Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Les auteurs apprécient grandement la Dre Lingli Wang pour son aide avec le protocole animal, et le Département de pédiatrie de Stanford pour le soutien à l’infrastructure. Ce travail a été appuyé par NIH/NHLBI K99 HL135258 (à M.G.).

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Groupe d’administration sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC31608) de l’Université Stanford.
1. Préparation des tampons
<ol><li>Préparer le tampon de digestion à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 1.<ol>
<li>Préparer la solution de stock DNase I : Dissoudre DNase I dans de l’eau sans RNase pour une solution de stock de 2 000 unités/mL (1 mg/mL). Aliquot et stocker la solution de stock à -20 oC.</li>
		<li>Préparer la solution liberase : Dissoudre la liberase avec de l’eau sans RNase pour une solution de stock de 5 mg/mL. Faites-le pivoter sur une banque à rouleaux à 4 oC pendant 30 min. Aliquot et entreposez la solution de stock à -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le tampon de tri en diluer 0,5 M d’acide éthylènediaminettraacétique (EDTA) et 10% de sérum bovin albumin (BSA) solution de stock avec 1x phosphate tamponné saline (PBS) pour une concentration finale de 2 mM de EDTA et 0,5% de BSA.</li>
</ol>2. Collection de coeur
REMARQUE : Six rats Sprague Dawley pesant 50 à 100 g ont été utilisés dans ce protocole. Aucune différence entre les sexes n’a été observée.
<ol><li>Euthanasiez le rat avec du CO2 et placez-le en position de supine sur une plate-forme de dissection. Épinglez les extrémités vers le bas et stérilisez l’abdomen et la poitrine avec 70% d’éthanol.</li>
	<li>Ouvrez l’abdomen avec des ciseaux et insérez une aiguille de 21 G dans la partie du cava de vena postérieur situé derrière les intestins. Retirez le piston de seringue en arrière, en retirant le sang de la veine jusqu’à ce que le foie semble plus léger dans la couleur et pas plus de sang peut être retiré, indiquant l’ablation suffisante de sang.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, ouvrez soigneusement la poitrine pour éviter d’endommager le poumon et le cœur. Soulevez l’arc/atrium de l’aorte avec les forceps et coupez l’aorte, l’artère pulmonaire, les veines pulmonaires et le vena cava pour libérer et enlever le cœur.</li>
	<li>Laver le cœur avec 50 ml de froid 1x Hanks solution de sel équilibrée (HBSS) tampon 3x pour enlever le sang excessif.</li>
	<li>Sous un microscope à microdissection, retirer le mur libre ventriculaire droit dans un tube de 5 ml contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco (DMEM) (figure 1A,B).<ol>
<li>Posez le cœur sur son visage postérieur plat pour identifier le côté gauche et droit.</li>
		<li>Localiser l’artère pulmonaire, la plus antérieure des veines et des artères ramification du haut du cœur et couper à travers l’artère pulmonaire jusqu’à la chambre ventriculaire droite. Sur la face antérieure du cœur, couper le long du septum jusqu’à atteindre le sommet. Continuer à couper du sommet jusqu’au côté postérieur du cœur le long du septum jusqu’à ce que l’artère pulmonaire et le point de jonction de chambre ventriculaire droite (figure 1A).</li>
		<li>À partir de l’artère pulmonaire et du point de jonction ventriculaire droite, couper à la fois le côté antérieur et postérieur du cœur perpendiculairement à la dissection précédente et loin du septum, jusqu’à ce que le mur libre ventriculaire droit est libéré du reste du cœur (figure 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sous le microscope à microdissection, retirer le mur ventriculaire gauche dans un tube de 5 ml contenant du DMEM(figure 1C,D).<ol>
<li>Localiser l’aorte, ramification du haut du cœur derrière l’artère pulmonaire, et répéter la méthode décrite dans l’étape 2.5 pour couper le mur gauche ventriculaire libre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Digestion de la CEE
<ol><li>Placez les tissus muraux libres ventriculaires droits et gauches dans un plat de culture de 60 cm avec la surface intérieure couchée à plat, face vers le bas(figure 2). REMARQUE : La surface intérieure est la face intérieure du ventricule légèrement concave en forme comme le montre la figure 2A,C.</li>
	<li>Ajouter 0,5 à 1 ml de tampon de digestion au plat, en plaçant la pointe de la pipette directement sous le tissu. Continuer jusqu’à ce que seule la surface intérieure soit immergée.</li>
	<li>Incuber le plat dans un incubateur deCO 5%, 37 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter le milieu EC au plat de culture pour arrêter la digestion. REMARQUE : Conserver la quantité de tampon de digestion par rapport à EC comme un rapport de 1:5.</li>
	<li>Utilisez une pipette de 1 ml pour rincer la surface intérieure des ventricules avec le milieu EC et transférer le ruissellement dans un tube de collecte de 50 ml à travers une passoire de 40 mm(figure 2E). Gardez les collections sur la glace pour la purification en aval.</li>
</ol>4. Digestion ceC
<ol><li>Couper le long de la surface extérieure du ventricule gauche sans contamination de la couche interne(figure 2B,D) et placer chacun dans un tube séparé de 5 ml contenant 1 ml de tampon de digestion. REMARQUE : Le ventricule gauche peut être identifié comme ventricule plus épais, et la surface extérieure peut être déterminée comme la face extérieure du ventricule légèrement concave.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux de dissection, hachez la paroi ventriculaire en petits morceaux de 1 mm3.</li>
	<li>Incuber le tube dans un bain d’eau de 37 oC pendant environ 15-20 min. Vortex tous les 2-3 minutes.</li>
	<li>Pipette 4 ml de milieu EC dans le tube de 5 ml pour mettre fin à la digestion.</li>
	<li>Transférer la solution avec une pipette sérologique de 5 ml dans un tube de 50 ml à travers une passoire de 40 mm(figure 2E). Gardez les collections sur la glace pour la purification en aval.</li>
</ol>5. Collection cellulaire
<ol><li>Centrifugez les tubes à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT) puis aspirez le surnatant.</li>
	<li>Si la granule apparaît rouge, réutilisez la granule dans 1 à 2 ml de globule rouge 1x (RBC) tampon de lysage(figure 2F). REMARQUE : S’il n’y a pas de CTC, passez à l’étape 6.</li>
	<li>Incuber les tubes dans un bain d’eau de 37 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Pipette 10 mL de PBS dans les tubes de 50 ml pour arrêter la lyse.</li>
	<li>Centrifugez les tubes à 300 x g pendant 10 minutes à RT, puis aspirez le supernatant.</li>
</ol>6. Tri des CE
<ol><li>Ajouter 90 L de tampon de tri et 10 l d’anticorps pe anti-CD31 dans les tubes de 50 ml.</li>
	<li>Vortex les tubes, puis les incuber pendant 10 min dans un réfrigérateur à 4 oC.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de tampon de tri dans les tubes, bien mélanger, puis centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à RT.</li>
	<li>Aspirez le supernatant et réutilisez la granule dans 80 L de tampon de tri et 20 L de microbilles anti-PE.</li>
	<li>Vortex les tubes et incuber à 4 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon de tri dans les tubes, bien mélanger, puis les centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes à RT.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille dans 500 L de tampon de tri.</li>
	<li>Placez une colonne contenant des sphères superparamagnetiques dans un séparateur magnétique et rincez la colonne avec 3 ml de tampon de tri.</li>
	<li>Après que la colonne soit « stop d’écoulement », pipette 500 'L de la suspension de cellule dans les colonnes, puis laver les colonnes avec tampon de tri. Répétez le lavage 3x, chacun avec 3 ml de tampon de tri(figure 2G).</li>
	<li>Retirez les colonnes du séparateur et placez-les au-dessus d’un nouveau tube de collecte de 15 ml.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, ajoutez 5 ml de milieu EC aux colonnes et propulsez la solution à l’aide d’un piston à colonnes.</li>
	<li>Centrifugez les tubes de collecte à 300 x g pendant 10 min à RT, puis aspirez le supernatant.</li>
	<li>Extraire l’ARN de la granule cellulaire des échantillons de la CEE et de la CEC à l’aide d’un kit, conformément aux instructions du fabricant. Un minimum de 500 ng d’ARN peut être obtenu. REMARQUE : Après l’extraction de l’ARN, l’échantillon peut être stocké à -80 oC.</li>
	<li>Inverser transcribe 500 ng d’ARN pour obtenir cDNA à l’aide d’une amorce aléatoire et un kit, en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Effectuer pcR quantitatif pour la validation des populations endocardiales et endothéliales(figure 2H). Les séquences d’apprêt sont répertoriées dans le tableau 2.<ol>
<li>Ajouter 5 L de CEE ou ceC cDNA (1 ng/L) dans les puits d’une plaque de 384 qPCR. Ajouter la CEE ou l’ADC de la CEE dans suffisamment de puits pour qu’il y ait trois puits par nombre d’amorces.</li>
		<li>Mélanger 6 L de tampon vert QPCR SYBR de 2x qPCR avec 0,5 l de chaque amorce de 10 M, y compris les amorces avant et inversées, et ajoutez-les en un seul puits correspondant à chaque gène candidat.</li>
		<li>Scellez la plaque avec du film plastique et de la centrifugeuse pendant 1 min à 300 x g à RT.</li>
		<li>Placer la plaque dans une machine qPCR, puis démarrer le programme à 95 oC pendant 3 minutes, suivie de 95 oC pour 15 s, puis de 55 oC pour 60 s. Répétez les deux étapes suivantes pour 45 cycles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les CEC et les CEE diffèrent en origine, en marqueurs et en fonctions, et pourraient donc jouer un rôle unique dans le développement et la maladie. Les protocoles existants pour l’isolement des cellules endothéliales sont limités aux tissus macrovasculaires, négligeant la collection des CEE, limitant ainsi l’étude des fonctions spécifiques à la CEC et à la CEE. Il est essentiel d’isoler et d’étudier ces deux populations de façon indépendante, car ces connaissances fourniraient une référence à la différenciation des CCPS en CEC et en CEE pour des études futures et faciliteraient l’examen de ces populations cellulaires pour des cibles thérapeutiques potentielles pour diverses maladies cardiaques. Ce nouveau protocole décrit une méthode pour l’isolement des CEE de la surface intérieure et des CEC de la surface extérieure de la paroi libre ventriculaire des rats adultes.
Il est essentiel de contrôler le moment de chaque étape très précisément dans ce protocole. Parce que le nombre de CEE est très limité dans le tissu cardiaque de rat, nous avons minimisé le temps de digestion de la couche interne du coeur pour empêcher des dommages cellulaires et plus important encore, la contamination de CEC. L’ajout immédiat de la solution moyenne des CE pour mettre fin à la réaction enzymatique est également très important pour maintenir la viabilité des cellules élevées. Une pellete rouge suivant la collecte de cellules suggère la présence d’un grand nombre de CVR. Selon la quantité de contamination par RBC, on peut ajouter un coussin de lyse RBC de 1 à 2 ml pour dégrader les CBR. Grâce au protocole actuel, nous avons pu isoler 105 EECs de six cœurs de rats. Ces cellules pourraient être ensemencées sur un plat de culture cellulaire pour une expansion et une caractérisation.
Lors de la préparation du tissu pour la collecte libre de mur, le coeur a été lavé avec HBSS pour enlever la majorité des RBCs restants. HBSS est le milieu recommandé en raison de son aspect clair, qui permet la visualisation des globules sanguins, contrairement à DMED contenant du rouge phénol. La composition du tampon de digestion assure une libération suffisante des cellules endothéliales, là où l’enzyme de digestion de la liberase bande le tissu des cellules exposées, DNase I élimine l’ADN des cellules mortes pour favoriser le détachement cellulaire qui peut être inhibé par la qualité adhésive de l’ADN, HEPES tampon équilibre le pH, et DMEM est un milieu basal modifié avec une concentration plus élevée d’acides aminés et de vitamines pour un meilleur entretien cellulaire et contient le calcium nécessaire pour activer la libération.
Selon le séquençage d’ARN à cellule unique (scRNA-seq) obtenu à la fois del’homme 15 et du cœur de souris10, plusieurs marqueurs attribués à des populations spécifiques d’EC ont été rapportés. Nous avons sélectionné quelques-uns des gènes les plus enrichis pour examiner la pureté des EEC isolés (c.-à-d., Npr3, Cdh11, et Hapln1) et EEC (c.-à-d., Mgll, Fabp4, et Cd36). Par rapport aux marqueurs βd’Actin, Npr3, Cdh11et Hapln1 ont démontré une expression accrue dans les CEE par rapport aux CEC. De même, l’expression des marqueurs Mgll, Fabp4et Cd36 était plus grande chez les CEC que chez les CEE. Les marqueurs exprimés de façon unique pour chaque échantillon sont en accord avec des marqueurs caractéristiques des CEE et des CEC respectivement, ce qui indique un isolement réussi.
Cependant, le protocole actuel ne peut exclure la contamination croisée entre les deux populations des CE pendant l’isolement, même avec des digestions séquentielles soigneusement contrôlées. Par conséquent, certains marqueurs de surface cellulaire peuvent être appliqués pour plus de purification. Par exemple, NPR3 étiquette généralement l’endocardium10, tandis que l’APJ peut retracer la majorité des CEC16. Étant donné que ces deux marqueurs sont exprimés à la surface cellulaire, ils pourraient être utilisés pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), et les anticorps utilisés pour purifier davantage les populations distinctes d’EC. En outre, l’homme15 et la souris10 cœur scRNA-seq peut confirmer l’enrichissement de Npr3 dans les EECs, et Cd36 peut être potentiellement utilisé pour la purification CEC.
En conclusion, le protocole présenté décrit l’isolement indépendant des CEE et des CEC du cœur du rat. L’identification complète des propriétés cellulaires, rendue possible par l’isolement cellulaire, peut être utilisée pour des applications importantes en aval.

Cet article fournit un protocole détaillé (modifié de Gladka et coll.1) pour la dissection et l’isolement subséquent des cellules endocardiques endothéliales (EEC) et des cellules coronariennes endothéliales (CEC) des cœurs de rat. La capacité d’étudier ces populations cellulaires de façon indépendante permettrait d’explorer les mécanismes spécifiques au type cellulaire sous-jacents à une variété de maladies cardiaques qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles. Une méthode réussie pour la collecte de ces populations cellulaires indépendamment n’a pas encore été publiée, cependant.
Les CEC diffèrent des CEE en ce qui concerne leur origine, leurs marqueurs et leurs fonctions pendant le développement cardiaque et la maladie1,2,3,4,5,6,7. Les EEC proviennent de la surface ventrale du mésoderm cardiaque3. Ils proviennent de cellules Flk1et progénitrices en réponse à la signalisation VEGF et HIF et forment la couche la plus intime des trois régions discrètes du cœur en développement : l’atrium, le ventricule et le sinus venosus3,6. Le traçage génétique de lignée suggère que les cellules endocardiques pluripotentes du sinus venosus dérivent des cellules veineuses, qui migrent pour former la couche sous-apicardiale3. Par la suite, la couche sous-apicardiale se différencie en artères et veines coronaires, y compris les CEC, qui restent à travers le mur libre ventriculaire périphérique3,4. Cette voie endocardique à endothéliale est réglementée par VEGFC, ELA/APJ, et SOX17 signalant3,4,6,8,9. L’endocardium ventriculaire tire le moins de CEC du septum interventricular par un mécanisme inconnu3. Par la suite, la différenciation localisée entre les CEE et les CEC est suggérée par des marqueurs spécifiques à ces deux populations cellulaires, y compris Mgll, Fabp4, et Cd36 expression dans CEC, ou Npr3, Cdh11, et Hapln1 expression dans EECs3,5,10.
Les CEE et les CEC jouent des rôles différents dans la fonction cardiaque. La transition mésenchymale à la transition mésenchymale, la formation de valve, la maturation de chambre, la régulation des voies d’écoulement, et le développement du canal atrioventriculaire sont subordonnés aux EECs6. Alternativement, CEC contribuent au tonus vasomoteur et à l’inflammation des artères coronaires11. Ces écarts dans la fonction se traduisent par des rôles individualisés dans le développement de la maladie4,12. Par exemple, les preuves suggèrent que les EEC défectueux peuvent mener à la maladie congénitale de valve6, myocarde non comacturique6, effet septal atrioventriculaire6, fibroelastosis endocardial13, syndrome du coeur gauche hypoplastique13, hypoplasie ventriculaire13, et hypertrophie cardiaque12. De même, des études ont constaté que les CEC anormaux contribuent à la maladie coronarienne14 et à la thrombose11.
L’isolement réussi des CEE et des CEC est nécessaire pour obtenir une connaissance approfondie de ces deux populations cellulaires, qui pourraient être utilisées à la fois dans les milieux de recherche et cliniques. La détermination des facteurs de croissance et de différenciation de ces populations cellulaires fournirait une référence à la différenciation des sous-types endothéliaux des cellules souches pluripotentes induites (ciPS). En outre, l’identification complète des écarts dans le développement, la régulation et la fonction des CEE et des CEC est essentielle pour comprendre les facteurs génomiques et épigénomiques responsables de nombreuses maladies cardiaques d’une manière spécifique au type cellulaire. Cet article décrit les étapes de la collecte réussie des CEE et des CEC indépendamment, et fournit des preuves de la séparation en évaluant les niveaux d’expression génique des marqueurs spécifiques au type cellulaire.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

Il a été démontré que les cellules endocardiques endothéliales (EEC) et les cellules coronariennes endothéliales (CEC) diffèrent dans l’origine, le développement, les marqueurs et les fonctions. Par conséquent, ces deux populations cellulaires jouent un rôle unique dans les maladies cardiaques. Les études actuelles portant sur des cellules endothéliales isolées étudient les populations cellulaires composées de CEE et de CEC. Ce protocole décrit une méthode pour isoler indépendamment ces deux populations cellulaires pour la caractérisation spécifique aux cellules. Après la collecte du mur ventriculaire gauche et droit, les cellules endothéliales de la surface extérieure et de la surface intérieure sont libérées séparément à l’aide d’une solution tampon de digestion. La digestion séquentielle de la surface extérieure et de la couche endocardiale intérieure a conservé la séparation des deux populations de cellules endothéliales. L’isolement distinct des CEE et des CEC est vérifié par l’identification de marqueurs spécifiques à chaque population. Basé sur le profilage d’ARN à cellule unique publié précédemment dans le cœur de la souris, le Npr3, Hapln1, et l’expression de gène Cdh11 est unique aux EECs ; tandis que Fabp4, Mgll, et Cd36 expression génique est unique aux CEC. Les données qPCR ont révélé l’expression enrichie de ces marqueurs caractéristiques dans leurs échantillons respectifs, indiquant l’isolement réussi de ceE et de CEC, aussi bien que le maintien du phénotype de cellules, permettant une analyse fonctionnelle spécifique aux cellules.

Le processus d’isolement de la CEE et de la CEC est décrit à la figure 2. L’isolement réussi des CEE et des CEC a été déterminé en évaluant la présence de marqueurs pandothéliaux de cellules, ainsi que ceux distincts des deux populations de sous-types. Comme prévu, qPCR a révélé que par rapport à βl’actine, EECs exprimé des niveaux plus élevés de marqueurs endocardiques Npr3, Hapln1, et Cdh11 par rapport aux CEC (figure 3A). De même, les CEC ont exprimé des niveaux plus élevés de marqueurs coronariens Fabp4, Mgllet Cd36 par rapport aux CEE(figure 3B). En outre, les EEC et les CEC ont exprimé le gène marqueur pan-CE Cdh5, avec des niveaux légèrement plus élevés dans ceC(figure 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Figure 1 : Diagramme de dissection cardiaque. (A) Première coupe faite pour séparer le mur libre ventricule droit du septum. (B) Deuxième coupe faite pour libérer complètement le ventricule droit. (C) Première coupe faite pour séparer le mur libre ventricule gauche du septum. (D) Deuxième coupe faite pour libérer complètement le ventricule gauche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Figure 2 : Diagramme de la configuration de digestion des CEC et des CEE et l’arrangement suivant pour le tri cellulaire. (A) La paroi ventriculaire libre la plus intérieure et (B) la paroi libre ventriculaire la plus externe étaient (C) immergées dans le tampon de digestion ou (D) digérées dans le tampon de digestion respectivement. (E) Collecte et filtration de solutions cellulaires suivies par (F) globules rouges (RBC) lyse et (G) tri cellulaire magnétique activé (MACS) à l’aide de l’anticorps CD31. hh) Les CE purifiés ont été traités pour la vérification de l’expression génique à l’aide de qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Figure 3 : données qPCR vérifiant l’isolement des CEC et des CEE. (A) Les niveaux d’expression génique des marqueurs de la CEE Npr3, Cdh11et Hapln1 dans les CEE et les CEC ont été quantifiés par pcR en temps réel. (B) Les niveaux d’expression génique des marqueurs ceC Mgll, Fabp4et Cd36 dans les CEE et les CEC ont été quantifiés par pcR en temps réel. (C) Le marqueur pan-EC Cdh5 a été quantifié dans les CEE et les CEC par PCR en temps réel. (n 3 dans chaque groupe). Les barres représentent la moyenne de la SEM. 'p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01 vs EEC, non appréhing t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tableau 1. Tampon de digestion (1.5ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Stock Con.</td>
			<td>Final Con.</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dmem</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recette pour le tampon de digestion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tableau 2. Séquences d’apprêt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nom de gène</td>
			<td>Avant</td>
			<td>Inverse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3 (Npr3)</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCCCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1 Hapln1 Hapln1 Hapl</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCAGCTTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGGGTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36 (en anglais)</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGCCC</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-actin</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Séquences d’apprêt

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Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Nous présentons un protocole pour l’isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales endothéliales des coeurs de rat par la digestion séquentielle de tissu dans un tampon de digestion, la collection de cellules des cycles récurrents de centrifugeuses, et la purification de cellules utilisant des microbilles de CD31 anti-rat.

Isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales du mur libre ventriculaire du cœur de rat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour isoler les cellules endocardiques et les cellules endothéliales coronaires séparément du cœur pour aider les gens à comprendre l’expression et la fonction génétiques spécifiques au type cellulaire. Les principaux avantages de cette méthode sont la pureté et la viabilité élevées des CEE et des CEC isolées et que les cellules maintiennent leurs propriétés physiologiques à l’isolement. Les CEC et les CEE diffèrent à bien des égards, de sorte que la capacité d’étudier indépendamment ces populations cellulaires permet l’exploration de mécanismes spécifiques aux types cellulaires dans diverses maladies cardiaques.Cette méthode pourrait faciliter l’étude des facteurs transcriptonomiques et épigénétiques responsables de nombreuses maladies cardiaques d’une manière spécifique au type cellulaire. Les parties les plus délicates de cette méthode sont de déterminer les différentes parties du cœur et le moment de la digestion correctement pour éviter la contamination de type cellulaire. Yifei Miao, chercheur scientifique de mon laboratoire, démontrera la procédure.Après avoir récolté des cœurs de six rats Sprague Dawley de 50 à 100 grammes, lavez les organes avec 50 millilitres de HBSS froid trois fois pour enlever tout excès de sang et placer un cœur sous un microscope disséquant. Placez le cœur sur son visage postérieur plus plat pour identifier les côtés gauche et droit du tissu et localiser l’artère pulmonaire. Utilisez des ciseaux pour couper l’artère pulmonaire jusqu’à la chambre ventriculaire droite et couper le long du septum jusqu’à ce que l’apex soit atteint.Continuer à couper de l’apex jusqu’au côté postérieur du cœur le long du septum jusqu’à ce que la jonction de l’artère pulmonaire et la chambre ventriculaire droite est atteint. À partir de ce point, couper les côtés antérieurs et postérieurs du cœur perpendiculairement au point de dissection précédent et loin du septum jusqu’à ce que le mur libre ventriculaire droit soit libéré du reste du cœur. Placez ensuite le mur libre ventriculaire droit dans un tube de cinq millilitres de DMEM et localisez à nouveau l’aorte pour faciliter la collecte du mur libre ventriculaire gauche de la même manière que ce qui vient d’être démontré.Lorsque tous les murs libres ventriculaires ont été collectés, transférer les échantillons de tissus dans un plat de culture de 60 centimètres avec leurs surfaces intérieures couchées face contre terre dans le plat. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, ajouter 0,5 à un millilitre de tampon de digestion au plat directement sous les morceaux de tissu jusqu’à ce que seules les surfaces intérieures des tissus soient immergées. Pour éviter la contamination cellulaire non désirée, il est important que seule la surface intérieure du ventricule soit immergée dans le tampon de digestion et qu’elle soit digérée pendant exactement cinq minutes.Après cinq minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, arrêter la digestion avec cinq fois le volume de milieu cellulaire endothélial. Ensuite, utilisez une pipette d’un millilitre pour rincer la surface intérieure de chaque ventricule avec un milieu frais transférant le ruissellement à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 millilitres sur la glace. Pour la digestion coronaire des cellules endothéliales, couper le long de la surface extérieure du ventricule gauche sans contamination de la couche interne et placer chaque fragment de tube dans un tube séparé de cinq millilitres contenant un millilitre de tampon de digestion.Pour éviter la contamination par les CEE, il est important de ne couper que de la surface extérieure du ventricule. À l’aide de ciseaux de dissection, hacher la paroi ventriculaire en petits morceaux d’un millimètre cube et placer les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avec vortex toutes les deux à trois minutes. Lorsque les morceaux hachés sont petits mais visibles, ajouter quatre millilitres de milieu cellulaire endothélial au tube et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres pour transférer tout le volume de solution à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 millilitres sur la glace.Pour isoler les populations de cellules CD31 positives après leur digestion, pelleter les cellules par centrifugation et aspirer les supernatants. Si des granulés sont rouges, resuspendez les cellules en un à deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge par tube pour une incubation de cinq minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêter la lyse avec 10 millilitres de PBS et recueillir les cellules avec une deuxième centrifugation.Ensuite, ajoutez 90 microlitres de tampon de tri et 10 microlitres d’anticorps anti-CD31 PE à chaque tube de cellules. Après vortex, incuber les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 10 millilitres de tampon de tri aux tubes avec un mélange complet et recueillir les cellules par centrifugation.Resuspendez les granulés dans 80 microlitres de tampon de tri par tube, suivi de l’ajout de 20 microlitres de microbilles anti-PE. Après le vortex, placez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, puis lavez-les en tampon de tri de 10 millilitres par centrifugation comme nous venons de le démontrer. Resuspendez les granulés dans 500 microlitres de tampon de tri sur la glace et placez une colonne contenant des sphères super paramagnetic dans un séparateur magnétique.Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon de tri. Lorsque la colonne s’est vidée, ajouter 500 microlitres de la suspension endocardique des cellules endocardiques à la colonne, suivie de quatre lavages avec trois millilitres de tampon de tri par lavage. Après le dernier lavage, transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 15 millilitres et utiliser le piston à colonne et cinq millilitres de milieu de cellule endothéliale fraîche pour rincer les cellules positives CD31 de la colonne dans le tube de collecte.Puis recueillir la perle isolée cellules endothéliales par centrifugation. Comme prévu, le PCR quantitatif révèle que par rapport à la bêta-actine, les cellules endocardiques endocardiques ont exprimé des niveaux plus élevés des marqueurs endocardiaux Npr3, Hapln1 et Cdn11 par rapport aux cellules endothéliales coronaires. De même, les cellules endothéliales coronaires ont exprimé des niveaux plus élevés des marqueurs coronaires Fabp4, Mgll, et Cd36 comparés aux cellules endocardiales endocardiales endothéliales.En outre, les deux types de cellules ont exprimé le gène marqueur de cellules pan-endothéliales Cdh5 avec des niveaux légèrement plus élevés observés dans les cellules endothéliales coronaires. Nous pouvons encore purifier les cellules à l’aide de FACS et d’anticorps spécifiques aux populations cellulaires. Par exemple, nous pouvons utiliser anti-Npr3 pour trier les CEE et les anti-Cd36 pour trier les CEC.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le rôle des CEE et des CEC dans le développement cardiaque et la maladie d’une manière spécifique au type de cellule.

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