Name: deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Denna forskning finansieras genom bidrag till M.S.J från Finlands Akademi (308317, 320005), Sigrid Juselius Stiftelse och Tor, Joe och Pentti Borg minnesfond, samt till K.E. från Finlands Akademi (274728, 316796), Stiftelsen Cancer i Finland, och Åbo Universitetscentralsjukhus. M.Z.T. finansieras av Åbo Akademis doktorandnätverk för informations- och strukturbiologi. Vi tackar CSC IT Center for Science för datorresurserna och Dr. Jukka Lehtonen för IT-stödet inom biocenter Finlands bioinformatiknätverk; och Biocenter Finland strukturbiologi infrastruktur nätverk.

OBS: De detaljerade steg som vidtagits för att undersöka effekterna av ΔELREA och A702V-mutationen på EGFR-strukturen med hjälp av MD-simuleringar diskuteras på följande sätt:
1. Strukturberedning
OBS: För att studera de strukturella effekterna av ΔELREA-mutationen bereds vildtyps- och mutantformer av APO-aktiva, ATP-bundna aktiva och apo inaktiva EGFR-monomerstrukturer enligt följande.
<ol><li>Öppna visualiseringsprogrammet Chimera23 (<a href="https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/" target="_blank">https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a>) för att förbereda den aktiva EGFR-kinasstrukturen av vildtyp. I Arkiv-menyn klicka på alternativet Hämta efter ID och välj ProteinDatabankens (PDB24) databas och ange PDB-kod 2GS225 (2.8 Å resolution). PDB är ett förråd för 3D-strukturer som löses av olika experimentella tekniker, inklusive röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonansspektroskopi, kryo-elektronmikroskopi och neutrondiffraktion.</li>
	<li>Bygg de saknade strukturella elementen i 2GS2 genom att ta dessa segment från EGFR:s PDB-strukturer 1M1426 (2,6 Å) och 3W2S27 (1,9 Å). För att göra det, öppna 1M14 och 3W2S och överlagra dem på 2GS2 med hjälp av alternativet MatchMaker i jämförelsemenyn Verktyg → Struktur.<ol>
<li>Beskär ut de segment som ska läggas till från 1M14 och 3W2S. Välj slutatomer av restmaterialet före mellanrummen i 2GS2 och de atomer som skall läggas till från 1M14 och 3W2S (för detaljerad information om de tillagda segmenten, se tabell 1). På kommandoraden typ bond sel och hit enter. Den här strukturen är mallstrukturen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd mallstrukturen från steg 1.2 för att konstruera ΔELREA-borttagningsmutantformen av EGFR-kinasdomänen. Producera FAST-formatsekvensen av ΔELREA EGFR genom att spara sekvensen för mallstrukturen (Favorite → Sequence → File → save as) och sedan ta bort ELREA-sekvensen vid restnummer 746-750.<ol>
<li>Öppna ΔELREA EGFR-sekvensen i Chimera och anpassa den till sekvensen för 2GS2-mallstrukturen med hjälp av Sequence-menyn. I justeringsfönstret välj alternativet Struktur → Modeller (homology)28.</li>
		<li>På popup-fönstret ange 2GS2 sammansatta strukturen som mall och mutanten sekvensen som frågan som ska modelleras. Tryck sedan på OK. Välj en mutantmodell bland de resulterande modellerna, baserat på zDOPE-poängen (vanligtvis den lägsta poängen) och visuell inspektion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För att förbereda DEN ATP-bundna EGFR-kinasstrukturen av wild-typ, använd PDB-strukturen2ITX 29 (2,98 Å) som huvudstruktur. Bygga segment som saknas (se tabell 1) med hjälp av strukturerna 2GS625 (2.6 Å) och 3W2S som följer på förfarandet i steg 1.2. Konvertera liganden ANP i den resulterande strukturen till ATP genom att öppna PDB-filen i en textredigerare och ändra N3B kväveatom av ANP till en syreatom.</li>
	<li>Öppna strukturen i steg 1.4 i Chimera enligt vad som anges i steg 1.1. Lägg till en magnesiumjon till denna struktur från PDB-strukturen 2ITN29 (2,47 Å) för att uppnå en liknande positionering för Mg2+-jonen.</li>
	<li>Med den struktur som är resultatet av steg 1.5, modellera ΔELREA-mutantformen efter steg 1.3.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Apo aktiva EGFR</td>
			<td>Apo inaktiv EGFR</td>
			<td>ATP-bunden aktiv EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Huvudstruktur</td>
			<td>2GS2</td>
			<td>2GS7</td>
			<td>2ITX</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Strukturer som används för att bygga saknade slingor</td>
			<td>1M14 (723-725)</td>
			<td>3W2S (958-984)</td>
			<td>2GS6 (862-865)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3W2S (967-981)</td>
			<td>4HJO (848-850)</td>
			<td>3W2S (990-1001)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Strukturer som används för att bygga sammansatta modeller av APO aktiva, apo inaktiva och ATP-bundna aktiva strukturer. Saknade regioner (aminosyran spänner i parentes) i det rektor strukturerar konstruerades från de listade strukturerar.
<ol start="7"><li>För att förbereda den inaktiva EGFR-kinasstrukturen av vildtyp, öppna PDB-strukturen 2GS725 (2.6 Å) som i steg 1.1 och stryka de bundna liganderna och kristallografiska vattnen. Lägg till segmenten som saknas i 2GS7 (se tabell 1) från strukturerna 3W2S och 4HJO30 (2.75 Å) med hjälp av förfarandet i steg 1.2. Baserat på den slutliga inaktiva EGFR-strukturen, förbered mutantmodellen med hjälp av proceduren i steg 1.3. OBS: För A702V-mutationsstudien studeras EGFR-asymmetriska dimerstrukturen då mutationen är belägen vid den juxtamembrane B-segmentet av kinasdomänen som utgör en stor del av dimer-gränssnittet. De vilda och A702V mutanta EGFR-strukturerna bereds enligt följande:</li>
	<li>Den osymmetriska dimerstrukturen av vildtyp är konstruerad av PDB-strukturen 2GS2, som till en början visas i den monomeriska formen. För att konvertera till den biologiska monteringen som innehåller aktivatorn och mottagarkinaserna i det asymmetriska arrangemanget, öppna 2GS2 i Chimera som i (1.1) och utföra symmetriberäkningar genom att klicka på menyn Verktyg → Högre-Ordningsstruktur → Unit Cell. Markera 2GS2-strukturen och ange Gör kopior. Slutligen väljer du och sparar en enda asymmetrisk dimer från de flera kopior av dimer som resulterar från symmetriåtgärderna.</li>
	<li>Använda den osymmetriska EGFR-strukturen från steg 1.8, bygg A702V-mutanten genom att ersätta alanin 702 med valine med hjälp av alternativet Tools → Structure editing → Rotamers i Chimera. OBS: Sammantaget förbereds sex monomeriska och två dimeriska EGFR-strukturer för ΔELREA- respektive A702V-mutationsstudierna. Varje struktur bearbetas därefter för simulering med hjälp av guiden för beredning av proteiner i Maestro-programmet31 och MD-simuleringar görs med Amber-programmet32.</li>
	<li>Öppna strukturen i Maestro genom att använda alternativet → för importstruktur. Klicka sedan på knappen protein förberedelse guiden och välj följande: tillsätt väteatomer, bygga saknas sida-kedja atomer, bestämma protonation stater joniserbara rester vid pH 7.0 med hjälp av PROPKA, optimera orienteringen av asparagin, glutamin och histidin rester för väte bindning, och slutligen minimera strukturen.</li>
</ol>2. Systeminställning
<ol><li>Öppna språngprogrammet som ingår i amber-programpaketet. Importera ff14SB kraftfältet33 (källa leaprc.protein.ff14SB) och TIP3P vattenmolekyler34 (källa leaprc.water.tip3p). För de ATP-bundna systemen importera även parametrar för ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep). Sedan, ladda strukturen (mol = loadpdb structure.pdb).</li>
	<li>Solvate strukturen i en oktaedral låda med explicit TIP3P vattenmolekyler som sträcker sig 10 Å i alla riktningar från ytatomer av proteinet (solvateoct mol TIP3PBOX 10,0).</li>
	<li>Kontrollera det byggda systemet (Kontrollera mol) och neutralisera det genom att lägga till nödvändiga joner (addions mol Na+ 0). För att tillräckligt modellera biomolekylära system, tillsätt ytterligare Na+/Cl- atomer till simuleringsrutan för att få systemets saltkoncentration till 0,15 M (addions mol Na+ X, addions mol Cl- X), där X ersätts med resultatet av: önskad saltkoncentration * antal vattenmolekyler * volym per vattenmolekyl * Avogadros antal.</li>
	<li>Generera och spara systemets topologi och koordinatfiler, som fungerar som ingångar för den efterföljande produktionssimuleringen (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).</li>
</ol>3. Simulering av molekylär dynamik
<ol><li>Använda Amber, initialt föremål simuleringssystemet till 5000 cykler av brantaste härkomst och konjugat gradient energi minimering att kringgå ogynnsamma konfigurationer. Genomför minimiseringen i flera steg, gradvis sänka fasthållningsanordningen som appliceras på soluteatomer från 25 kcal mol-1 Å-2 till 0 kcal mol-1 Å-2.<ol>
<li>I indatafilen för minimering, min.in, justera maxcyklen variabeln för den totala minimization cykeln (maxcyc = 5000) och ncyc att uppge antalet cykler för den brantaste nedstigning algoritm. Använd den restraint_wt variabeln för att tillämpa fasthållningskraften på soluteatomer som parametern restraintmask specificeras av. Kör sedan minimeringen enligt följande: $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd OBS: Strategin och de faktiska parametrar som används kan variera efter egna önskemål. Detaljer och vägledning finns från Amber manual och hemsida (<a href="https://ambermd.org/index.php" target="_blank">https://ambermd.org/index.php</a>)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Värm upp systemet för 100 ps från 0 K till 300 K inställning en 10 kcal mol-1 Å-2 återhållsamhet på solute atomer. För att göra det, ställ in tempi = 0,0, temp0 = 300,0, dt = 0,002 ps, nstlim = 50000 och restraint_wt = 10 i heat.in-indatafilen. Utför uppvärmningen med följande kommando: $AMBERHOME/bin/sander -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
</li>
	<li>Jämvikt systemet för 900 ps under en NPT ensemble; konstant antal atomer, temperatur (temp0 = 300,0) och tryck (ntp = 1), styra den med Berendsen-metoden (ntt = 1). Ställ in en 9 Å avstånd cutoff (cut = 9,0) för långväga elektrostatiska interaktioner. Sänk gradvis soluteatomens fasthållningsanordning till 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Kör indatafilen för jämvikt equil.in beskriver ovanstående parametrar på följande sätt: $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
</li>
	<li>Färdigställa jämvikten med en ohämmad 5 ns-simulering (set dt = 0.002 ps, ntslim = 2500000). $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
</li>
	<li>Kontrollera att systemet har ekvilit genom att undersöka temperatur, tryck, densitet och energivärden. $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out xmgrace sammanfattning. TEMP/DENSITET/ETOT/EPTOT/EKTOT
</li>
	<li>Utför produktionssimuleringen för 100 ns (set dt = 0.002 ps, ntslim = 50000000 i prod.in) och spara konformationer var 10 ps (ntwx = 5000). $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst
</li>
</ol>4. Analys
<ol><li>Okulärbesiktning<ol>
<li>Visualisera konformationerna som samplas under simuleringarna av vilda och muterade EGFR-kinaser genom att öppna X.prmtop-filerna med bärnstensfärgad topologi och motsvarande prod.mdcrd-banfiler i VMD36. Med hjälp av bekväma sekundära strukturrepresentationer, analysera den övergripande strukturella dynamiken hos proteinerna från den registrerade banan. Visa specifika interaktioner mellan atomer/rester av intresse, såsom den katalytiskt väsentliga K745 - E762 saltbryggan.</li>
		<li>Alternativt, spara flera konformationer samplas under simuleringen i PDB-format och öppna dem med hjälp av Chimera programmet. Överlagra strukturerna på den inledande eller medianstrukturen med hjälp av alternativet MatchMaker. Visa den initiala/medianstrukturen i fast sken och resten av de justerade strukturerna i blekt vitt. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för en att visualisera de inspelade strukturella rörelser med mer klarhet. OBS: Förslag till effektiva representationer och bearbetning av konformationella ensembler från MDS finns i Melvin et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>RMSD- och RMSF-analys<ol>
<li>Compute rot-medelkvadratavvikelse (RMSD) och rot-genomsnittlig kvadrat fluctuation (RMSF) beräkningar med Cpptraj program38 att analysera den globala stabiliteten av proteinerna och undersöka flexibiliteten i de olika strukturella enheter. I rmsd.in- rmsf.in-indatafiler anger du stamnätsatomerna (för RMSD) och Cα-atomer (för RMSF) för den inledande strukturen som referens för RMS-montering. rmsf.in I filerna rmsd/rmsf.in importera de bärnstensfärgade topologifilerna (parm X.promtop) och motsvarande banfiler (trajin prod.mdcrd). Kör sedan kommandot Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Rita utdata för analys.</li>
		<li>Alternativt kan du anpassa konformationella ensembler och färga varje rester baserat på Cα atom RMSD. För att göra det, öppna konformationerna i Chimera och anpassa dem med Matchmaker alternativ.<ol>
<li>Gå till Verktyg → Avbildning → Rendera efter attribut. Välj Rester av den konformationella ensemblen och Cα RMSD som attribut och klicka på OK. Kedjespåret av konformationerna kommer då att färgas från blå → vita →, respektive reflekterande regioner av hög, medelhög och låg strukturell stabilitet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analys av vätebindning<ol>
<li>Analysera vätebindningsinteraktionen mellan ATP och vildtyp/ΔELREA EGFRs. Förbered ett Cpptraj-skript, hbond.in, för att utföra denna uppgift. Definiera ett vätebindning med ett givare-acceptoravstånd på mindre än eller lika med 3,5 Å och en obligationsvinkel av större än eller lika med 135°. Ange analys endast för intermolekylära vätebindningar med variabeln nointramol d.v.s. vätebindningar mellan ATP och EGFR (hbond All nointramol dist 3.5 out nhb.agr avgout avghb.dat). Kör skriptet som Cpptraj -i hbond.in.</li>
		<li>Använd det här skriptet för att bedöma intramolekylära interaktioner, till exempel mellan restprodukterna K745 och E762, som är viktiga rester för EGFR-kinasaktivitet. För att göra det, specificera K745 som vätebindningsgivare och E762 som vätebindningsreceptoren i hbond.in och kör skriptet därefter.</li>
	</ol></li>
	<li>Övervakningsavstånd mellan atomer<ol>
<li>Mät avståndet mellan K745 och E762 genom att öppna banorna för vildtyp och ΔELREA apo EGFRs i VMD. Välj Cδ av Glu762 och Nz av Lys745 genom att klicka på Mus → etikett → obligation. Övervaka avståndet under simuleringen genom att rita en graf med → etiketter → bindnings→ graf.</li>
	</ol></li>
	<li>Gratis energiberäkningar<ol>
<li>För att beräkna de uppskattade bindande fria energierna mellan ATP och wild-type/ΔELREA EGFRs, och mellan aktivator och mottagarkinaser av VILD-typ/A702V EGFRs, använd den molekylära mekanik generaliserad Born surface area (MM-GBSA) modul39 som finns i AMBER-paketet. Ställ in ATP som ligand och EGFR som receptor i ΔELREA-studien. I A702V-studien anger du mottagarkinasen som liganden och aktivatornskinas som receptor.</li>
		<li>Först förbereda liganden, receptorn och ligand-receptor komplexa PDB filer separat i språng programmet inställning av PBRadii värdet till mbondi2. För PDB-filerna sparar du gasfasen bärnstenstopologi (.prmtop) och koordinatfiler (.inpcrd).</li>
		<li>Sedan, i mmgbsa-indatafilen, mmgbsa.in, ställ in igb = 2, saltcon = 0,1. Utför bindningsenergiberäkningar med hjälp av simuleringarnas banor, de förberedda receptorn/ligand-bärnstensfilerna och parametrarna i mmgbsa.in med MMPBSA.py-skriptet som finns i Amber enligt följande: $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
</li>
		<li>Analysera utdata, output.csv, genom att rita grafer.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+ErbB+signalling+network.">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGFR+family:+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases.">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li><li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer:+Clinical+implications.">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li><li>. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.cbioportal.org">https://www.cbioportal.org</a> (2020)</li><li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations.">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li><li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+(EGF/ErbB)+Family+of+Receptors.">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li><li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB/HER+protein-tyrosine+kinases:+Structures+and+small+molecule+inhibitors.">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li><li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation.">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma.">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li><li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer.">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li><li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers.">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li><li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+ERBB4:+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer.">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li><li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function.">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li><li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms.">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li><li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+and+protein+function.">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li><li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase.">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor.">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li><li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor.">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li><li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based+EGFR+T790M/L858R+Mutant+Inhibitors.">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li><li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints.">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li><li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes:+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity.">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li><li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain.">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li><li>. Release 2018-3: Maestro Available from: <a target="_blank" href="https://www.schrodinger.com/maestro">https://www.schrodinger.com/maestro</a> (2018)</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2018. , (2018).</li><li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water.">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li><li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field.">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li><li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VMD:+Visual+molecular+dynamics.">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li><li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+ensembles+in+structural+biology.">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMPBSA.py:+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations.">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li><li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS.">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors.">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li><li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4/ErbB4+Kinase.">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Det protokoll som beskrivs i denna studie fokuserar på att använda molekylär dynamik simuleringar för att undersöka lokala och globala strukturella förändringar som uppstår från aktivera somatiska mutationer av EGFR kinas domän. Även om röntgenkristallstrukturer av vildtyp och mutanta EGFR ger ovärderlig strukturell insikt, skildrar de en eller några statiska framställningar. Inneboende till den biologiska funktionen av ErbBs är dock de nödvändiga övergångarna mellan den enzymatisk inaktiva och aktiva tyrosin kinas, åberopa dynamiska förändringar i både struktur och intramolekylära interaktioner mellan kinas monomerer. MD-simuleringar utfördes således för att undersöka den dynamiska karaktären hos EGFR tyrosinkinasdomänen, inklusive vildtypsstrukturen, den introducerade ΔELREA-deletionsmutationen och A702V-mutationen. Dessa simuleringar var framgångsrika i att klargöra den troliga rollen av dessa mutationer i strukturerna och hur deras effekter på konformation av tyrosin kinas domän skulle leda till experimentellt observerade ökningar i EGFR kinas verksamhet.
Ett avgörande steg i detta protokoll är användningen av en relevant struktur för att bedöma effekten av mutationen. Ett sätt att välja en relevant simuleringsingångsstruktur är att visualisera placeringen av mutationen i den statiska 3D-strukturen och undersöka dess möjliga påverkan med avseende på de angränsande aminosyrorna och strukturenheterna. I denna studie, till exempel, eftersom A702V EGFR mutationen ligger vid juxtamembrane B segmentet som bildar den asymmetriska dimer gränssnitt, användningen av dimer struktur för simuleringen i motsats till monomer är kritisk. Användningen av en monomerisk struktur skulle ha utsatt juxtamembrane B-segmentet av mottagaren kinase till lösningsmedlet, beröva den från den stabiliserande interaktioner, förstärkt av mutationen till en större hydrofoba rester och interaktioner med isoleucin 941 från C-lob resterna av aktivator kinas. Det är dessutom anmärkningsvärt att den 3D-struktur som koordinaterna representerar i en fil för preliminära budgetöverföringar inte nödvändigtvis motsvarar den biologiskt relevanta struktur som bör användas för studier. Till exempel, med strukturen av ErbB4, PDB-kod 3BCE, motsvarar PDB-koordinaterna en trimer, men detta beror på kristallkontakter (få kontakter mellan monomererna ses vid visualisering av denna struktur). Matriser inom PDB-filen kan användas (t.ex. inom Chimera) för att rekonstruera de kristallografiskt relaterade strukturerna, som kan visualiseras för att identifiera kedjor som motsvarar den biologiskt relevanta 3D-strukturen enligt vad som redovisas i den ursprungligapublikationen 42. Ett annat viktigt steg i protokollet är att korrekt förbereda simuleringen inmatningsstrukturen, såsom att bygga saknade aminosyror i olika sling regioner, och särskilt där ligger i närheten av mutationen. Även om ett flertal EGFR-strukturer av vildtyp finns i det preliminära budgettalet, finns endast ett begränsat antal muterade EGFR-strukturer tillgängliga. Följaktligen måste de muterade strukturerna också modelleras; för en enda restmutation som A702V användes Chimera för att mutera resthalten; medan, för ΔELREA-deletionsmutationen, Modeller användes.
De olika parametrar som utnyttjas i simuleringens indatafiler - till exempel antalet minimeringscykler, uppvärmning av systemet till önskad temperatur på en gång eller istället värmer långsamt genom flera mellanliggande temperaturer, tidsperioden för jämvikten och för produktionssimuleringarna - kan modifieras utifrån studiemolekylen, syftet med arbetet och ens egna preferenser. Samtidigt som man utför MD-simuleringar, är det också vanligt att komma över fel som kan uppstå från indatafilerna, frågor som rör simuleringsprogramvaran i bruk eller till och med ett användarfel. Därav, Det är mycket viktigt att förstå källan till felen genom att noggrant undersöka eventuella felmeddelanden. De flesta simuleringsprogram har en e-postlista där användarna kan ställa frågor till programutvecklarna och till andra användare genom vilka de flesta problem kan lösas. Dessutom ger användarhandböcker betydande hjälp för att förstå detaljerna i simuleringsprotokollet, inklusive antaganden och begränsningar. Även om MD-simulering är ett viktigt verktyg för att utforska molekylers dynamiska egenskaper, kom ihåg att beräkningsresultaten måste utvärderas noggrant tillsammans med andra informationskällor för att bedöma deras giltighet. När så är möjligt, arbeta tillsammans med forskare som är experter på de proteiner som studeras, särskilt där relevanta våt-lab experimentella studier görs, som tjänar till att ge resultat för strukturell tolkning samt att föreslå experiment som kan göras baserat på strukturella observationer för att testa hypoteser.
I denna studie var protokollet effektivt när det gäller att undersöka de dynamiska strukturella effekterna av mutationerna ΔELREA och A702V på EGFR-kinasstrukturerna. Simuleringarna visade att ΔELREA håller fast den funktionellt väsentliga αC-helixen och främjar en konformationsförskjutning från den inaktiva kinasen till en stabiliserad aktiv kinas. Simuleringsresultaten stöds oberoende av läkemedelsresponsdata som visade effekterna av tyrosinkinashämmare på lungcancercelllinjer med ΔELREA-deletionsmutationen och EGFR av vildtyp, där större hämning av läkemedel som erkänner den aktiva kinasreformationen rapporterades för ΔELREA än för EGFR12 av vildtyp. Med A702V-mutationen indikerar MD-simuleringarna, i jämförelse med vildtyp, ökad stabilisering av activator-mottagare kinase-gränssnittet samt högre affinitet av aktivatorn och mottagarenskinn för varandra, tillsammans stödjande underhåll av den aktiverade konformationen av EGFR-kinasen. A702V mutationen, som ligger på den juxtamembrane B-segmentet av mottagaren kinase, skulle öka hydrofoba interaktioner med aktivator kinas, fungerar för att förlänga varaktigheten av det aktiverade tillståndet. A702V-mutationen stöder cellernas överlevnad i avsaknad av tillväxtfaktor och identifierades i en in vitro-screening för EGFR-mutationer9.

Den mänskliga epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) familj (ErbB) av receptortyrosinkinaser (RTKs) omfattar fyra medlemmar - EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 och ErbB4/HER4. ErbB-receptorerna reglerar fundamentala cellulära processer som celltillväxt och -proliferation, differentiering, migrationoch överlevnad 1,2, och är därmed potenta proto-onkogener. Avvikande aktivitet av ErbB-receptorer, särskilt EGFR och ErbB2, har ofta förknippats med mänskliga cancerformer gör ErbB-receptorer viktiga mål för cancer therapeutics2,3.
Flera somatiska förändringar av ERBB-gener har rapporterats från mänskliga maligniteter3,4,5. De bäst karakteriserade exemplen inkluderar de återkommande, aktiverande punktmutationerna och korta in-frame-deletioner i EGFR-kinasdomänen i icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Dessa EGFR mutationer utgör viktiga drivkrafter för cancertillväxt, och förutsäga känslighet för EGFR inriktning cancerläkemedel6,7,8. I de flesta cancerformer förekommer dock somatiska mutationer i EGFR utanför dessa återkommande "hotspots" och fördelas över hela 1210-resterspannet i receptorn. Faktum är att de flesta av restprodukter längs EGFR primära sekvensen har visat sig vara muterade i mänskliga cancer9. Bortsett från de få hotspots, den funktionella betydelsen av den stora majoriteten av cancer-associerade EGFR mutationer förblir okänd.
Den monomeriska strukturen av ErbBs består av en stor amino terminal extracellulära domän, följt av en enda transmembrane helix leder till den intracellulära tyrosin Kinas domän och C-terminal svans region som innehåller dockningsplatser för intracellulära signalering proteiner. Ligandbindningen utlöser en dramatisk konformationsförändring i den extracellulära domänen, vilket underlättar bildningen av receptorsusponerare genom att exponera dimeriseringsarmarna som symmetriskt korsar varandra och interagerar med sina aromatiska/hydrofoba ytor. Vid receptor dimerbildning tyrosinkinasdomänerna kommer i kontakt asymmetriskt (Figur 1), vilket resulterar i aktivering av kinaserna som fosforylera C-terminala svansar av receptormonomerna, och därefter vid aktivering av nedströms signalering10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg"> Bild 1: EGFR-dimerns struktur. EGFR dimerizes när de extracellulära domänerna binda tillväxtfaktor (EGF, epidermal tillväxtfaktor). Mottagarkinasdomänen aktiveras sedan genom asymmetrisk interaktion med aktivatorkinasdomänen, och C-terminalsvansarna autofosforyleras vid tyrosinrester (Modifierad från Tamirat et al.12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
På grund av de dynamiska strukturella rearrangements som uppstår under <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg"> monomeren dimer övergångar, tillsammans med kinas aktivering som är associerad med bildandet av en asymmetrisk dimer, kan mutationer längs den fulla längden av receptorstrukturen potentiellt ha en effekt på receptorfunktionen. Här beskriver vi flera exempel från våra tidigare studier där modellering av mutationen och visualisering var tillräckliga för att förklara konsekvenserna för funktion.
Exempel 1: En rapporterad mutation, D595V i ErbB413, ledde till ökad ErbB4 dimerisering och fosforylering14. Visualisering av platsen för mutationen var en kritisk faktor för att förstå de observerade funktionella effekter: D595V inträffade vid symmetrisk crossover av dimeric armarna i ektodomän (Figur 2A). Armarna är till stor del aromatiska och hydrofoba, och byte av polära asparaginsyra genom valine skulle förväntas öka den "klibbiga" hydrofoba interaktioner, stabilisera dimer och därmed öka den tid då fosforylering sker14. Det var en överraskning i början att hitta aspartat i varje arm, men i efterhand kan man tänka sig det som en timing mekanism för aktivitet, där polarsyran sidokedjor minska affinitet och livslängd intakt dimer och därmed begränsa kinas-medierad fosforylering och signalering. Byte av valine skulle då ta bort denna skyddsåtgärd genom att ytterligare stabilisera ErbB4 dimer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg"> Figur 2: Placering av en ErbB4 aktiverande mutation och mutationer som producerar kinasdöda ErbB4. (A) D595 (aktivera D595V mutation) är belägen på aromatiska / hydrofoba dimeric armarna i ErbB4 ektodomän modell; vapenmedarbetaren på tillväxtfaktorbindning, (närliggande rester visas som pinnar). (B) I ErbB4, G802 (inaktivera G802dup mutation) hjälper till att bilda bindningsfickan runt adenin ringen av ATP och katalytisk D861 (inaktivera D861Y mutationen) binder både Mg2 + (visas inte) och γ-fosfat grupp ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Exempel 2: Man kan förutse att somatiska mutationer som riktar sig mot ATP-bindande platsen för kinasdomänen skulle förändra eller eliminera enzymatisk aktivitet som leder till en nedsatt eller kinasdöd receptor oförmögen att signalera. Av nio rapporterade mutationer från patienter med bröst, mag, kolorektal eller NSCLC15, två av de nio mutationer när testade hade mycket minskat fosforylering verksamhet16: G802dup (G → GG) och D861Y. Båda inaktivera somatiska mutationer hittades inom ATP bindande platsen för tyrosin Kinas domän struktur (Figur 2B): flexibel glycin, dupliceras, skulle förändra adenin ringen webbplats och små asparaginsyra ersättas med den skrymmande tyrosin nära terminalen fosfater skulle fysiskt hindra Mg2 +-ATP från bindande. Men sedan ErbB4 kan bilda en heterodimer med ErbB2 - ErbB2 binder inte en tillväxt dela upp i faktorer och beror på anslutning med en ErbB som gör för att heterodimerize - Erbbenen(aktivet),-ErbB4(kinase-dead) heterodimer skulle stimulera cellproliferation via Erk/Akting-signalvägen ännu celler skulle inte differentiera på grund av Kinas-döda ErbB4 och brist på STAT5 utbildningsavsnittaktivering 16.
I nyare studier blev det uppenbart att de dynamiska rörelserna hos ErbBs var relevanta för att förstå effekterna av vissa mutanter på ErbB-funktion, särskilt mutationer som förekommer inom domänen tyrosinkinas. Domänen för tyrosinkinas består av en N-lob (huvudsakligen β-ark) och C-lobe (till stor del alfa spiralformad), som är åtskilda av det katalytiska platsen där ATP binder. N-loben omfattar αC-helixen och P-slingan, medan aktiveringen (A-loop) och katalytiska slingor förekommer i C-loben17,18,19. Crystal strukturer av tyrosin kinas domänen visade två inaktiva konformationer, majoriteten av strukturer har Src-liknande inaktiva tillstånd. I den aktiva konformationen pekar A-slingans katalytiska aspartat mot ATP-bindningsstället och αC-helixen är orienterad mot ATP-bindningsfickan ("αC-in"-konformation), som bildar en stark glutamat-lysinjon-par-interaktion.
Eftersom ErbBs och komponenten kinas domän är mycket dynamiska enheter, och särskilt för fall där effekterna av mutationer på funktion och biologisk aktivitet sannolikt kommer att vara tätt kopplade till konformational tillstånd av ErbBs, är det viktigt att bedöma mutationer med avseende på det intervall av dynamiska förändringar de skulle uppleva. Röntgenkristallstrukturer av ErbBs ger statiska ögonblicksbilder av 3D-strukturen, som kan eller inte kan vara relevanta för att förstå de dynamiska konsekvenserna av en mutation. För att sondera omfånget av dynamiska förändringar som motsvarar "energilandskapet" som finns tillgängligt för en tredimensionell (3D) struktur används simuleringar av molekyldynamik (MD) i stor utsträckning20. När det gäller mutationer som skulle leda till lokala konformationella förändringar inom tyrosin kinas domän eller stabilisering av ett komplex, simuleringar på storleksordningen 100 ns kan vara tillräcklig. Dock kräver större skala konformationella förändringar (t.ex. övergångar mellan de aktiva och inaktiva konformationer av kinas domänen) en längre simuleringstid - på storleksordningen mikrosekonderna21.
Med avseende på det protokoll som beskrivs nedan vi överväga två aktiverande mutationer inom tyrosin kinas domän (Bild 3). Båda mutationer är belägna inom kinas domänen på platser som upplever lokala konformationella förändringar som dikterar om kinas är aktiv eller inte, och därmed MD simuleringar tillämpades i båda instanserna. I det första fallet anser vi förändringar som direkt påverkar ATP bindningsstället och katalytiska maskiner i EGFR mottagare Kinas domän, särskilt undersöka konsekvenserna av en exon 19 radering mutation som är allmänt inblandad i NSCLC4,7. Δ746ELREA750-mutationen, som minskar längden på β3-αC-slingan som föregår αC-helixen - helixen som rör sig mot bindnings/aktiv-platsen på kinasaktivering och deltar i att bilda den kritiska elektrostatiska interaktionen mellan E762 av helix och K745 genom att placera lysin för interaktion med ATP - predisponerar domänen föraktivering 12. I det andra fallet anser vi A702V mutation av EGFR, visat sig vara en ny gain-of-function aktiverande mutation avslöjas av iScream plattform9 och identifieras i en NSCLC patient22. Alanin-702 på mottagarkinasdomänen ligger på juxtamembrane segment B vid gränssnittet för mottagaren och aktivorkinasdomänerna, i vilka detta asymmetriska kinas dimerkomplex och kinaskonformationella förändringar krävs föraktivering 9.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg"> Bild 3: Den asymmetriska kinasdomänen dimer av EGFR. A702V mutationen skulle vara belägen vid det kritiska gränssnittet för aktivor och mottagare Kinas domäner, intill αC helix och nära isoleucin 941 av aktivator kinas. Konformationsförändringar framkallade genom bildande av den asymmetriska dimern leda till kinasaktivering. β3-αC-slingan som innehåller ELREA-sekvensen direkt föregår αC-helixen; under aktiveringen rör sig αC-helixen inåt mot ATP-bindningsstället. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber software</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 2018</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera program</td>
			<td>Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco</td>
			<td>Version 1.13.1</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR struture files</td>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td></td>
			<td>3D coordinates of EGFR structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Schr&#246;dinger LLC</td>
			<td>Version 2018-3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeller program</td>
			<td>The Andrej &#352;ali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Included in the Chimera program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD software</td>
			<td>Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign</td>
			<td>Version 1.9.3</td>
			<td>Executable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the structural effects of activating egfr somatic mutations with molecular dynamics simulation

Ett flertal somatiska mutationer som förekommer i den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) familj (ErbB) av receptortyrosin kinaser (RTK) har rapporterats från cancerpatienter, även om relativt få har testats och visat sig orsaka funktionella förändringar i ErbBs. ErbB-receptorerna dimeriseras och aktiveras vid ligandbindning, och dynamiska konformationella förändringar av receptorerna är inneboende för induktion av nedströmssignalering. För två mutationer som visas experimentellt för att ändra EGFR-funktion, A702V och Δ746ELREA750 deletionsmutation, illustrerar vi i följande protokoll hur simuleringar av molekylär dynamik (MD) kan sondera (1) konformationsstabiliteten hos den muterade tyrosinkinasstrukturen i jämförelse med EGFR av vild typ; 2) strukturella konsekvenser och konformationsövergångar och deras förhållande till observerade funktionella förändringar, (3) effekter av mutationer på styrkan av bindande ATP samt för bindning mellan kinasdomänerna i den aktiverade asymmetriska dimer; och (4) effekterna av mutationerna på viktiga interaktioner inom EGFR-bindningsstället som är associerat med det aktiverade enzymet. Protokollet ger en detaljerad steg-för-steg-procedur samt vägledning som kan vara mer allmänt användbar för undersökning av proteinstrukturer med hjälp av MD-simuleringar som ett sätt att sondera strukturell dynamik och förhållandet till biologisk funktion.

Det beskrivna protokollet användes för att studera de strukturella effekterna av mutationerna ΔELREA och A702V på EGFR-kinasstrukturen. En tillämpning av protokollet var att undersöka effekten av mutationerna på lokala strukturella/conformational stabilitet genom att beräkna RMSD och RMSF värden från MD simuleringar. Eftersom A702V mutationen är belägen vid den juxtamemembrane B segmentet, rmsd av detta segment av mottagaren kinase i förhållande till startstrukturen beräknades för både vild-typ och A702V EGFRs. Resultatet (Figur 4A) visade att juxtramembrane B-segmentet av mutanten har ökat konformationsstabiliteten under 100 ns-simuleringen (genomsnittlig RMSD 0,7 Å - 95% konfidensintervall (CI) 0,009) jämfört med den wild-type EGFR-kinasdomänen (genomsnittlig RMSD 1.1 Å - 95% CI 0.01). Detta är mycket sannolikt resultatet av de snävare hydrofoba interaktioner vid dimer gränssnittet på grund av ersättning av alanin 702 (metylgruppen sidokedjan) till en skrymmande hydrofoba rester, valin (isopropyl grupp sidokedjan), vilket leder till ökad hydrofoba interaktioner av V702 på mottagaren kinas domän med isoleucin 941 av aktivator kinas domänen.
ΔELREA-mutationen är belägen vid β3-αC-slingan, intill den funktionellt kritiska αC-helixen; konformationen av αC-helixen är nyckeln till förskjutningar mellan egfr-kinas aktiva och inaktiva tillstånd. αC-helix konformationsstabiliteten i aktivt tillstånd bedömdes genom att undersöka RMSFEN över Cα-atomerna av rester inom helixen under MD-simuleringar (Figur 4B): övergripande, det finns lägre fluktuationer i mutanten (genomsnittlig RMSF 1.1 Å - 95% CI 0.4) i jämförelse med vildtypen (genomsnittlig RMSF 1.5 Å - 95% CI 0.57); med den högsta skillnaden i fluktuationer som registrerats för N-terminalens rester. De samplade konformationerna respektive superposerade på medianstrukturen för domänen med vildtypkinas och hos ΔELREA-kinasdomänen stöder också dessa resultat (Figur 4C): både vild- och ΔELREA-kinasdomänerna har övergripande liknande stabilitet för de superposerade konformationerna utom för β3-αC-slingan och αC-helixen, som är klart stabilare i ΔELREA EGFR. Dessa resultat visar att strykning av ELREA sekvensen hindrar förflyttning av den aktiva staten αC helix, därav hindra och därmed stabilisera den aktiva konformation. Vidare, eftersom αC-helixen utgör en del av det asymmetriska dimer-gränssnittet, skulle begränsningarna på αC-helixen i mutanten med stor tro stabilisera den asymmetriska dimer, vilket förlänger varaktigheten av det aktiverade tillståndet.
En annan tillämpning av protokollet är att undersöka beteendet hos viktiga intra- och intermolekylära interaktioner som äger rum under simuleringen. Således kan samspelet mellan K745 och E762, som är grundläggande för EGFR-enzymatisk aktivitet, analyserades för både den aktiva formen vildtyp och ΔELREA EGFR-kinas genom att mäta den procentuella beläggningen av vätebindningar som bildades mellan de två resternas polaratomer i sidokätting under MD-simuleringarna (Figur 5A): denna elektrostatiska interaktion bildades oftare i ΔELREA-kinasdomänen i jämförelse med domänen med vildtypskinas, på grund av den mer stabila αC-hecken som rymmer E762. Samspelet mellan Mg2+-ATP och domänerna för vildtyp och ΔELREA EGFR-kinas (Figur 5B) under simuleringen bedömdes också (Figur 5C): antalet vätebindningar var större för 5ΔELREA (genomsnittsvärde 4,0 - 95 % KI 0,03) än för EGFR av vildtyp (genomsnittsvärde 3,2 - 95 % KI 0,04). Ytterligare analys av vätebindningarna visade att K745 interagerar oftare med fosfatgrupperna av ATP i ELΔREA EGFR, som är kopplad till den stabilare K745-E762-interaktionen som noterats vid simuleringen av ΔELREA-mutanta EGFR-kinasdomänen.
MD simuleringar som beskrivs i protokollet är också användbara för att bedöma den relativa fria energin av bindning för protein-protein och protein-ligand interaktioner. Bindningsenergierna mellan aktivator- och mottagarkinasdomänerna av vildtyps- och A702V-EGFRs, och mellan ATP och domänerna för vilda och ΔELREA-mutanta EGFR-kinaser, var beräknat från molekylära mekaniker generaliserade Födda ytbehandlar område (MMGBSA) beräkningar (Figurera 6A): A702V-mutanten producerade en lägre genomsnittlig ΔGröra värderar (genomsnitt ΔGröra = -76 kcal/mol - 95% CI 0,47), som representerar mer gynnsamma dimer interaktioner, i motsats till den wild-type EGFR domän (genomsnitt ΔGbinda = -61 kcal/mol - 95% CI 0,61). Denna observation är förenlig med det mer stabila juxtamembrane B-segmentet och snävare dimer-gränssnitt på grund av ökade hydrofoba interaktioner som observerats för A702V EGFR-kinasdomänen. När det gäller ATP-bindning till domänerna för vildtyp och ΔELREA EGFR-kinaser (figur 6B) förutsäger MMGBSA-beräkningar starkare ATP-bindning med ΔELREA-mutanten (genomsnittlig ΔG-bindning -57 kcal/mol - 95% CI 0,43) i jämförelse med EGFR av vildtyp (genomsnittlig ΔG-bindning -48 kcal/mol - 95% CI 0,33).bind bind Detta utfall ligger i linje med det större antal vätebindningar som registrerats mellan ATP och ΔELREA EGFR (figur 5C) i jämförelse med domänen av vildtyp.
Protokollet kan också användas för att undersöka konformationsförändringar som observerats under en simulering. I den aktuella studien studerades effekterna av ΔELREA-mutationen på den inaktiva EGFR-konformationen genom visuell inspektion och superpositionering av de samplade konformationerna från simuleringen. Analysen avslöjade en inåtgående rörelse av αC-helixen i ΔELREA EGFR-kinasdomänen (Figur 7A), en strukturförändring som förväntas under övergången till det aktiva tillståndet. Däremot behöll αC-spiralen av inaktiva EGFR av vildtyp sin ursprungliga konformation (Figur 7B). Således MD simuleringar stödja förslaget att borttagning mutationen, visas experimentellt att öka Kinas verksamhet40,41, främjar en konformationell förskjutning från inaktiva kinas mot det aktiva staten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg"> Figur 4: Vildtyps- och mutant konformationsstabilitet för den aktiva EGFR-kinasdomänen under MD-simuleringar. (A) RMSD (ryggradsatomer) över den juxtamembrane B segmentet av wild-type (blå) och A702V (röd) mottagare kinas domän. (B) RMSF (Cα atomer) över rester av αC-helixen: vildtyp (blå) och ELΔREA (guld). (C) Superposed samplad konformationer av vildtyp (vänster) och ΔELREA (höger) EGFR-kinasdomän; kedjespår som är färgade baserat på RMSD (Cα atomer) av varje rest med avseende på medianstrukturen. Färgning varierar från blått till vitt till rött, som representerar regioner med hög till låg konformationsstabilitet. Observera att de "fria" N-terminalregionerna i den isolerade kinasdomänen, färgad röd, inte skulle uppvisa denna nivå av rörlighet i den intakta EGFR-strukturen. Siffror anpassade från Chakroborty et al.9 (Figur 4A återges med tillstånd av Journal of Biological Chemistry) och Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg"> Figur 5: Nyckelfunktioner som ses i den aktiva mottagarkinasen under MD-simuleringar: saltbryggan K745-E762, αC-helixen och interaktioner med ATP. (A) Procentuell beläggning av växelverkan K745-E762 under simuleringen av domänerna för vildtyp (blå) och ΔELREA (guld) EGFR-kinas. (B) Rester av vild-typ och ΔELREA mutant interagerar med ATP (pinnar). Mg2+ (grön) koordinater med ATP och D855. (C) Antalet vätebindningar som bildas av ATP med både domänerna för ΔELREA EGFR-kinas under MD-simuleringar. Figur från Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg"> Bild 6: Lägre relativa fria energier av bindning observeras för de muterade kinasdomänerna under simuleringarna. (A) Bindningsenergier beräknade för interaktionen mellan aktivator- och mottagarkinasdomänerna av vildtypsdomänerna (blå) och A702V (röd) EGFRs. (B) ΔG-bindning av ATP till wild-type (blå) och ΔELREA (guld) EGFR-kinasdomäner.bind Siffror anpassade från Chakroborty et al.9 (Figur 6A återges med tillstånd av Journal of Biological Chemistry) och Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg"> Figur 7: Superposerade konformationer från domänen med vildtyp och ΔELREA inaktiv EGFR-kinas. Konformation av αC-helix- och A-loopspiralen av (A) vild-typ (medianstruktur i blått) och (B) ΔELREA EGFRs (guld). Andra samplade konformationer, blekt vitt; initiala strukturer före MD-simuleringarna, rosa. Figur från Tamirat et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation at JoVE.com

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Målet med detta protokoll är att använda molekylärdynamiksimuleringar för att undersöka de dynamiska strukturella förändringar som sker på grund av aktiverande mutationer av EGFR-kinasproteinet.

Dechiffrera de strukturella effekterna av att aktivera EGFR somatiska mutationer med molekylär dynamik Simulering

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

Molekylär dynamisk simulering är en beräkningsteknik som kan användas för att utforska molekylära rörelser och kan avslöja konformationella förändringar avgörande för att förstå biokemisk och cellulär funktion. Sondering av det område av dynamiska rörelser som är tillgängliga för en makromolekyl är svårt. Med hjälp av resultaten från molekylära dynamiska simuleringar i samband med experimentella data möjliggör bedömning av deras funktionella betydelse.Vi kommer att demonstrera med hjälp av molekylära dynamiska simuleringar hur mutationer som observerats hos cancerpatienter påverkar EGFR-inriktningsbekräftelser och ligandbindning. För att förbereda den vilda-typ apo aktiva EGFR vår kinas struktur, öppna Kymera visualisering programmet, och under arkivmenyn, klicka på hämta av ID.Välj Protein Data Bank databas och ange Protein Data Bank 2GS2 kod. För att bygga de saknade strukturella 2GS2 element, förvärva dessa segment från andra EGFR strukturer.För att konstruera de fem rester glutamat 746 till alanin 750 ELREA borttagning i EGFR, klicka favorit, sekvens och visa sekvens för att öppna den vilda-typ 2GS2 sekvens. Och i den resulterande sekvens fönster, klicka på redigera och lägga till sekvens för att välja radering mutantEN FASTA formatsekvens. I justeringsfönstret väljer du struktur och modell eller homologi.I popup-fönstret anger du 2GS2 sammansatta strukturen som mall och mutanten sekvensen som frågan som ska modelleras, välj sedan en mutant modell från de resulterande modellerna baserat på zDOPE poäng och visuell inspektion. För att förbereda den vilda-typ apo inaktiva EGFR-kinas struktur, öppna Protein Data Bank struktur 2GS7 och lägga till de saknade segmenten från de andra EGFR strukturer, modellering av radering mutant form som visat. För att förbereda ATP-bundna vilda-typ aktiva EGFR-kinas struktur, använd Protein Data Bank struktur 2ITX som princip struktur, bygga de saknade segmenten med hjälp av andra EGFR strukturer och modellering av radering mutant form med hjälp av modelleraren som visat.För att konstruera den icke-asymmetriska dimerstrukturen av vildtyp öppnar du 2GS2 i Kymera och klickar på verktyg, högre ordningsstruktur och enhetscell för att omvandla strukturen till den biologiska sammansättningen som innehåller aktivatorn och mottagarkinaserna i det asymmetriska arrangemanget. Välj 2GS2 struktur och ange göra kopior, välj sedan och spara en enda asymmetrisk dimer från flera kopior av dimer resultatet av symmetri operationer. För att bygga alanin 702 valine mutant, välj verktyg, struktur redigering, och rotamers att ersätta alanin 702 med valine.Öppna strukturerna i Maestro och klicka på knappen protein förberedelse guiden, välj sedan lägga väteatomer och fyll i saknade sidokedje atomer och klicka på pre-process. För att bestämma protonationsstaterna för joniserbara rester vid pH 7.0, klicka på förfina och använd PROPKA för att optimera orienteringen av asparagin, glutamin och histaminrester för vätebindning, minimera sedan strukturen. För att ställa in simuleringssystemet, öppna LEAP-programmet och importera Kraftfältet Amber FF14SB och TIP3P vattenmolekyler.För de ATP-bundna systemen importerar du parametrar för ATP och läser in strukturen. Solvate strukturen i en oktaedral låda med explicit TIP3P vattenmolekyler som sträcker sig 10 ångströms i alla riktningar från ytan atomer av proteinet. Kontrollera bältessystemet och lägg till nödvändiga joner för att neutralisera det.För att tillräckligt modellera biomolekylära system, tillsätt ytterligare natrium- och kloridatomer i simuleringsrutan för att få systemets saltkoncentration till 0,15 molar, generera och spara systemets topologi och koordinatfiler för att fungera som insatsvaror för den efterföljande produktionssimuleringen. Använda Amber, initialt energi minimera simuleringssystemet för att kringgå eventuella ogynnsamma konfigurationer. I indatafilen för minimering justerar du den maximala cykelvariabeln för den totala minimiseringscykeln och antalet cykler för att ange antalet cykler för den brantaste nedstigningsalgoritmen.Använd fasthållningsviktsvariabeln för att tillämpa fasthållningskraften på de soluteatomer som anges med parametern fasthållningsmask. Genomför minimering i flera steg, gradvis sänka fasthållningsanordningen tillämpas på de solute atomer från 25 till 0 kilokalorier per mole ångströmstorget, sedan använda kommandot för att köra minimering. Värm systemet för 100 picoseconds från 0 till 300 Kelvin och använda kommandona för att ställa in en 10 kilocalorie molar per kvadrat ångström återhållsamhet på solute atomer.Använd sedan kommandot för att utföra uppvärmningen. Jämvikt systemet för 900 picoseconds under en isotermal isobaric ensemble och ställa in en nio ångström avstånd cutoff för långväga elektrostatiska interaktioner, gradvis sänka solute atom återhållsamhet till 0,1 kilocalorie per mullvad angstrom torget och slutföra jämvikten med en ohämmad fem nanosekund simulering. Kör utjämning med kommandot som indikerat.Justera texten så att produktionssimuleringen kan utföras för 100 nanosekunder med de konformationer som sparas var 10:e picosekunder, kör sedan simuleringen med kommandot enligt angivelse. För att visualisera konformationsprovet under simuleringarna av wild-type och mutanta EGFR-kinas, öppna Amber-topologifilerna och motsvarande banfiler i Visual Molecular Dynamics. Och med hjälp av bekväma sekundära strukturrepresentationer, analysera den övergripande strukturella dynamiken hos proteinerna från den registrerade banan.Visa sedan specifika interaktioner mellan atomer och rester av intresse, såsom den katalytiskt essentiella lysin 745-glutamat 762 saltbron. Alternativt, spara flera konformationer som samplas under simuleringen i Protein Data Bank-format och öppna konformationerna i Kymera. Använd matchmaker alternativet för att överlagra strukturerna på den inledande eller medianstrukturen och visa medianstrukturen i fast ämne och resten av de anpassade strukturerna i blekt vitt för att tillåta visualisering av de inspelade strukturella rörelserna med mer klarhet.För att analysera den globala stabiliteten hos de vilda och muterade EGFRs och för att undersöka flexibiliteten hos de olika strukturella enheterna, importera Amber-typologin och motsvarande banfiler. I roten betyder kvadratiska avvikelse indatafilen, ange de ryggraden atomer av den inledande strukturen som referens för roten medelvärdet kvadrat montering. I roten betyder kvadrat fluktuations indatafilen, ange C-alfa atomer av den inledande strukturen som referens för roten medel kvadrat montering.Kör sedan analysen med CPPTRAJ-programmet och rita utdata. Alternativt, för att anpassa de konformationella ensembler och att färg varje rester baserat på C-alfa atom roten betyder kvadratiska avvikelse, öppna konformationerna i Kymera och anpassa dem med matchmaker alternativet. Välj verktyg, skildring och återge efter attribut.Välj rester av de konformationella ensemblerna och ställ in C-alfarotens medelkvadratavvikelse som attributen, klicka sedan på OK. Kedjan spår av konformationerna kommer att vara färgad blå, vit, eller röd återspeglar regionerna av hög, medel, och låg strukturell stabilitet respektive. För att analysera vätebindningsinteraktionerna mellan ATP och både vildtyps- och deletions-EGFRs, bered en CPPTRAJ-skript för att utföra denna uppgift. Ange analysen för de intermolekylära vätebindningarna endast med variabeln nointramol och definiera en vätebindning med ett givarens acceptoravstånd på mindre än eller lika med 3,5 ångström och en bindningsvinkel av större än eller lika med 135 grader.För att bedöma de intramolekylära interaktionerna, till exempel mellan de katalytiskt viktiga lysin- och glutamatresterna, specificerar du lysin som vätedonator och glutamat som acceptorrester och kör skriptet som angivit för att möjliggöra analys av resultatet. För att beräkna bindningsfria energierna mellan ATP och både vild-typ och raderings-EGFRs, förbereda gasfasen ligandreceptorn och ligandreceptorn komplexa Protein Data Bank filer i LEAP programmet och ställa ATP som ligand och EGFR som receptor. Ställ in det generaliserade födda radiovärdet till M Bond I2. Generera sedan Amber-topologin och koordinatfilerna för gasfasen Protein Data Bank-filer.På samma sätt, för att beräkna bindande fria energier mellan aktivator och mottagare kinaser av wild-type och alanin 702 valine EGFRs, ange mottagaren kinas som ligand och aktivator kinas som receptor och spara motsvarande topologi och koordinat filer. Förbered en molekylär mekanik generaliserad född ytan indatafilen och ställ in IGB värdet till två och saltcon till 0,1. Sedan använder mmpbsa.py script tillgängligt i Amber, ange kommandot som indikeras för att exekvera de bindande energiberäkningarna och analysera utdata. Under denna representativa 100 nanosekon simulering visade alanin 702 valine mutant ökad conformational stabilitet i den juxtamembrane B segmentet sannolikt på grund av att stramare hydrofoba interaktioner jämfört med den vilda-typ EGFR. Den alanin 702 valine mutant uppvisade också en lägre fri energi av bindande mellan aktivator och mottagare kinaser i förhållande till vild-typ EGFR, som representerar mer gynnsamma dimer interaktioner som upprätthåller den aktiva EGFR kinas konformation.Simulering av borttagning mutationen resulterade i lägre C-alfa atom fluktuationer av funktionellt nyckel alfa C-helix jämfört med den vilda-typ EGFR, förlänga tiden för EGFR aktiva tillstånd. Borttagningsmutationen resulterade också i frekvent bildning av vätebindningar mellan de sidokedjepolära atomerna av lysin 745 och glutamat 762, en nyckelinteraktion för EGFR-enzymatisk aktivitet jämfört med lysintyps EGFR. Dessutom var antalet vätebindningar mellan ATP och EGFR större för deletionsmutanten än för EGFR av vildtyp.Borttagning mutationen resulterade också i en inåt rörelse av EGFR inaktiva staten alfa C-helix, en strukturell förändring förväntas under övergången till det aktiva tillståndet. Däremot behöll alfa C-helix av vildtyp inaktiva EGFR sin ursprungliga konformation. För att bedöma effekterna av mutationerna är det viktigt att välja lämpliga konformationella tillstånd av strukturerna och att korrekt förbereda och jämvikt dessa strukturer.Det är viktigt att kombinera molekylära dynamiska simuleringar med experimentella studier då synergin mellan dessa tekniker gynnar tolkningen av resultaten och kan informera ytterligare våtlabbexperiment.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion av rekombinanta PRMT-proteiner med baculovirusuttrycksvektorsystemet

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering av dynamiken i tvärbundna och enskilda mikrotubuli in vitro med TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...