляндии (308317, 320005), Сигрид Juselius Фонда и Tor, Джо и Пентти Борг мемориальный фонд, и К.Е. из Академии Финляндии (274728, 316796), Онкологический фонд Финляндии, и Турку университетской центральной больницы. М.З.Т. финансируется докторской сетью информационной и структурной биологии Збо Академи. Мы благодарим ИТ-центр CSC за вычислительные ресурсы и д-ра Jukka Lehtonen за ИТ-поддержку в рамках сети биоинформатики Biocenter Finland; и сеть инфраструктуры структурной биологии Biocenter Finland.

<ol>
	<li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+ErbB+signalling+network.">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGFR+family:+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases.">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li><li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer:+Clinical+implications.">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li><li>. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.cbioportal.org">https://www.cbioportal.org</a> (2020)</li><li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations.">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li><li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+(EGF/ErbB)+Family+of+Receptors.">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB/HER+protein-tyrosine+kinases:+Structures+and+small+molecule+inhibitors.">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li><li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation.">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma.">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li><li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer.">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li><li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers.">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li><li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+ERBB4:+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer.">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li><li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function.">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li><li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms.">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li><li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+and+protein+function.">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li><li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase.">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor.">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li><li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor.">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li><li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based+EGFR+T790M/L858R+Mutant+Inhibitors.">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li><li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints.">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li><li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes:+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity.">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li><li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain.">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li><li>. Release 2018-3: Maestro Available from: <a target="_blank" href="https://www.schrodinger.com/maestro">https://www.schrodinger.com/maestro</a> (2018)</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2018. , (2018).</li><li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water.">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li><li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field.">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li><li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VMD:+Visual+molecular+dynamics.">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li><li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+ensembles+in+structural+biology.">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMPBSA.py:+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations.">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li><li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS.">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors.">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li><li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4/ErbB4+Kinase.">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Протокол, описанный в этом исследовании, фокусируется на использовании моделирования молекулярной динамики для исследования локальных и глобальных структурных изменений, возникающих в результате активации соматических мутаций домена EGFR kinase. Хотя рентгеновские кристаллические структуры диких и мутантных EGFRs обеспечивают неоценимую структурную проницательность, они изображают одно или несколько статических представлений. Однако, присущие биологической функции ErbBs является необходимым переходов между энзиматично неактивных и активных тирозинкиназы, ссылаясь на динамические изменения как в структуре и внутримолекулярных взаимодействий между киназы мономеров. Таким образом, было проведено моделирование MD для зондирования динамического характера домена тирозинкиназы EGFR, включая структуру дикого типа, введенную мутацию удаления ЗЕЛЬРЕА и мутацию A702V. Эти моделирования были успешными в выяснении вероятной роли этих мутаций в структурах и как их влияние на конформацию домена тирозинкиназы приведет к экспериментально наблюдаемому увеличению активности EGFR киназы.
Важным шагом в этом протоколе является использование соответствующей структуры для оценки воздействия мутации. Один из способов выбрать соответствующую структуру ввода моделирования заключается в визуализации местоположения мутации в статической 3D-структуре и изучении ее возможного воздействия по отношению к соседним аминокислотам и структурным единицам. В этом исследовании, например, так как мутация A702V EGFR находится в сегменте juxtamembrane B, который формирует асимметричный интерфейс димера, использование структуры димера для моделирования, в отличие от мономера имеет решающее значение. Использование мономерной структуры подвергло бы juxtamembrane B сегмент киназы приемника растворителя, лишая его от стабилизирующими взаимодействиями, усиленными мутацией к более большим гидрофобным остаткам и взаимодействиям с изолеуцином 941 от остатков C-доли киназы активатора. Кроме того, следует отметить, что 3D-структура, представленная координатами в файле PDB, не обязательно соответствует биологически релевантной структуре, которая должна использоваться для изучения. Например, со структурой ErbB4, PDB-кодом 3BCE, координаты PDB соответствуют тримеру, но это связано с кристаллическими контактами (при визуализации этой структуры видны контакты между мономерами). Матрицы в файле PDB могут быть использованы (например, в Chimera) для реконструкции кристаллографически связанных структур, которые могут быть визуализированы для выявления цепей, которые соответствуют биологически релевантной 3D-структуры, как сообщается в первоначальнойпубликации 42. Другим важным шагом протокола является правильное подготовить структуру ввода моделирования, например, создание недостающих аминокислот в различных областях цикла, и особенно там, где находится в непосредственной близости от мутации. Хотя в PDB существуют многочисленные структуры EGFR дикого типа, доступно лишь ограниченное число мутантных структур EGFR. Следовательно, структуры мутантов также должны быть смоделированы; для одной остаточной мутации, такой как A702V, Химера использовалась для мутации остатков; в то время как для мутации удаления ЗЕЛЕРЕА использовался Моделлер.
Различные параметры, используемые в файлах ввода моделирования - например, количество циклов минимизации, нагревание системы до нужной температуры за один раз или вместо нагрева медленно через несколько промежуточных температур, период времени для равноденствия и для производственного моделирования - могут быть изменены на основе молекулы исследования, цели работы и собственных предпочтений. При проведении моделирования MD, он также является общим, чтобы встретить ошибки, которые могут возникнуть из входных файлов, вопросы, связанные с программным обеспечением моделирования в использовании или даже ошибка пользователя. Поэтому очень важно понимать источник ошибок, тщательно изучая любые сообщения об ошибках. Большинство программ моделирования имеют список рассылки, где пользователи могут задавать вопросы разработчикам программного обеспечения и другим пользователям, с помощью которых большинство проблем может быть решено. Кроме того, руководства пользователей оказывают существенную помощь в понимании деталей протокола моделирования, включая предположения и ограничения. Хотя моделирование MD является важным инструментом для изучения динамических свойств молекул, помните, что вычислительные результаты должны быть тщательно оценены в сочетании с другими источниками информации для оценки их достоверности. Всякий раз, когда это возможно, работа вместе с исследователями, которые являются экспертами по белкам в исследовании, особенно там, где соответствующие мокрой лаборатории экспериментальных исследований, которые служат для обеспечения результатов для структурной интерпретации, а также предложить эксперименты, которые могут быть сделаны на основе структурных наблюдений для проверки гипотез.
В этом исследовании протокол был эффективен в изучении динамических структурных воздействий мутаций ЗЕЛЕРЕА и A702V на структуры киназы EGFR. Моделирование показало, что ЗЕЛЕРЕА сдерживает функционально необходимую спираль КК и способствует конформации перехода от неактивной киназы к стабилизированной активной киназе. Результаты моделирования независимо поддерживаются данными о реакции на наркотики, которые продемонстрировали влияние ингибиторов тирозинкиназы на линии раковых клеток легких, имеющих мутацию удаления ЗЕЛЬРЕА и ЭГФР дикого типа, где большее ингибирование препаратами, распознавающих активную конформацию киназы, было сообщено для ЗЕЛЬРЕА, чем для EGFRдикого типа 12. С мутацией A702V, моделирование MD показывает, по сравнению с диким типом, повышенную стабилизацию интерфейса киназы активатора-приемника, а также более высокое сродство активатора и приемника киназы друг для друга, вместе поддерживая поддержание активированной конформации киназы EGFR. Мутация A702V, расположенная на сегменте juxtamembrane B киназы приемника, увеличит гидрофобные взаимодействия с активатором киназы, функционирующей для продления продолжительности активированного состояния. Мутация A702V поддерживает выживаемость клеток при отсутствии фактора роста и была выявлена в пробирке при скрининге на мутации EGFR9.

Семейство рецепторов эпидермального фактора роста человека (EGFR) (ErbB) рецепторов тирозинкиназ (RTKs) включает в себя четыре члена - EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 и ErbB4/HER4. Рецепторы ErbB регулируют фундаментальные клеточные процессы, такие как рост клеток и пролиферации,дифференциация, миграция и выживание 1,2, и, таким образом, мощные прото-онкогены. Анома дюрант активность рецепторов ErbB, особенно EGFR и ErbB2, часто ассоциируется с раком человека, что делает рецепторы ErbB ключевыми целями длялечения рака 2,3.
Несколько соматических изменений генов ERBB были зарегистрированы от злокачественных новообразованийчеловека 3,,4,,5. Лучшие характерные примеры включают периодические, активации точечных мутаций и короткие в кадре удаления в домене EGFR киназы при не-малоклеточного рака легких (NSCLC). Эти мутации EGFR представляют собой ключевые факторы роста рака, и предсказать чувствительность к EGFR ориентациирака наркотиков 6,,7,,8. Однако, в большинстве видов рака, соматические мутации в EGFR происходят за пределами этих повторяющихся "горячих точек" и распространяются по всему 1210-остаток диапазона рецепторов. Действительно, большинство остатков вдоль первичной последовательности EGFR были найдены, чтобы мутировать в рак человека9. Тем не менее, помимо нескольких горячих точек, функциональная значимость подавляющего большинства связанных с раком мутаций EGFR остается неизвестной.
Мономерная структура ErbBs состоит из большого амино-терминала внеклеточного домена, за которым следует одна трансмембранная спираль, ведущая к внутриклеточному домену тирозинкиназы и области хвоста C-терминала, которая содержит стыковочный участки для внутриклеточных сигнальных белков. Лиганд связывания вызывает резкое конформации изменения во внеклеточной области, которая облегчает формирование рецепторов димеров, подвергая димеризации оружия, которые симметрично пересекают друг друга и взаимодействуют с их ароматических / гидрофобных поверхностей. При формировании рецептора димер тирозинкиназы вступают в контакт асимметрично(рисунок 1), в результате чего активация киназы, что фосфорилат C-терминал хвосты рецепторов мономеров, а затем в активации вниз потечению сигнализации 10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> Рисунок 1: Структура димера EGFR. EGFR dimerizes, когда внеклеточные домены связывают фактор роста (EGF, эпидермальный фактор роста). Затем домен приемника киназы активируется через асимметричное взаимодействие с доменом киназы активатора, а хвосты C-терминала самофосфорилируются на остатках тирозина (модифицированные из Тамирата идр. 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Из-за динамических структурных перестановок, которые происходят во время мономерных переходов димера, наряду с активацией киназы, которая <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> связана с образованием асимметричного димера, мутации по всей длине структуры рецепторов потенциально могут иметь влияние на функцию рецепторов. Здесь мы описываем несколько примеров из наших предыдущих исследований, в которых моделирование мутации и визуализации было достаточно, чтобы объяснить последствия для функции.
Пример 1: Один сообщил мутации, D595V в ErbB413, привело к увеличению ErbB4 димеризации ифосфорилирования 14. Визуализация местонахождения мутации была критическим фактором в понимании наблюдаемых функциональных эффектов: D595V произошел при симметричном кроссовере димерикических рук эктодомена(рисунок 2А). Руки в основном ароматические и гидрофобные, и замена полярной аспарагиновой кислоты валин, как ожидается, увеличит "липкие" гидрофобные взаимодействия, стабилизируют димер и, следовательно, увеличить продолжительность времени, когда фосфорилирование происходит14. Это было неожиданностью на первый найти аспарта в каждой руке, но в ретроспективе можно было бы думать о нем, как механизм времени для деятельности, где полярной кислоты боковых цепей уменьшить близость и срок службы нетронутыми димер и, следовательно, ограничить киназы опосредованного фосфорилирования и сигнализации. Замена валин затем удалить эту гарантию путем дальнейшей стабилизации ErbB4 димер.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> Рисунок 2: Расположение активации мутации ErbB4 и мутаций, производящих киназы мертвых ErbB4. (A) D595 (активация мутации D595V) расположен на ароматических/гидрофобных димерикических руках эктодомаина модели ErbB4; оружие ассоциируется с обязательным фактором роста; (близлежащие остатки показаны как палочки). (B) В ErbB4, G802 (инактивация мутации G802dup) помогает сформировать связывающий карман вокруг аденинового кольца АТФ и каталитической D861 (инактивация мутации D861Y) связывает как Mg2 "(не показано) и γ-фосфатной группы АТФ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Пример 2: Можно предвидеть, что соматические мутации, нацеленные на АТФ-связывающее место домена киназы, изменят или устранят энзиматические действия, ведущие к ослаблению или киназно-мертвому рецептору, неспособен к сигнализации. Из девяти зарегистрированных мутаций у пациентов с грудной, желудочной, колоректальной или NSCLC15,две из девяти мутаций при тестировании имели сильно уменьшеннуюфосфорилционную активность 16: G802dup (G → GG) и D861Y. Обе инактивирующие соматические мутации были найдены в месте связывания АТФструктуры домена тирозинкиназы (рисунок 2B):гибкий глицин, дублируется, изменит место ангенин кольцо и небольшой аспарагиновой кислоты заменен громоздкий тирозин вблизи терминала фосфатов будет физически предотвратить Mg2 "-ATPот связывания. Тем не менее, так как ErbB4 может образовывать гетенодимер с ErbB2 - ErbB2 не связывает фактор роста и зависит от ассоциации с ErbB, что делает для того, чтобы гетенодимеризировать - ErbB2 (активный)-ErbB4 (киназы мертвых) гетенодимер будет стимулировать пролиферацию клеток через Erk / Akt сигнализации путь еще клетки не будут дифференцировать из-за киназы мертвых ErbB4 и отсутствие активации путиSTAT5 16.
В более поздних исследованиях стало очевидно, что динамические движения эрббов имеют отношение к пониманию влияния некоторых мутантов на функцию ErbB, особенно мутаций, которые происходят в области тирозинкиназы. Область тирозинкиназы состоит из N-доли (в основном β листов) и C-доли (в основном альфа-хеликал), которые разделены каталитической сайт, где АТФ связывает. N-доля включает в себя спираль qC и P-петлю, в то время как активация (A-loop) и каталитические петли присутствуют в C-доле17,18,19. Кристаллические структуры домена тирозинкиназы выявили две неактивные конформации, большинство структур имеют Src-подобное неактивное состояние. В активной конформации каталитический аспартат A-петли указывает на сайт связывания АТФ, а спираль КЗ ориентирована на связующий карман АТФ («К-в» конформации), образуя сильное взаимодействие глутамата-лизина ион-пары.
Поскольку эрббы и область компонентов киназы являются высокодинамиными объектами, и особенно в тех случаях, когда влияние мутаций на функцию и биологическую активность, вероятно, тесно связано с конформационными состояниями Эрббов, важно оценить мутации в отношении диапазона динамических изменений, которые они будут испытывать. Рентгеновские кристаллические структуры Эрббса обеспечивают статические снимки 3D-структуры, которые могут иметь или не иметь отношения к пониманию динамических последствий мутации. Для зондирования диапазона динамических изменений, соответствующих "энергетическому ландшафту", доступен трехмерной (3D) структуре, молекулярной динамики (MD) моделирования широкоиспользуются 20. В случае мутаций, которые привели бы к локальным конформационным изменениям в домене тирозинкиназы или стабилизации комплекса, моделирование порядка 100 нс может быть достаточным. Однако более масштабные конформные изменения (например, переходы между активными и неактивными конформациями домена киназы) требуют более длительного времени моделирования - порядкамикросекунд 21.
Что касается протокола, описанного ниже, мы рассматриваем две активации мутаций в домене тирозинкиназы(рисунок 3). Обе мутации расположены в домене киназы в местах, которые испытывают локальные конформационные изменения, которые диктуют, активна ли киназа или нет, и, таким образом, в обоих случаях применялись моделирования MD. В первом случае мы рассматриваем изменения, которые непосредственно влияют на сайт связывания АТФ и каталитический механизм домена киназы приемника EGFR, в частности, изучая последствия мутации удаления exon 19, которая широко замешана в NSCLC4,7. МутацияNO 746ELREA750, которая уменьшает длину цикла Q3-К, предшествующего спирали QC - спирали, которая движется к связывающему/активному месту активации киназы и участвует в формировании критического электростатического взаимодействия между E762 спирали и K745 путем позиционирования лизина для взаимодействия с АТФ - предрасполагает доменк активации 12. Во втором случае, мы рассматриваем A702V мутации EGFR, показано, что новый усиления функции активации мутации выявлены iScreamплатформы 9 и определены в NSCLC пациента22. Аланин-702 на домене приемника киназы расположен на juxtamembrane сегменте B на интерфейсе приемника и активатора киназы доменов, в которых этот асимметричный киназы димер комплекс и киназы конформации изменения необходимы дляактивации 9.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> Рисунок 3: Асимметричный домен киназы димер EGFR. Мутация A702V будет расположена на критическом интерфейсе доменов активатора и приемника киназы, прилегающих к спирали КК и близко к изолеуцину 941 активатора киназы. Конформациальные изменения, вызванные образованием асимметричного димера, приводят к активации киназы. Цикл NO3-К, содержащий последовательность ELREA, непосредственно предшествует спирали КК; во время активации спираль QC движется внутрь к месту связывания АТФ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

Многочисленные соматические мутации, происходящие в эпидермальных рецепторов фактора роста (EGFR) семьи (ErbB) рецепторов тирозин киназ (RTK) были зарегистрированы у больных раком, хотя относительно немногие из них были протестированы и показано, вызывают функциональные изменения в ErbBs. Рецепторы ErbB затемнены и активируются при связывании лиганда, а динамические конформационные изменения рецепторов присущи индукции сигнализации ниже по течению. Для двух мутаций, экспериментально измененных функцией EGFR, A702V имутацией удаленияELREA750, мы иллюстрировать в следующем протоколе, как молекулярная динамика (MD) моделирования могут зондировать (1) конформационную стабильность структуры мутант тирозинкиназы по сравнению с диким типом EGFR; (2) структурные последствия и конформации переходов и их связь с наблюдаемых функциональных изменений; (3) влияние мутаций на прочность связывающего АТФ, а также на связывание доменов киназы в активированном асимметричном димере; и (4) влияние мутаций на ключевые взаимодействия в месте связывания EGFR, связанное с активированным ферментом. Протокол обеспечивает подробную пошаговую процедуру, а также руководство, которое может быть более в целом полезно для исследования белковых структур с использованием моделирования MD в качестве средства для зондирования структурной динамики и отношения к биологической функции.

Описанный протокол был использован для изучения структурных эффектов мутаций ЗЕЛЕРЕА и A702V на структуру киназы EGFR. Одним из применений протокола было исследовать влияние мутаций на местную структурную/конформациюную стабильность путем вычисления значений RMSD и RMSF из моделирования MD. Поскольку мутация A702V находится в сегменте juxtamemembrane B, RMSD этого сегмента приемника киназы относительно стартовой структуры был рассчитан как для дикого типа, так и для ЭГФР A702V. Результат (Рисунок 4A) показал, что сегмент juxtramembrane B мутанта увеличил конформационную стабильность во время моделирования 100 ns (средний RMSD 0.7 - 95% интервал доверия (CI) 0.009) по сравнению с областью киназы дикого типа EGFR (средний RMSD 1.1 й - 95% CI 0.01). Это очень вероятно, в результате ужесточения гидрофобных взаимодействий на димер интерфейс из-за замены аланина 702 (метиловая группа боковой цепи) на громоздкие гидрофобные остатки, валин (изопропил группы боковой цепи), что приводит к увеличению гидрофобных взаимодействий V702 на приемник киназы домена с изолеуцином 941 активора киназы домена.
Мутация ЗЕЛЬРЕА расположена в петле No3-К, примыкающей к функционально критической спирали КК; конформация спирали КК является ключом к сдвигам между активными и неактивными состояниями киназы EGFR. Конформациальная стабильность спирали КЗ в активном состоянии была оценена путем изучения RMSF над атомами атомов C-атомов остатков в спирали во время моделирования MD(рисунок 4B): в целом, есть более низкие колебания в мутанте (средний RMSF 1.1 - 95% CI 0.4) по сравнению с диким типом (средний RMSF 1.5 - 95% CI 0.57); с наибольшей разницей в колебаниях, зарегистрированных для остатков N-терминала. Выборонные конформации, соответственно, налагаются на медианную структуру домена киназы дикого типа и домена киназы ЗЕЛРЕА также поддерживают эти результаты (рисунок4C):как области дикого типа, так и домены киназы QELREA имеют общую аналогичную стабильность для сверхпоставленных конформаций, за исключением цикла Q3-C и спирали QC, которые явно более стабильны в EGREA. Эти данные свидетельствуют о том, что удаление последовательности ELREA сдерживает движение активного состояния спирали КК, следовательно, сдерживая и тем самым стабилизируют активную конформацию. Кроме того, поскольку спираль КС является частью асимметричного димерного интерфейса, ограничения на спираль к КЗ у мутанта, скорее всего, стабилизируют асимметричный димер, продлевая продолжительность активированного состояния.
Еще одно применение протокола заключается в расследовании поведения ключевых внутри- и межмолекулярных взаимодействий, происходящих во время моделирования. Таким образом, взаимодействие между K745 и E762, которое имеет основополагающее значение для enzymatic деятельности EGFR, был проанализирован как для активной формы дикого типа, так и для киназы ЗЕЛЬРЕА EGFR путем измерения процентной заполняемости водородных связей, образоваваемых между боковыми полярными атомами двух остатков во время моделирования MD (рисунок5A):это ключевое электростатическое взаимодействие чаще формировалось в домене киназы ЗЕЛЕРЕА по сравнению с доменом киназы дикого типа, благодаря более стабильному домену E.C. Взаимодействия между Mg2 "-ATPи дикого типа и ELREA EGFR киназы доменов(рисунок 5B) в ходе моделирования были также оценены(рисунок 5C): количество водородных связей были больше для ЗЕЛЕРЕА (среднее значение 4,0 - 95% CI 0,03), чем для дикого типа EGFR (среднее значение 3,2 - 95% CI 0,04). Дальнейший анализ водородных связей показал, что K745 чаще взаимодействует с фосфатными группами АТФ в ЗЕЛЬРЕА EGFR, что связано с более стабильным взаимодействием K745-E762, отмеченным в моделировании домена киназы мутанта ЭГФРА.
Моделирование MD, описанное в протоколе, также полезно для оценки относительно свободной энергии связывания для белково-белковых и белково-лигандовых взаимодействий. Связывающие энергии между активатором и приемником киназы доменов дикого типа и A702V EGFR, а также между АТФ и дикого типа и qELREA мутант EGFR киназы доменов, были вычислены изbind молекулярной механики обобщенных Борн поверхности (MMGBSA) расчеты (Рисунок 6A): A702V мутант производится более низкое среднее значение связывания йG (средний йGсвязывать -76 ккал / мол - 95% CI 0.47), представляющих более благоприятные димерные взаимодействия, в отличие от домена EGFR дикого типа (средняяпривязка КГ -61 ккал/мол - 95% ДИ 0,61). Это наблюдение согласуется с более стабильным сегментом juxtamembrane B и более жестким интерфейсом димера из-за увеличения гидрофобных взаимодействий, наблюдаемых для домена киназы A702V EGFR. В случае привязки АТФ к доменам киназы дикого типа и ЗЕЛЬРЕА EGFR(рисунок 6B),расчеты MMGBSA предсказывают более сильную привязку АТФ с мутантом КЕЛЕРЕА (средняя привязка -57 ккал/мол - 95% CI 0,43) по сравнению с EGFR дикого типа (средняя привязка -48 ккал/мол - 95% CI 0,33).bind bind Этот результат соответствует большему числу водородных связей, зарегистрированных между АТФ и ЗЕЛЬРЕА EGFR(рисунок 5C) по сравнению с областью дикого типа.
Протокол также может быть использован для исследования конформациальных изменений, наблюдаемых во время моделирования. В текущем исследовании влияние мутации ЗЕЛЕРЕА на неактивную конформацию EGFR изучалось визуальным осмотром и суперпозиционированием отобранных конформаций из моделирования. Анализ выявил внутреннее движение спирали КК в домене киназы ЗЕЛЬРЕА EGFR (рисунок7A),структурные изменения, ожидаемые при переходе в активное состояние. В отличие от этого, спираль дикого типа неактивных EGFR сохранила свою начальную конформацию(рисунок 7B). Таким образом, моделирование MD поддерживает предложение о том, что мутация удаления, показанная экспериментально дляувеличения активности киназы 40,41, способствует конформации переход от неактивной киназы к активному государству.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> Рисунок 4: Дикий тип и мутант конформации стабильности активного домена EGFR киназы во время моделирования MD. (A) RMSD (атомы позвоночника) над сегментом juxtamembrane B дикого типа (синий) и A702V (красный) приемник киназы домена. (B) RMSF (атомы СЗ) над остатками спирали КК: дикого типа (синий) и ЗЕЛЕРЕА (золото). (C)Спроверенные образцы конформаций дикого типа (слева) и ЗЕЛЬРЕА (справа) домена EGFR киназы; цепные следы, окрашенные на основе RMSD (атомов C) каждого остатка по отношению к медианной структуре. Окраска варьируется от синего до белого до красного, представляющих регионы с высокой до низкой конформации стабильности. Обратите внимание, что «свободные» N-терминалы изолированных киназных доменов, окрашенных в красный цвет, не будут проявлять такой уровень мобильности в нетронутой структуре EGFR. Цифры, адаптированные из Chakroborty et al.9 (рисунок 4A воспроизводится с разрешения журнала биологической химии) и Тамират и др.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> Рисунок 5: Ключевые особенности, замеченные в активном приемнике киназы во время моделирования MD: соляной мост K745-E762, спираль к КЗ и взаимодействие с АТФ. (A)Процентная заполняемость взаимодействия K745-E762 во время моделирования доменов киназы дикого типа (синий) и ЗЕЛЬРЕА (золото). (B)Остатки дикого типа и мутанта ЗЕЛРЕА, взаимодействующих с АТФ (палками). Mg2 "(зеленый) координирует с АТФ и D855. (C) Количество водородных связей, образованных АТФ как с диким типом, так и с доменами киназы ЕГФРА во время моделирования MD. Рисунок из Тамират и др.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> Рисунок 6: Нижние относительные свободные энергии связывания наблюдаются для доменов мутантной киназы во время моделирования. (A)Связывание энергий, рассчитанных для взаимодействия между активатором и приемником киназы доменов дикого типа (синий) и A702V (красный) EGFRs. (B)привязкаАТФ к областям киназы дикого типа (синий) и ЗЕЛЬРЕА (золото). Цифры, адаптированные из Chakroborty et al.9 (Рисунок 6A воспроизводится с разрешения журнала биологической химии) и Тамират идр. 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> Рисунок 7: Суперпоставленные конформации от дикого типа и неактивного домена EGFR kinase. Конформация спирали ИК и спирали A-петли(A)дикого типа (средняя структура синим цветом) и(B)ЗЕЛЬРЕА EGFRs (золото). Другие образцы конформаций, выцветшие белые; первоначальные структуры до моделирования MD, розовый. Рисунок из Тамират и др.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Цель этого протокола заключается в использовании молекулярной динамики моделирования для изучения динамических структурных изменений, которые происходят из-за активации мутаций белка киназы EGFR.

Расшифровка структурных эффектов активации соматических мутаций EGFR с помощью моделирования молекулярной динамики

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

Молекулярно-динамическое моделирование является вычислительной техникой, которая может быть использована для изучения молекулярных движений и может выявить конформациальные изменения, критически важные для понимания биохимической и клеточной функции. Прощупыв диапазон динамических движений, доступных для макромолекулы трудно. Использование результатов молекулярно-динамического моделирования в сочетании с экспериментальными данными позволяет оценить их функциональную значимость.Мы продемонстрируем с помощью молекулярно-динамического моделирования, как мутации, наблюдаемые у онкологических больных, влияют на EGFR, нацеленные на подтверждения и связывание лигандов. Чтобы подготовить дикий тип апо активной структуры EGFR нашей киназы, откройте программу визуализации Kymera, и под меню файла, нажмите принести ID.Select базы данных белка банка данных и указать код банка данных белка 2GS2. Для создания недостающих структурных элементов 2GS2 приобретайте эти сегменты у других структур EGFR.Чтобы построить пять остатков глутамата 746 аланина 750 ELREA удаления в EGFR, нажмите любимый, последовательность, и показать последовательность, чтобы открыть дикий тип 2GS2 последовательности. И в результате окна последовательности, нажмите редактировать и добавить последовательность, чтобы выбрать удаление мутанта FASTA формат последовательности. В окне выравнивания выберите структуру и модель или гомологию.В всплывающем окне укажите композитную структуру 2GS2 в качестве шаблона и мутантную последовательность в качестве запроса, который будет смоделирован, а затем выберите модель мутанта из полученных моделей на основе оценки zDOPE и визуального осмотра. Чтобы подготовить неактивную структуру киназы EGFR дикого типа, откройте структуру Банка данных 2GS7 и добавьте недостающие сегменты из других структур EGFR, моделируя форму мутанта удаления, как это было продемонстрировано. Для подготовки активной структуры киназы КИНАзы с использованием киназы СПС, используя структуру банка данных 2ITX в качестве принципиальной структуры, строя недостающие сегменты с использованием других структур EGFR и моделируя форму мутанта удаления с помощью модельера, как это было продемонстрировано.Чтобы построить асимметричную структуру димера дикого типа EGFR, откройте 2GS2 в Kymera и нажмите инструменты, более высокую структуру порядка и ячейку единицы для преобразования структуры в биологическую сборку, которая содержит активатор и приемник киназы в асимметричном расположении. Выберите структуру 2GS2 и введите копии, затем выберите и сохраните один асимметричный димер из нескольких копий димера в результате операций симметрии. Чтобы построить аланин 702 валин мутант, выберите инструменты, редактирование структуры, и ротамеры, чтобы заменить аланин 702 с валином.Откройте структуры в Maestro и нажмите кнопку мастера приготовления белка, затем выберите добавить атомы водорода и заполнить недостающие атомы боковой цепи и нажмите предварительной обработки. Чтобы определить состояния протонации ионизируемых остатков при рН 7.0, нажмите уточнить и использовать PROPKA для оптимизации ориентации аспарагина, глутамина и гистамина остатков для водорода связи, а затем свести к минимуму структуру. Чтобы настроить систему моделирования, откройте программу LEAP и импортировать силовое поле Amber FF14SB и молекулы воды TIP3P.Для систем, связанных с АТФ, параметры импорта АТФ и загрузка структуры. Solvate структуры в октагедральной коробке с явным TIP3P молекулы воды, которая простирается 10 ангстремов во всех направлениях от поверхности атомов белка. Проверьте систему ремня и добавьте необходимые ионы, чтобы нейтрализовать его.Чтобы достаточно моделировать биомолекулярные системы, добавьте дополнительные атомы натрия и хлорида в коробку моделирования, чтобы довести концентрацию соли в системе до 0,15 молара, затем создать и сохранить топологию и координировать файлы системы, чтобы служить в качестве входных данных для последующего моделирования производства. Используя Amber, изначально энергия сводит к минимуму систему моделирования, чтобы обойти любые неблагоприятные конфигурации. В файле минимизации ввода отрегулируйте максимальную переменную цикла для общего цикла минимизации и количество циклов, чтобы указать количество циклов для крутого алгоритма спуска.Используйте переменную веса удерживающего устройства, чтобы применить удерживаемую силу на растворимые атомы, указанные параметром маски удерживающих устройств. Провести минимизацию в несколько шагов, постепенно снижая сдержанность применяется на растворимых атомов от 25 до 0 килокалорий на моль ангстрем квадрат, а затем использовать команду для запуска минимизации. Нагрейте систему в течение 100 пикосекунд от 0 до 300 Кельвин и использовать команды, чтобы установить 10 килокалорий молар на квадратный ангстрем сдержанность на растворимых атомов.Затем используйте команду для выполнения отопления. Equilibrate системы в течение 900 пикосекунд под изотермальной изобарик ансамбль и установить девять ангстрем расстояние отсечения для дальнего электростатического взаимодействия, постепенно снизить растворимый атом сдержанность до 0,1 килокалории на моль ангстрем площади и завершить equilibration с безудержной пять наносекунд моделирования. Вы запустите уравнив с командой, как указано.Отрегулируйте текст, чтобы производственное моделирование проводилось в течение 100 наносекунд, при этом конформации сохраняются каждые 10 пикосекунд, а затем запустите моделирование с командой, как указано. Чтобы визуализировать образец конформации во время моделирования киназы дикого типа и мутанта EGFR, откройте файлы топологии янтаря и соответствующие файлы траектории в Visual Molecular Dynamics. А используя удобные вторичные представления структуры, проанализируйте общую структурную динамику белков с записанной траектории.Затем просмотрите конкретные взаимодействия между атомами и остатками интереса, такие как каталитически необходимый лизин 745-глутамат 762 соляной мост. Кроме того, сохраните несколько конформаций, отобранных во время моделирования в формате Protein Data Bank, и откройте конформации в Kymera. Используйте вариант свахи, чтобы наложить структуры на начальную или медианную структуру и отобразить медианную структуру в твердом, а остальные выровненные структуры в выцветших белых, чтобы позволить визуализацию записанных структурных движений с большей ясностью.Проанализировать глобальную стабильность ЕГФР дикого типа и мутантов и изучить гибкость различных структурных единиц, импортировать типологию янтаря и соответствующие файлы траектории. В корневом среднем квадратном файле ввода отклонения укажите атомы позвоночника исходной структуры в качестве ссылки на корневую квадратную установку. В корневом среднем файле ввода квадратных колебаний укажите атомы C-альфа исходной структуры в качестве ссылки на корневую квадратную установку.Затем запустите анализ с помощью программы CPPTRAJ и навести данные вывода. Кроме того, выровнять конформативные ансамбли и окрасить каждый остаток на основе корня атома C-альфа означает квадратное отклонение, открыть конформации в Kymera и выровнять их с вариантом свахи. Выберите инструменты, изображение и визуализацию по атрибуту.Выберите остатки конформации ансамблей и установите корень C-альфа среднее квадратное отклонение в качестве атрибутов, а затем нажмите OK. Цепной след конформаций будет окрашен в синий, белый или красный цвета, отражающие области высокой, средней и низкой структурной стабильности соответственно. Для анализа взаимодействий водородных связей между АТФ и ЭГФР дикого типа и удаления подготовьтесь к сценарию CPPTRAJ для выполнения этой задачи. Укажите анализ для интермолекулярных водородных связей только с переменной ноинтрамол и определите водородную связь с расстоянием донора-приемора менее 3,5 ангстремов и углом связи больше или равен 135 градусам.Для оценки внутримолекулярных взаимодействий, например, между каталитически важными остатками лизина и глутамата, укажите лизин в качестве донора водорода и глутамата в качестве остатков рецептора и запустите сценарий, как указано, чтобы позволить анализ результата. Чтобы вычислить связывающие свободные энергии между АТФ и как диким типом, так и удалением EGFR, подготовьте рецептор лиганда фазы газа и лигандовый рецепторный комплекс белковых файлов Банка данных в программе LEAP и установите АТФ в качестве лиганда и EGFR в качестве рецептора. Установите обобщенное родился радио значение M Бонд I2. Затем генерируйте топологию янтаря и координируйте файлы для файлов банка данных о газовой фазе Protein Data Bank.Аналогичным образом, для расчета связывания свободных энергий между активатором и приемником киназы дикого типа и аланина 702 валиновых EGFRs, укажите приемник киназы как лиганд и активатор киназы в качестве рецептора и сохранить соответствующую топологию и координировать файлы. Подготовь молекулярную механику обобщенного файла ввода поверхностной поверхности и установите значение IGB до двух, а соляной - до 0,1. Затем с помощью mmpbsa.скрипт, доступный в Amber, введите команду, как указано для выполнения связывающих энергетических вычислений и анализа выходных данных. Во время этого репрезентативного 100 наносекундного моделирования, аланин 702 валин мутант показал повышенную конформационную стабильность juxtamembrane B сегмента, вероятно, из-за ужесточения гидрофобных взаимодействий по сравнению с диким типом EGFR. Аланин 702 валин мутант также выставлены более низкой свободной энергии связывания между активатором и приемником киназы по отношению к дикого типа EGFR, представляющих более благоприятные димер взаимодействия, которые поддерживают активную конформацию EGFR киназы.Моделирование мутации удаления привело к снижению колебаний атома С-альфа функционально ключевой альфа-C-спирали по сравнению с ЭГФР дикого типа, продлевая время активного состояния EGFR. Удаление мутации также привело к частому образованию водородных связей между боковой цепью полярных атомов лизина 745 и глутамата 762, ключевое взаимодействие для enzymatic деятельности EGFR по сравнению с диким типом EGFR. Кроме того, количество водородных связей между АТФ и EGFR было больше для удаления мутанта, чем для дикого типа EGFR.Удаление мутации также привело к внутреннее движение EGFR неактивное состояние альфа-C-спирали, структурные изменения, ожидаемые во время перехода к активному государству. В отличие от этого, альфа-C-спираль неактивного EGFR дикого типа сохранила свою первоначальную конформацию. Для оценки воздействия мутаций крайне важно выбрать соответствующие конформационные состояния структур и правильно подготовить и уравночные эти структуры.Важно сочетать молекулярно-динамическое моделирование с экспериментальными исследованиями, поскольку синергия между этими методами приносит пользу интерпретации результатов и может сообщить дополнительные влажные лабораторные эксперименты.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...