Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

يقدر المؤلفان كثيراً الدكتورة لينغلي وانغ لمساعدتها في البروتوكول الحيواني، وقسم طب الأطفال في جامعة ستانفورد لدعم البنية التحتية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NHLBI K99 HL135258 (إلى M.G.).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل الفريق الإداري المعني برعاية الحيوانات المختبرية (APLAC31608) في جامعة ستانفورد.
1- إعداد المخازن المؤقتة
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت الهضم باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 1.<ol>
<li>إعداد حل الأسهم DNase الأول: حل DNase I في المياه خالية من RNase لحل الأوراق المالية من 2000 وحدة / مل (1 ملغ / مل). Aliquot وتخزين حل الأسهم في -20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد حل liberase: حل liberase مع المياه الخالية من RNase لحل الأوراق المالية من 5 ملغ / مل. قم بتدويره على بنك دوار عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد عازلة الفرز عن طريق تخفيف 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) و 10٪ الزل في مصل البقري albumin (BSA) محلول الأوراق المالية مع 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) لتركيز النهائي من 2 mM من EDTA و 0.5٪ من BSA.</li>
</ol>2. جمع القلب
ملاحظة: تم استخدام ستة فئران سبراغ داولي تزن 50-100 غرام في هذا البروتوكول. ولم يلاحظ أي اختلاف بين الجنسين.
<ol><li>القتل الرحيم للفأر مع CO2 ووضعه في موقف supine على منصة تشريح. دبوس الأطراف أسفل وتعقيم كل من البطن والصدر مع الإيثانول 70٪.</li>
	<li>فتح البطن مع مقص وإدراج إبرة 21 G في الجزء الخلفي من الوريد الوريد الخلفي الموجود وراء الأمعاء. سحب المكبس حقنة مرة أخرى، وسحب الدم من الوريد حتى الكبد يبدو أخف وزنا في اللون ولا يمكن سحب المزيد من الدم، مما يشير إلى إزالة الدم بما فيه الكفاية.</li>
	<li>باستخدام مقص، وفتح الصدر بعناية لتجنب إتلاف الرئة والقلب. ارفع قوس الشريان الأورطا/الأذين مع الملقط واقطع الشريان الأورطا والشريان الرئوي والأوردة الرئوية والوريد الفينا لتحرير القلب وإزالته.</li>
	<li>اغسل القلب بـ 50 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hanks (HBSS) العازل 3x لإزالة الدم المفرط.</li>
	<li>تحت المجهر المجهري، قم بإزالة الجدار الحر البطيني الأيمن إلى أنبوب 5 مل يحتوي على متوسط النسر المعدل في دولبككو (DMEM)(الشكل 1A،B).<ol>
<li>وضع القلب على تملقه، والوجه الخلفي لتحديد الجانب الأيسر والأيمن.</li>
		<li>حدد موقع الشريان الرئوي، وهو أكثر الشرايين والأوردة والشرايين المتفرعة من أعلى القلب وتقطع الشريان الرئوي وصولاً إلى غرفة البطين الأيمن. على الوجه الرعنى للقلب، قطع على طول الحاجز حتى تصل إلى القمة. مواصلة القطع من قمة أعلى الجانب الخلفي من القلب على طول الحاجز حتى الشريان الرئوي ونقطة تقاطع غرفة البطين الأيمن(الشكل 1A).</li>
		<li>بدءا من الشريان الرئوي ونقطة تقاطع البطين الأيمن، وقطع كل من الجانب الأمامي والخلفي من القلب عمودي إلى تشريح السابقة وبعيدا عن الحاجز، حتى يتم تحرير الجدار الحر البطين يمنى من بقية القلب(الشكل 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحت المجهر المجهري، قم بإزالة الجدار الحر البطيني الأيسر إلى أنبوب 5 مل يحتوي على DMEM(الشكل 1C،D).<ol>
<li>حدد موقع الشريان الأورطا، المتفرع من أعلى القلب خلف الشريان الرئوي، وكرر الطريقة الموضحة في الخطوة 2.5 لقطع الجدار الحر البطيني الأيسر.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. الجماعة الاقتصادية الأوروبية الهضم
<ol><li>وضع كل من اليمين واليسار أنسجة الجدار الحر البطيني في طبق ثقافة 60 سم مع السطح الداخلي الكذب شقة، التي تواجه إلى أسفل(الشكل 2). ملاحظة: السطح الداخلي هو الوجه الداخلي للبطين على شكل مقعر قليلا كما هو مبين في الشكل 2A،C.</li>
	<li>أضف 0.5-1 مل من عازل الهضم إلى الطبق ، ووضع طرف الماصة مباشرة تحت الأنسجة. استمر حتى يتم غمر السطح الداخلي فقط.</li>
	<li>احتضان الطبق في 5٪ CO2،37 درجة مئوية حاضنة لمدة 5 دقيقة.</li>
	<li>إضافة EC المتوسطة إلى طبق الثقافة لوقف الهضم. ملاحظة: الحفاظ على كمية الهضم المخزن المؤقت إلى متوسط EC كنسبة 1:5.</li>
	<li>استخدام ماصة 1 مل لتدفق السطح الداخلي للالبطينين مع المتوسطة EC ونقل الجريان السطحي إلى أنبوب جمع 50 مل من خلال مصفاة 40 ملم(الشكل 2E). احتفظ بالمجموعات على الجليد لتنقية المصب.</li>
</ol>4. CEC الهضم
<ol><li>قطع على طول السطح الخارجي للبطين الأيسر دون تلوث من الطبقة الداخلية(الشكل 2B،D)ووضع كل في أنبوب منفصل 5 مل تحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت الهضم. ملاحظة: يمكن تحديد البطين الأيسر على أنه البطين السميك، ويمكن تحديد السطح الخارجي كوجه خارجي للبطين المقعر قليلاً.</li>
	<li>باستخدام مقص تشريح، مفروم الجدار البطيني إلى قطع صغيرة، 1 مم3.</li>
	<li>احتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.</li>
	<li>Pipette 4 مل من EC المتوسطة في أنبوب 5 مل لإنهاء الهضم.</li>
	<li>نقل الحل مع ماصة سيرولوجي 5 مل في أنبوب 50 مل من خلال مصفاة 40 ملم(الشكل 2E). احتفظ بالمجموعات على الجليد لتنقية المصب.</li>
</ol>5. جمع الخلية
<ol><li>طرد الأنابيب في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم يستنشق supernatant.</li>
	<li>إذا ظهرت بيليه الأحمر، إعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من 1x خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة التبل(الشكل 2F). ملاحظة: إذا لم يكن هناك RBCs، انتقل إلى الخطوة 6.</li>
	<li>احتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.</li>
	<li>Pipette 10 مل من برنامج تلفزيوني في أنابيب 50 مل لوقف الانزل.</li>
	<li>طرد مركزي الأنابيب في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في RT، ومن ثم يستنشق supernatant.</li>
</ol>6- فرز الجماعة الأوروبية
<ol><li>أضف 90 ميكرولتر من عازل الفرز و10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة لـ CD31 PE إلى أنابيب 50 مل.</li>
	<li>دوامة الأنابيب ومن ثم احتضانها لمدة 10 دقيقة في ثلاجة 4 درجات مئوية.</li>
	<li>أضف 10 مل من عازل الفرز إلى الأنابيب، واخلط جيداً، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 × غرام لمدة 10 دقيقة في RT.</li>
	<li>يُقرّر الفوقناتان وإعادة تعليق الكريات في 80 ميكرولتر من عازل الفرز و20 ميكرولتر من الميكروبات المضادة للـ PE.</li>
	<li>دوامة الأنابيب واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من عازل الفرز إلى الأنابيب، واخلطجيداً، ثم طردها من بعد 300 × غرام لمدة 10 دقيقة في RT.</li>
	<li>يُقرّر الفوقناتان وإعادة تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من عازل الفرز.</li>
	<li>ضع عمودًا يحتوي على المجالات المغناطيسية الفائقة في فاصل مغناطيسي وشطف العمود بـ 3 مل من عازل الفرز.</li>
	<li>بعد العمود هي "توقف التدفق"، ماصة 500 μL من تعليق الخلية في الأعمدة ومن ثم غسل الأعمدة مع عازلة الفرز. كرر غسل 3x، مع كل 3 مل من الفرز المخزن المؤقت(الشكل 2G).</li>
	<li>قم بإزالة الأعمدة من الفاصل ووضعها فوق أنبوب مجموعة جديد بـ 15 مل.</li>
	<li>مع ماصة، إضافة 5 مل من متوسط EC إلى الأعمدة، ودفع الحل من خلال استخدام المكبس العمود.</li>
	<li>طرد مركزي أنابيب جمع في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في RT ومن ثم تستنشق supernatant.</li>
	<li>استخراج الحمض النووي الريبي من بيليه الخلية من عينات الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC باستخدام عدة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن الحصول على ما لا يقل عن 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. ملاحظة: بعد استخراج الحمض النووي الريبي، يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية.</li>
	<li>عكس نسخ 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي للحصول على cDNA باستخدام التمهيدي عشوائي ة ومجموعة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
	<li>تنفيذ PCR الكمية للتحقق من صحة السكان endocardial وendothelial(الشكل 2H). يتم سرد تسلسلات التمهيدي في الجدول 2.<ol>
<li>أضف 5 ميكرولتر من EEC أو CEC cDNA (1 نانوغرام/ميكرولتر) إلى آبار لوحة 384 qPCR. إضافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية أو CC cDNA في ما يكفي من الآبار بحيث يكون هناك ثلاثة آبار لكل عدد من التمهيديات.</li>
		<li>مزيج 6 μL من 2x qPCR SYBR العازلة الخضراء مع 0.5 ميكرولتر من كل التمهيدي 10 ميكرون، بما في ذلك كل التمهيديات إلى الأمام وعكس، وإضافتها إلى بئر واحد المقابلة لكل جين مرشح.</li>
		<li>ختم لوحة مع فيلم من البلاستيك والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 300 × ز في RT.</li>
		<li>ضع اللوحة في جهاز qPCR ثم ابدأ البرنامج في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ق ، ثم 55 درجة مئوية لمدة 60 ق. كرر الخطوتين اللاحقة لمدة 45 دورة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وتختلف مراكز CECs وEECs من حيث المنشأ والعلامات والوظائف، وبالتالي يمكن أن تلعب أدوارًا فريدة في التنمية والمرض. وتقتصر البروتوكولات القائمة لعزل الخلايا الانهوفية على الأنسجة الوعائية الكلية، مما يهمل جمع اللجان الاقتصادية لأوروبا، مما يحد من دراسة الوظائف الخاصة باللجنة الاقتصادية لأوروبا والجماعة الاقتصادية الأوروبية. ومن الضروري عزل ودراسة هاتين المجموعتين بشكل مستقل، لأن هذه المعرفة ستوفر مرجعاً للتمايز بين مراكز الرعاية الصحية المتكاملة في مراكز التقييم والمراكز الاقتصادية لأوروبا لأغراض الدراسات المستقبلية، وتيسر فحص هذه الخلايا للحصول على أهداف علاجية محتملة لمختلف أمراض القلب. يحدد هذا البروتوكول الجديد طريقة لعزل EECs عن السطح الداخلي وCECs عن السطح الخارجي للجدار الحر البطيني للفئران البالغة.
ومن الأهمية بمكان التحكم في توقيت كل خطوة بدقة شديدة في هذا البروتوكول. لأن عدد EECs محدود جدا في أنسجة قلب الفئران، قللنا من وقت الهضم للطبقة الداخلية للقلب لمنع الضرر الخلوي والأهم من ذلك، التلوث CEC. إضافة فورية من الحل المتوسط EC لإنهاء رد الفعل الأنزيمي هو أيضا مهم جدا للحفاظ على صلاحية الخلية عالية. تشير الكريات الحمراء التالية للخلايا إلى وجود عدد كبير من RBCs. اعتماداً على كمية التلوث RBC، يمكن إضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت تحلل RBC لتدهور RBCs. يجب توقيت الحضانة بعناية لتجنب تلف كبير للخلايا، ويتم إضافة PBS على الفور لإنهاء رد الفعل. باستخدام البروتوكول الحالي، تمكنا من عزل 105 EECs من ستة قلوب الفئران. ويمكن أن تكون هذه الخلايا المصنفة على طبق ثقافة الخلية لمزيد من التوسع والتوصيف.
عند إعداد الأنسجة لجمع الجدار مجانا، تم غسل القلب مع HBSS لإزالة غالبية RBCs المتبقية. HBSS هو المتوسطة الموصى بها بسبب مظهره واضح، والتي تمكن من تصور خلايا الدم، على النقيض من DMED التي تحتوي على أحمر الفينول. تكوين المخزن المؤقت الهضم يضمن تحرير كاف من الخلايا الانهوثيلية، حيث إنزيم الهضم liberase يجرد أنسجة الخلايا المكشوفة، DNase الأول يزيل الحمض النووي من الخلايا الميتة لتعزيز انفصال الخلايا التي قد تمنعها نوعية لاصقة الحمض النووي، العازلة HEPES يوازن درجة الحموضة، وDMEM هو متوسط القاعدية المعدلة مع تركيز أعلى من الأحماض الأمينية والفيتامينات لتحسين صيانة الخلايا ويحتوي على الكالسيوم اللازمة لتنشيط
وفقا لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (scRNA-seq) التي تم الحصول عليها من كل من الإنسان15 والماوس القلب10، تم الإبلاغ عن عدة علامات تعزى إلى مجموعات محددة من الجماعة الأوروبية. اخترنا بعض الجينات الأكثر ثراء لفحص نقاء EECs معزولة (أي Npr3، Cdh11، وHapln1)وEECs (أي Mgll، Fabp4، و Cd36). بالنسبة إلى α-Actinو Npr3و Cdh11وعلامات Hapln1 أظهرت زيادة التعبير في EECs مقارنة بـ CECs. وبالمثل، كان التعبير عن علامات Mgllو Fabp4و Cd36 أكبر في مراكز CECs مقارنة بالشركات الاقتصادية والاجتماعية. وتتفق العلامات المعبر عنها بشكل فريد لكل عينة مع علامات مميزة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا على التوالي، مما يشير إلى العزلة الناجحة.
ومع ذلك ، فإن البروتوكول الحالي لا يستبعد التلوث المتبادل بين مجموعتين من الجماعة الأوروبية أثناء العزلة ، حتى مع عمليات الهضم التسلسلية التي يتم التحكم فيها بعناية. لذلك ، يمكن تطبيق بعض علامات سطح الخلية لمزيد من التنقية. على سبيل المثال، NPR3 عموما تسميات الديدوكارديوم10، في حين يمكن تتبع APJ غالبية CECs16. نظرًا لأنه يتم التعبير عن هاتين العلامتين على سطح الخلية ، يمكن استخدامهما لفرز الخلايا المنشطة (FACS) ، والأجسام المضادة المستخدمة لزيادة تنقية مجموعات EC المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للبشري15 والماوس10 القلب scRNA - seq تأكيد إثراء Npr3 في EECs ، ويمكن استخدام Cd36 المحتمل لتنقية CEC.
وفي الختام، يحدد البروتوكول المقدم العزلة المستقلة لللجان الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا والبلدان الاقتصادية لأوروبا عن قلب الجرذان. يمكن استخدام التحديد الشامل للخصائص الخلوية ، الذي تم تمكينه عن طريق عزل الخلايا ، لتطبيقات المصب الهامة.

توفر هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا (معدلًا من Gladka et al.1)للتشريح والعزل اللاحق للخلايا المنفثة المنفدية (EECs) والخلايا الانثيلية التاجية (CECs) من قلوب الفئران. ومن شأن القدرة على التحقيق في هذه الخلايا بشكل مستقل أن تمكن من استكشاف آليات خاصة بنوع الخلية تقوم عليها مجموعة متنوعة من أمراض القلب التي يمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية محتملة. ومع ذلك، لم يتم بعد نشر طريقة ناجحة لجمع مجموعات الخلايا هذه بشكل مستقل.
CECs تختلف عن EECs فيما يتعلق بأصلها، وعلامات، ووظائف أثناء نمو القلب والمرض11،2،,3،,4،,5،,6،,7. EECs تنبع من السطح البطني من mesoderm القلب3. أنها تنشأ من Flk1+ الخلايا السلف ردا على VEGF وHIF الإشارات وتشكيل الطبقة الأعمق من المناطق الثلاثة منفصلة من القلب النامية: الأذين، البطين، والوريد الجيوب الأنفية3،6. يشير تتبع النسب الوراثي إلى أن الخلايا الإندية المتعددة القدرات للورينوس الجيوب الأنفية تستمد خلايا وبوئية، تهاجر لتشكل الطبقة تحت الملحمية3. في وقت لاحق ، تميز الطبقة تحت الملحمة في الشرايين التاجية والأوردة ، بما في ذلك CECs ، والتي لا تزال عبر الجدار الحر البطيني الطرفي3،4. يتم تنظيم هذا المسار المنفدي إلى الإندوثيل من قبل VEGFC ، ELA / APJ ، وSOX17 يشيرإلى 3،4 ،66،8،9., يستمد التغاف البطيني أقل CECs من الحاجز التدخلي بواسطة آلية غير معروفة3. في وقت لاحق، يقترح التمايز المترجمة بين EECs و CECs بواسطة علامات محددة لهذه الخلايا اثنين من السكان، بما في ذلك Mgll، Fabp4، والتعبير Cd36 في CECs، أو Npr3، Cdh11، والتعبير Hapln1 في EECs3،,5،,10.
تلعب EECs و CECs أدوارًا مختلفة في وظيفة القلب. Endocardial إلى التحول mesenchymal، وتشكيل صمام، نضوج الغرفة، وتنظيم تدفق المسالك، وتطوير قناة atrioventricular هي مشروطة EECs6. بدلا من ذلك، CECs المساهمة في لهجة vasomotor والتهاب الشرايين التاجية11. هذه الفروق في وظيفة يؤدي إلى أدوار فردية في تطور المرض4,12. على سبيل المثال، تشير الأدلة إلى أن خلل EECs قد يؤدي إلى مرض الصمام الخلقي6،noncompaction عضلة القلب6،تأثير الحاجز الأذيني6،تليف يفيلي بطانة الرحم13،متلازمة القلب الأيسر hypoplastic13،نقص التنسج البطيني13،وتضخم القلب12. وبالمثل، وجدت الدراسات أن CECs غير طبيعية تسهم في مرض الشريان التاجي14 والتجلط11.
إن العزلة الناجحة للمراكز الاقتصادية لأوروبا والمراكز الاقتصادية لأوروبا ضرورية لتحقيق معرفة شاملة بهذين المجموعتين من الخلايا، والتي يمكن استخدامها في كل من البيئات البحثية والسريرية. ومن شأن تحديد عوامل النمو والتمايز لهذه الخلايا أن يوفر مرجعاً للتمايز بين الأنواع الفرعية الانبوثيلية من الخلايا الجذعية المستحثة المتعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكامل للتباينات في تطوير وتنظيم ووظيفة الشركات الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا ووظيفتها أمر حيوي لفهم العوامل الجينومية والبيجينية المسؤولة عن العديد من أمراض القلب بطريقة خاصة بالخلية. توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة للجمع الناجح للـ EECs و CECs بشكل مستقل، وتقدم أدلة على الفصل من خلال تقييم مستويات التعبير الجيني للعلامات الخاصة بنوع الخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

وقد تبين أن الخلايا الانبهية الدابيدية (EECs) والخلايا الانهوائية التاجية (CECs) تختلف في الأصل والتنمية والعلامات والوظائف. وبالتالي، تلعب هاتان المجموعتان الخلويتان أدوارًا فريدة في أمراض القلب. الدراسات الحالية التي تنطوي على خلايا الانهويلية المعزولة التحقيق في مجموعات الخلايا التي تتكون من كل من EECs وCECs. يوضح هذا البروتوكول أسلوب عزل هذه الخلايا بشكل مستقل للتوصيف الخاص بالخلية. بعد جمع الجدار الحر البطيني الأيسر والأيمن، يتم تحرير الخلايا البطانة من السطح الخارجي والسطح الداخلي بشكل منفصل باستخدام محلول عازلة الهضم. احتفظ الهضم التسلسلي للسطح الخارجي وطبقة endocardial الداخلية بفصل مجموعتين من خلايا بطانة الأرض. ويجري التحقق من العزلة المنفصلة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا من خلال تحديد علامات خاصة بكل مجموعة من السكان. استنادا إلى خلية واحدة نشرت سابقا RNA التنميط في قلب الماوس، وNpr3، Hapln1، والتعبير الجيني Cdh11 هي فريدة من نوعها لEECs؛ في حين Fabp4، Mgll، والتعبير الجيني Cd36 هي فريدة من نوعها لCECs. وكشفت بيانات qPCR عن تعبير مثري عن هذه العلامات المميزة في عيناتكل منها، مما يشير إلى عزل الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC الناجح، فضلا ً عن الحفاظ على النمط الظاهري للخلية، مما يتيح إجراء المزيد من التحليل الوظيفي الخاص بالخلايا.

ويرد وصف لعملية عزل الجماعة الاقتصادية الأوروبية ولجنة القضاء على جميع أشكال العزلة في الشكل 2. وتم تحديد العزلة الناجحة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا من خلال تقييم وجود علامات الخلايا الانهويلية، وكذلك تلك الخلايا المتميزة للفئتين الفرعيتين. كما هو متوقع ، كشف qPCR أنه بالنسبة لα-actin، أعربت EECs عن مستويات أعلى من علامات endocardial Npr3، Hapln1 ، و Cdh11 مقارنة بـ CECs(الشكل 3A). وبالمثل، أعربت CECs مستويات أعلى من علامات الشريان التاجي Fabp4، Mgll، و Cd36 مقارنة EECs(الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، أعرب كل من EECs و CECs عن جين علامة عموم EC Cdh5، مع مستويات أعلى قليلا في CEC(الشكل 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> الشكل 1: رسم بياني لتشريح القلب. (أ)أول قطع المحرز لفصل الجدار الأيمن الحرة البطين من الحاجز. (ب)قطع الثاني المحرز لتحرير البطين الأيمن تماما. (C)أول قطع المحرز لفصل جدار خالية من البطين الأيسر من الحاجز. (D) قطع الثاني المحرز لتحرير البطين الأيسر تماما. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> الشكل 2: رسم بياني لإعداد الهضم لـ CECs و EECs والترتيب التالي لفرز الخلايا. (أ)الجدران البطينية الحرة الأعمق و(B)الجدار الحرة البطينية الخارجية كانت(C)مغمورة في عازلة الهضم أو (D)هضمها في عازلة الهضم على التوالي. (E)جمع وترشيح حلول الخلايا تليها(F)خلايا الدم الحمراء (RBC) حل الخلايا و(G)المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا (MACS) باستخدام الأجسام المضادة CD31. (ح)تمت معالجة اللجان المنقىة للتحقق من التعبير الجيني باستخدام qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> الشكل 3: بيانات qPCR التي تتحقق من عزل لجان CECs وEECs. (أ)تم قياس مستويات التعبير الجيني لعلامات الجماعة الاقتصادية الأوروبية Npr3و Cdh11 وHapln1 في EECs و CECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (ب)تم قياس مستويات التعبير الجيني لعلامات CEC Mgllو Fabp4و Cd36 في EECs و CECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (C)تم قياس علامة عموم EC Cdh5 في EECs وCECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (ن = 3 في كل مجموعة). تمثل القضبان متوسط ± SEM. * p & 0.05 ، ** p < 0.01 مقابل EEC ، اختبار t غير مقترن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">الجدول 1 - ما إذا كانت هناك الهضم المخزن المؤقت (1.5ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>الأسهم كون.</td>
			<td>(كون) النهائي</td>
			<td>حجم</td>
		</tr>
<tr>
<td>ليمحو TM</td>
			<td>5 ملغ/مل</td>
			<td>0.5 ملغ/مل</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحمض النووي الأول</td>
			<td>1 ملغ/مل</td>
			<td>20 ميكروغرام/مل</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 متر</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفة للعازلة الهضم.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">الجدول 2 - ما إذا كانت هناك تسلسل التمهيدي</td>
		</tr>
<tr>
<td>اسم الجينات</td>
			<td>الي الامام</td>
			<td>عكس</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAAATATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGACTACTGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>هابلن1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTCAGCTTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGGGGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAaCGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-أكتين</td>
			<td>TCTGTGTGGGGGGGGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: تسلسل اتّصال البراير

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الأندية والانهوائية التاجية من قلوب الفئران من خلال هضم الأنسجة بالتتابع في عازل للهضم وجمع الخلايا من دورات الطرد المركزي المتكررة وتنقية الخلايا باستخدام الميكروبات CD31 المضادة للفئران.

عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا بطانة القلب والخلايا البطانية التاجية بشكل منفصل عن القلب لمساعدة الناس على فهم التعبير الجيني النوع الخلية محددة وظيفة. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي نقاء عالية وديمية البقاء من الجماعة الاقتصادية الأوروبية المعزولة وCEC وأن الخلايا الحفاظ على خصائصها الفسيولوجية عند العزل. وتختلف مراكز CECs و EECs في العديد من الجوانب، وبالتالي فإن القدرة على التحقيق بشكل مستقل في مجموعات الخلايا هذه تمكن من استكشاف آليات نوع الخلية في مختلف أمراض القلب.يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسة العوامل المستنسخة و اللاجينية المسؤولة عن العديد من أمراض القلب بطريقة محددة نوع الخلية. أصعب أجزاء من هذه الطريقة هي تحديد أجزاء القلب المختلفة وتوقيت الهضم بشكل صحيح لتجنب تلوث نوع الخلية. إثبات الإجراء سيكون (ييفي مياو) عالم أبحاث من مختبريبعد حصاد القلوب من ستة 50 إلى 100 غرام الجرذان Doley Sprague، وغسل الأعضاء مع 50 ملليلتر من HBSS الباردة ثلاث مرات لإزالة أي الدم الزائد ووضع قلب واحد تحت مجهر تشريح. ضع القلب على وجهه الخلفي المتملق لتحديد الجانبين الأيسر والأيني من الأنسجة وتحديد موقع الشريان الرئوي. استخدم المقص لقطع الشريان الرئوي إلى غرفة البطين الأيمن وقطع على طول الحاجز حتى يتم الوصول إلى القمة.استمر في القطع من القمة حتى الجانب الخلفي من القلب على طول الحاجز حتى يتم الوصول إلى تقاطع الشريان الرئوي وغرفة البطين الأيمن. بدءا من هذه النقطة، وقطع كلا من الجانبين الأمامي والخلفي للقلب عموديا على نقطة التشريح السابقة وبعيدا عن الحاجز حتى يتم تحرير الجدار الأيمن خالية البطين من بقية القلب. ثم ضع الجدار الأيمن حر البطين في أنبوب خمسة ملليلتر من DMEM وتحديد موقع الشريان الأبهر مرة أخرى لتسهيل جمع الجدار الحر البطين الأيسر بنفس الطريقة كما أظهرت للتو.عندما تم جمع جميع الجدران الحرة البطينية، نقل عينات الأنسجة إلى طبق ثقافة 60 سنتيمترا مع أسطحها الداخلية ملقاة على وجهه إلى أسفل في الطبق. باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد، إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من عازلة الهضم إلى الطبق مباشرة تحت قطع الأنسجة حتى يتم غمر فقط الأسطح الداخلية للأنسجة. لتجنب تلوث الخلايا غير المرغوب فيه، من المهم أن يكون السطح الداخلي للبطين فقط مغمورًا في عازلة الهضم ويتم هضمه لمدة خمس دقائق بالضبط.بعد خمس دقائق في الحاضنة ثقافة الخلية، ووقف الهضم مع خمسة أضعاف حجم الخلايا البطانية المتوسطة. ثم استخدم ماصة ملليلتر واحدة لطرد السطح الداخلي لكل بطين مع وسط جديد ينقل الجريان السطحي من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 ملليلتر على الجليد. بالنسبة لعملية هضم الخلايا البطانية التاجية، قطع على طول السطح الخارجي للبطين الأيسر دون تلوث من الطبقة الداخلية ووضع كل جزء أنبوبي في أنبوب منفصل خمسة ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازلة الهضم.لتجنب التلوث من EECs، من المهم قطع فقط من السطح الخارجي للبطين. باستخدام مقص التشريح، ينمّر جدار البطين إلى قطع صغيرة من ملليمتر مكعب واحد ووضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة مع دوامة كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق. عندما تكون القطع المفرومة صغيرة ولكنها مرئية ، أضف أربعة ملليلترات من متوسطة الخلية البطانية إلى الأنبوب واستخدم ماصة مصلية من خمسة ملليلتر لنقل الحجم الكامل للحل من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 ملليلتر على الجليد.لعزل مجموعات الخلايا الإيجابية CD31 بعد هضمها، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وpirateate المابير. إذا كانت أي من الكريات حمراء ، فإن إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد إلى ملليلتر من عازل خلايا الدم الحمراء في الأنبوب الواحد لاحتضان لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أوقف التحلل مع 10 ملليلتر من PBS وجمع الخلايا مع الطرد المركزي الثاني.بعد ذلك، أضف 90 ميكرولترات من مخزن الفرز المؤقت و10 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة CD31 PE لكل أنبوب من الخلايا. بعد دوامة، احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة 10 ملليلتر من التخزين المؤقت الفرز إلى الأنابيب مع خلط شامل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.Resuspend الكريات في 80 ميكرولترات من الفرز العازلة لكل أنبوب، تليها إضافة 20 ميكرولترات من الميكروبات المضادة لPE. بعد دوامة، ووضع الأنابيب في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها الغسيل في 10 ملليلتر من التخزين المؤقت الفرز عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح للتو. Resuspend الكريات في 500 ميكرولترات من التخزين المؤقت الفرز على الجليد ووضع عمود يحتوي على المجالات بارامغناطيسية فائقة في فاصل المغناطيسي.شطف العمود مع ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفرز. عندما يتم إفراغ العمود، أضف 500 ميكرولترات من تعليق الخلية البطانية إلى العمود، تليها أربعة يغسل مع ثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، نقل العمود إلى أنبوب جمع 15 ملليلتر جديدة واستخدام المكبس العمود وخمسة ملليلتر من وسط الخلايا البطانية الطازجة لطرد الخلايا الإيجابية CD31 من العمود في أنبوب جمع.ثم جمع الخرزة الخلايا البطانية المعزولة عن طريق الطرد المركزي. كما هو متوقع، يكشف PCR الكمي أن نسبة إلى بيتا أكتين، والخلايا البطانية بطانة القلب أعرب عن مستويات أعلى من علامات بطانة القلب Npr3، Hapln1، وDn11 مقارنة بالخلايا البطانية التاجية. وبالمثل، أعربت الخلايا البطانية التاجية مستويات أعلى من علامات التاجية Fabp4، Mgll، وCD36 مقارنة بالخلايا البطانية.بالإضافة إلى ذلك، عبّر كلا النوعين من الخلايا عن جين سيه 5 للخلايا ذات الانسانية مع مستويات أعلى قليلاً لوحظت في الخلايا البطانية التاجية. يمكننا تنقية الخلايا باستخدام FACS والأجسام المضادة الخاصة بسكان الخلايا. على سبيل المثال، يمكننا استخدام Anti-Npr3 لفرز EECs و Anti-Cd36 لفرز CECs.وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف دور الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC في تنمية القلب والمرض بطريقة محددة لنوع الخلية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

عزل وتوصيف الخلايا الأقمار الصناعية من عضلات الفئران رئيس قسيمي خيشومي

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

صمام عزل وتوصيف للفئران الابتدائي الخلايا الخلالي: نموذج جديد لدراسة تكلس الصمام الابهري

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...