Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Gli autori apprezzano molto la dott.ssa Lingli Wang per il suo aiuto con il protocollo sugli animali e il Dipartimento di Pediatria di Stanford per il supporto infrastrutturale. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NHLBI K99 HL135258 (a M.G.).

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC31608) presso la Stanford University.
1. Preparazione dei buffer
<ol><li>Preparare il buffer di digestione utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 1.<ol>
<li>Preparare la soluzione stock DNase I: Dissolvere DNase I in acqua senza RNase per una soluzione di stock di 2.000 unità/mL (1 mg/mL). Aliquota e conservare la soluzione di stock a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare la soluzione libera: Sciogliere la liberazione con acqua senza RNase per una soluzione stock di 5 mg/mL. Ruotarlo su una banchia a rulli a 4 gradi centigradi per 30 min. Aliquot e conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il buffer di ordinamento diluindo 0,5 M di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) e 10% di serie di albumina di siero bovino (BSA) con 1x fosfato buffertans (PBS) per una concentrazione finale di 2 mM di EDTA e 0,5% di BSA.</li>
</ol>2. Collezione Cuore
NOTA: in questo protocollo sono stati utilizzati sei ratti Sprague Dawley del peso di 50-100 g. Nessuna differenza di genere è stata osservata.
<ol><li>Eutanasia il ratto con CO2 e lo mette in posizione supina su una piattaforma di dissezione. Pin le estremità verso il basso e sterilizzare sia l'addome e il torace con 70% etanolo.</li>
	<li>Aprire l'addome con le forbici e inserire un ago da 21 G nella porzione della vena cava posteriore situata dietro l'intestino. Tirare indietro lo stantuffo della siringa, ritirando il sangue dalla vena fino a quando il fegato appare di colore più chiaro e non può essere ritirato più sangue, indicando una sufficiente rimozione del sangue.</li>
	<li>Usando le forbici, aprire il torace con attenzione per evitare di danneggiare il polmone e il cuore. Sollevare l'arco/atrio dell'aorta con le pinze e tagliare l'aorta, l'arteria polmonare, le vene polmonari e la vena cava per liberare e rimuovere il cuore.</li>
	<li>Lavare il cuore con 50 mL di soluzione di sale bilanciato (HBSS) fredda (HBSS) per rimuovere il sangue eccessivo.</li>
	<li>Al microscopio a microdisezione, rimuovere la parete libera ventricolare destra in un tubo da 5 mL contenente il mezzo Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco (Figura 1A,B).<ol>
<li>Posare il cuore sul suo volto più piatto e posteriore per identificare il lato sinistro e destro.</li>
		<li>Individuare l'arteria polmonare, la più anteriore delle vene e delle arterie che si ramificano dalla parte superiore del cuore e tagliano l'arteria polmonare fino alla camera ventricolare destra. Sulla faccia anteriore del cuore, tagliare lungo il setto fino a raggiungere l'apice. Continuare a tagliare dall'apice il lato posteriore del cuore lungo il setto fino all'arteria polmonare e al punto di giunzione della camera ventricolare destra (Figura 1A).</li>
		<li>Partendo dall'arteria polmonare e dal punto di giunzione ventricolare destro, tagliare sia il lato anteriore che il lato posteriore del cuore perpendicolarmente alla dissezione precedente e lontano dal setto, fino a quando la parete libera ventricolare destra non viene liberata dal resto del cuore (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al microscopio a microdisezione, rimuovere la parete libera ventricolare sinistra in un tubo da 5 mL contenente DMEM (Figura 1C,D).<ol>
<li>Individuare l'aorta, ramificandosi dalla parte superiore del cuore dietro l'arteria polmonare, e ripetere il metodo descritto nel passaggio 2.5 per tagliare la parete libera ventricolare sinistra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Digestione CEE
<ol><li>Posizionare i tessuti a parete libera ventricolare destro e sinistro in un piatto di coltura di 60 cm con la superficie interna distesa piatta, rivolta verso il basso (Figura 2). NOTA: La superficie interna è la faccia interna del ventricolo leggermente concavo a forma di, come illustrato nella Figura 2A,C.</li>
	<li>Aggiungere 0,5-1 mL di tampone di digestione al piatto, ponendo la punta della pipetta direttamente sotto il tessuto. Continuare fino a quando solo la superficie interna è immersa.</li>
	<li>Incubare il piatto in un 5% di CO2, 37 gradi centigradi incubatrice per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere il mezzo EC al piatto di coltura per fermare la digestione. NOTA: mantenere la quantità di buffer di digestione a medio EC come rapporto 1:5.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta da 1 mL per lavare la superficie interna dei ventricoli con il mezzo EC e trasferire il deflusso in un tubo di raccolta da 50 mL attraverso un strainer da 40 mm (Figura 2E). Mantenere le collezioni sul ghiaccio per la purificazione a valle.</li>
</ol>4. Digestione CEC
<ol><li>Tagliare lungo la superficie esterna del ventricolo sinistro senza contaminazione dallo strato interno (Figura 2B,D) e posizionare ciascuno in un tubo da 5 mL separato contenente 1 mL del tampone di digestione. NOTA: Il ventricolo sinistro può essere identificato come il ventricolo più spesso e la superficie esterna può essere determinata come la faccia esterna del ventricolo leggermente concavo.</li>
	<li>Utilizzando le forbici a dissezione, sminuisci la parete ventricolare in piccoli pezzi di 1 mm3.</li>
	<li>Incubare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per circa 15-20 min.</li>
	<li>Pipetta 4 mL di EC medio nel tubo 5 mL per terminare la digestione.</li>
	<li>Trasferire la soluzione con una pipetta sierologica da 5 mL in un tubo da 50 mL attraverso un colino da 40 mm (Figura 2E). Mantenere le collezioni sul ghiaccio per la purificazione a valle.</li>
</ol>5. Raccolta di celle
<ol><li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) e poi aspirare il super-natante.</li>
	<li>Se il pellet appare rosso, sospendere il pellet in 1-2 mL di 1x buffer di liscivia dei globuli rossi (RBC) (Figura 2F). NOTA: se non sono presenti RBC, procedere al passaggio 6.</li>
	<li>Incubare i tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Pipette 10 mL di PBS nei tubi da 50 mL per fermare la lisi.</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 10 min a RT, e poi aspirare il supernatante.</li>
</ol>6. Ordinamento CE
<ol><li>Aggiungete 90 l di tampone di smistamento e 10- L di anticorpi anti-CD31 PE nei tubi da 50 mL.</li>
	<li>Vorticare i tubi e poi incubarli per 10 min in un frigorifero di 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di smistamento tampone nei tubi, mescolare accuratamente, quindi centrifugare a 300 x g per 10 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 80 litri di tampone di smistamento e 20 -L di microsfere anti-PE.</li>
	<li>Vorticare i tubi e incubare a 4 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di smistamento tampone nei tubi, mescolare accuratamente, e quindi centrificarli a 300 x g per 10 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e sospendere il pellet in 500 - L di buffer di smistamento.</li>
	<li>Posizionare una colonna contenente sfere superparamagnetiche in un separatore magnetico e risciacquare la colonna con 3 mL di buffer di ordinamento.</li>
	<li>Dopo che la colonna è "flow stop", pipetta 500 -L della sospensione cellulare nelle colonne e quindi lavare le colonne con buffer di ordinamento. Ripetere il lavaggio 3x, ciascuno con 3 mL di buffer di ordinamento (Figura 2G).</li>
	<li>Rimuovere le colonne dal separatore e posizionarle sopra un nuovo tubo di raccolta da 15 mL.</li>
	<li>Con una pipetta, aggiungere 5 mL di mezzo EC alle colonne e spingere la soluzione attraverso l'utilizzo di uno stantuffo di colonna.</li>
	<li>Centrifugare i tubi di raccolta a 300 x g per 10 min a RT e poi aspirare il supernatante.</li>
	<li>Estrarre l'RNA dal pellet cellulare della CEE e cec utilizzando un kit, seguendo le istruzioni del produttore. Si può ottenere un minimo di 500 ng di RNA. NOTA: Dopo l'estrazione dell'RNA, il campione può essere conservato a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Trascrivere inverso 500 ng di RNA per ottenere cDNA utilizzando un primer casuale e un kit, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire la PCR quantitativa per la convalida delle popolazioni endocardiali ed endoteliali (Figura 2H). Le sequenze di Primer sono elencate nella tabella 2.<ol>
<li>Aggiungete 5 -L di EEC o CEC cDNA (1 ng/L) nei pozze di una piastra da 384 qPCR. Aggiungere il cDNA CeE o CEC in abbastanza pozzi in modo che ci siano tre pozzi per numero di primer.</li>
		<li>Mescolare 6 l di 2x qPCR SYBR buffer verde con 0,5 l di ogni primer da 10 M, inclusi i primer avanti e indietro, e aggiungerli in un unico pozzo corrispondente a ciascun gene candidato.</li>
		<li>Sigillare la piastra con pellicola plastica e centrifugare per 1 min a 300 x g a RT.</li>
		<li>Mettete la piastra in una macchina qPCR e poi avviate il programma a 95 gradi centigradi per 3 min, seguite da 95 gradi centigradi per 15 s, quindi 55 gradi centigradi per 60 s. Ripetete i due passaggi successivi per 45 cicli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I CEC e gli EEC differiscono per origine, marcatori e funzioni, e quindi potrebbero svolgere ruoli unici nello sviluppo e nella malattia. I protocolli esistenti per l'isolamento delle cellule endotemili sono limitati ai tessuti macrovascolari, trascurando la raccolta delle EEC, limitando così lo studio delle funzioni specifiche della CEC e della CEE. È essenziale isolare e studiare queste due popolazioni in modo indipendente, in quanto questa conoscenza fornirebbe un riferimento per la differenziazione degli iPSC in CEC e EEC per studi futuri e faciliterebbe l'esame di queste due popolazioni cellulari per potenziali bersagli terapeutici per varie malattie cardiache. Questo nuovo protocollo delinea un metodo per l'isolamento degli EEC dalla superficie interna e dai CEC dalla superficie esterna della parete libera ventricolare dei ratti adulti.
È fondamentale controllare i tempi per ogni passaggio in modo molto preciso in questo protocollo. Poiché il numero di EEC è molto limitato nel tessuto cracoitale del ratto, abbiamo ridotto al minimo il tempo di digestione dello strato interno del cuore per prevenire danni cellulari e, cosa più importante, la contaminazione da CEC. L'aggiunta immediata della soluzione media CE per porre fine alla reazione enzimatica è anche molto importante per mantenere un'elevata vitalità cellulare. Un pellet rosso che segue la raccolta cellulare suggerisce la presenza di un gran numero di RBC. Utilizzando l'attuale protocollo, siamo stati in grado di isolare 105 EEC da sei cuori di ratto. Queste cellule potrebbero essere semiate su un piatto di coltura cellulare per un'ulteriore espansione e caratterizzazione.
Durante la preparazione del tessuto per la raccolta della parete libera, il cuore è stato lavato con HBSS per rimuovere la maggior parte degli RBC rimanenti. La composizione del tampone di digestione garantisce una sufficiente liberazione delle cellule endoteliali, dove l'enzima di digestione liberato rimuove il tessuto delle cellule esposte, DNase I elimina il DNA dalle cellule morte per promuovere il distacco cellulare che può essere inibito dalla qualità adesiva del DNA, il buffer HEPES bilancia il pH e il DMEM è un mezzo basale modificato con una maggiore concentrazione di aminoacidi e vitamine per una migliore manutenzione cellulare e contiene il calcio necessario per attivare la liberazione.
Secondo il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ottenuto sia dall'uomo15 che dal cuore di topo10, sono stati riportati diversi marcatori attribuiti a specifiche popolazioni CE. Abbiamo selezionato alcuni dei geni più arricchiti per esaminare la purezza delle EEC isolate (ad esempio, Npr3, Cdh11e Hapln1) e EEC (ad esempio, Mgll, Fabp4e Cd36). In relazione ai marcatori β-Actin, Npr3, Cdh11e Hapln1 hanno dimostrato un aumento dell'espressione negli EEC rispetto ai CEC. Analogamente, l'espressione dei marcatori Mgll, Fabp4e Cd36 era maggiore nei CEC rispetto agli EEC. I marcatori espressi in modo univoco per ogni campione sono in accordo con i marcatori caratteristici rispettivamente degli EEC e dei CEC, che indicano un isolamento riuscito.
Tuttavia, l'attuale protocollo non può escludere la contaminazione incrociata tra le due popolazioni della CE durante l'isolamento, anche con digestione sequenziali attentamente controllate. Pertanto, alcuni marcatori di superficie cellulare possono essere applicati per un'ulteriore purificazione. Ad esempio, NPR3 generalmente etichetta l'endocardio10, mentre APJ può tracciare la maggior parte dei CEC16. Poiché questi due marcatori sono espressi sulla superficie cellulare, potrebbero essere utilizzati per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e gli anticorpi utilizzati per purificare ulteriormente le popolazioni CE distinte. Inoltre, l'uomo15 e il topo10 cardiaco scRNA-seq possono confermare l'arricchimento di Npr3 nei CES, e Cd36 può essere potenzialmente utilizzato per la purificazione della CEC.
In conclusione, il protocollo presentato delinea l'isolamento indipendente delle EEC e dei CEC dal cuore del ratto. L'identificazione completa delle proprietà cellulari, abilitata dall'isolamento cellulare, può essere utilizzata per applicazioni a valle significative.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato (modificato da Gladka et al.1)per la dissezione e il successivo isolamento delle cellule endoteliali endocardiche (EEC) e delle cellule endoteliali coronariche (CEC) dai cuori dei ratti. La capacità di studiare queste popolazioni cellulari in modo indipendente consentirebbe l'esplorazione di meccanismi specifici del tipo di cellula alla base di una varietà di malattie cardiache che potrebbero servire come potenziali bersagli terapeutici. Un metodo efficace per la raccolta di queste popolazioni cellulari in modo indipendente deve ancora essere pubblicato, tuttavia.
I CEC differiscono dalle EEC per quanto riguarda la loro origine, marcatori e funzioni durante lo sviluppo cardiaco e la malattia1,2,3,4,5,6,7. Le EEC derivano dalla superficie ventrale del mesoderma cardiaco3. Essi derivano dalle+ cellule progenitrici Flk1 in risposta alla segnalazione VEGF e HIF e formano lo strato più interno delle tre regioni discrete del cuore in via di sviluppo: l'atrio, il ventricolo e il seno venoso3,6. L'analisi genetica del lignaggio suggerisce che le cellule endocardiali pluripotenti del venoso sinusatorio derivano cellule venose, che migrano per formare lo strato subepicardio3. Successivamente, lo strato subepicardio si differenzia in arterie coronarie e vene, compresi i CEC, che rimangono attraverso la parete libera ventricolare periferica3,4. Questa via endocardiale a endoteliale è regolata da VEGFC, ELA/APJ e SOX17 segnalazione3,4,6,8,9. L'endocardio ventricolare deriva il minor numero di CEC del setto interventricolare da un meccanismo sconosciuto3. Successivamente, la differenziazione localizzata tra EEC e CEC viene suggerita da marcatori specifici per queste due popolazioni di celle, tra cui le espressioni Mgll, Fabp4 e Cd36 nei CEC o le espressioni Npr3, Cdh11 e Hapln1 negli EEC3,5,10.
Gli EEC e i CEC svolgono ruoli diversi nella funzione cardiaca. Transizione da endocardiale a mesenchymal, formazione di valvole, maturazione della camera, regolazione del tratto di deflusso e sviluppo del canale atrioventricolare sono contingenti su EEC6. In alternativa, i CEC contribuiscono al tono vasomotorio e all'infiammazione delle arterie coronarie11. Queste varianze nella funzione si traducono in ruoli individualizzati nello sviluppo della malattia4,12. Ad esempio, l'evidenza suggerisce che malfunzionanti EEC possono portare a malattia valvolare congenita6, miocardio6, effetto settale atrioventricolare6, fibroplastica endocardiale13, ipoplastica sinistra cardiaca13, ipoplasia ventricolare13e ipertrofia cardiaca12. Allo stesso modo, gli studi hanno trovato che i CEC anormali contribuiscono alla malattia coronarica14 e trombosi11.
Il successo dell'isolamento degli EEC e dei CEC è necessario per ottenere una conoscenza completa di queste due popolazioni cellulari, che potrebbero essere utilizzate sia nella ricerca che in quelli clinici. Determinare i fattori di crescita e differenziazione di queste popolazioni cellulari fornirebbe un riferimento per la differenziazione dei sottotipi endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Inoltre, l'identificazione completa delle varianze nello sviluppo, nella regolazione e nella funzione delle EEC e dei CEC è fondamentale per comprendere i fattori genomici ed epigenomici responsabili di numerose malattie cardiache in modo specifico per il tipo di cellula. Questo articolo descrive i passaggi per la raccolta di successo di EEC e CEC in modo indipendente e fornisce prove di separazione valutando i livelli di espressione genica dei marcatori specifici del tipo di cellula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

È stato dimostrato che le cellule endoteliali endocardiali (EEC) e le cellule endoteliali coronariche (CEC) differiscono per origine, sviluppo, marcatori e funzioni. Di conseguenza, queste due popolazioni cellulari svolgono ruoli unici nelle malattie cardiache. Gli studi attuali condotti sulle cellule endoteliali isolate studiano le popolazioni cellulari costituite sia da EEC che da CEC. Questo protocollo descrive un metodo per isolare in modo indipendente queste due popolazioni di cellule per la caratterizzazione specifica della cellula. Dopo la raccolta della parete libera ventricolare sinistra e destra, le cellule endoteliali dalla superficie esterna e dalla superficie interna vengono liberate separatamente utilizzando una soluzione tampone di digestione. La digestione sequenziale della superficie esterna e dello strato endocardiale interno ha mantenuto la separazione delle due popolazioni di cellule endoteliali. L'isolamento separato degli EEC e dei CEC viene ulteriormente verificato attraverso l'identificazione di marcatori specifici per ciascuna popolazione. Sulla base della profilazione dell'RNA a singola cellula pubblicata in precedenza nel cuore del topo, l'espressione genica Npr3, Hapln1e Cdh11 è unica per le EEC; mentre l'espressione genica Fabp4, Mglle Cd36 è unica per i CEC. I dati di qPCR hanno rivelato l'espressione arricchita di questi marcatori caratteristici nei rispettivi campioni, indicando il successo dell'isolamento della CEE e della CEC, nonché la manutenzione del fenotipo cellulare, consentendo un'ulteriore analisi funzionale specifica delle cellule.

Il processo di isolamento CEE e CEC è descritto nella Figura 2. Il successo dell'isolamento degli EEC e dei CEC è stato determinato valutando la presenza di marcatori di cellule paneteliali, nonché di quelli distinti per le due popolazioni di sottotipi. Come previsto, qPCR ha βrivelato che rispetto a-actin, i CEE hanno espresso livelli più elevati di marcatori endocardiali Npr3, Hapln1 e Cdh11 rispetto ai CEC (Figura 3A). Allo stesso modo, i CEC hanno espresso livelli più elevati di marcatori coronarici Fabp4, Mglle Cd36 rispetto agli EEC (Figura 3B). Inoltre, sia gli EEC che i CEC hanno espresso il gene dei marcatori panCE Cdh5, con livelli leggermente più elevati nella CEC (Figura 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Figura 1: Diagramma della dissezione cardiaca. (A) Primo taglio fatto per separare la parete libera del ventricolo destro dal setto. (B) Secondo taglio fatto per liberare completamente il ventricolo destro. (C) Primo taglio fatto per separare la parete libera del ventricolo sinistro dal setto. (D) Secondo taglio fatto per liberare completamente il ventricolo sinistro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Figura 2: Diagramma di impostazione della digestione dei CEC e delle EEC e la seguente disposizione per lo smistamento delle cellule. (A) La parete ventricolare libera più interna e la parete libera ventricolare(B)più esterna erano (C) immerse nel buffer di digestione o (D)digerite rispettivamente nel buffer di digestione. (E) Raccolta e filtrazione di soluzioni cellulari seguite da (F) lis dei globuli rossi (RBC) e (G) la selezione di cellule magnetiche (MACS) utilizzando l'anticorpo CD31. (h) Le EC purificate sono state elaborate per la verifica dell'espressione genica mediante qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Figura 3: dati qPCR che verificano l'isolamento dei CEC e degli EEC. (A) I livelli di espressione genica dei marcatori CEE Npr3, Cdh11e Hapln1 nei CES e ai CEC sono stati quantificati dalla PCR in tempo reale. (B) I livelli di espressione genica dei marcatori CEC Mgll, Fabp4e Cd36 nei PEC e dai CEC sono stati quantificati dalla PCR in tempo reale. (C) Il marcatore panCE Cdh5 è stato quantificato negli EEC e nelle CEC mediante PCR in tempo reale. (n - 3 in ogni gruppo). Le barre rappresentano la media : SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabella 1. Buffer di digestione (1,5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Magazzino Con.</td>
			<td>Finale Di.</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>LiberaTM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (informazioni in stato di</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricetta per il buffer di digestione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tabella 2. Sequenze Primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nome gene</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>Invertire</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGGCCT</td>
			<td>GGAATCTCTCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGGGGGGGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGGGCTCTCTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1</td>
			<td>CCAGCTCTAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTGCTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGAGGCCTTGGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTCG</td>
			<td>ACTCTCTCTGGATGACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36 (in inglese)</td>
			<td>GCAAAAAGACTGCAGCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAAGTGTCTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-actin</td>
			<td>TCTGTGGATTGGGGCTCTCTCT</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Sequenze primer

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Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento delle cellule endocardiali e coronariche dai cuori dei ratti attraverso la digestione sequenziale dei tessuti in un buffer di digestione, la raccolta cellulare da cicli di centrifuga ricorrenti e la purificazione cellulare utilizzando microsfere CD31 anti-rat.

Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per isolare le cellule endocardiali e le cellule endoteliali coronarie separatamente dal cuore per aiutare le persone a comprendere l'espressione e la funzione genica specifica del tipo cellulare. I principali vantaggi di questo metodo sono l'elevata purezza e vitalità della CEE isolata e dei PEC e il fatto che le cellule mantengono le loro proprietà fisiologiche al momento dell'isolamento. I PEC e gli EEC differiscono sotto molti aspetti, quindi la capacità di indagare in modo indipendente queste popolazioni cellulari consente l'esplorazione di meccanismi specifici del tipo cellulare in varie malattie cardiache.Questo metodo potrebbe facilitare lo studio di fattori trascrinomi ed epigenetici responsabili di numerose malattie cardiache in modo specifico del tipo cellulare. Le parti più difficili di questo metodo sono determinare le diverse porzioni cardiache e cronometrare correttamente la digestione per evitare la contaminazione del tipo di cellula. A dimostrare la procedura sarà Yifei Miao, un ricercatore del mio laboratorio.Dopo aver raccolto i cuori da sei ratti Sprague Dawley da 50 a 100 grammi, lavare gli organi con 50 millilitri di HBSS freddo tre volte per rimuovere il sangue in eccesso e posizionare un cuore al microscopio sezionato. Posizionare il cuore sul suo viso posteriore più piatto per identificare i lati sinistro e destro del tessuto e localizzare l'arteria polmonare. Utilizzare le forbici per tagliare l'arteria polmonare fino alla camera ventricolare destra e tagliare lungo il setto fino a raggiungere l'apice.Continuare a tagliare dall'apice sul lato posteriore del cuore lungo il setto fino a raggiungere la giunzione dell'arteria polmonare e la camera ventricolare destra. Partendo da questo punto, tagliare sia i lati anteriore che posteriore del cuore perpendicolarmente al punto di dissezione precedente e lontano dal setto fino a liberare la parete libera ventricolare destra dal resto del cuore. Quindi posizionare la parete libera ventricolare destra in un tubo da cinque millilitri di DMEM e localizzare nuovamente l'aorta per facilitare la raccolta della parete libera ventricolare sinistra nello stesso modo appena dimostrato.Quando tutte le pareti libere ventricolari sono state raccolte, trasferire i campioni di tessuto in un piatto di coltura di 60 centimetri con le loro superfici interne sdraiate a faccia in giù nel piatto. Utilizzando una punta di pipetta da un millilitro, aggiungere 0,5 a un millilitro di tampone di digestione al piatto direttamente sotto i pezzi di tessuto fino a quando non vengono immerse solo le superfici interne dei tessuti. Per evitare la contaminazione cellulare indesiderata, è importante che solo la superficie interna del ventricolo sia immersa nel tampone di digestione e sia digerita per esattamente cinque minuti.Dopo cinque minuti nell'incubatore di coltura cellulare, interrompere la digestione con cinque volte il volume del mezzo cellulare endoteliale. Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per sciacquare la superficie interna di ogni ventricolo con un mezzo fresco che trasferisce il deflusso attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 millilitri su ghiaccio. Per la digestione coronarica delle cellule endoteliali, tagliare lungo la superficie esterna del ventricolo sinistro senza contaminazione dallo strato interno e posizionare ogni frammento di tubo in un tubo separato da cinque millilitri contenente un millilitro di tampone di digestione.Per evitare la contaminazione da EEC, è importante tagliare solo dalla superficie esterna del ventricolo. Usando le forbici di dissezione, tritare la parete ventricolare in piccoli pezzi di un millimetro cubico e posizionare i tubi in un bagno d'acqua celsius di 37 gradi per 15-20 minuti con vortice ogni due o tre minuti. Quando i pezzi tritati sono piccoli ma visibili, aggiungere quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale al tubo e utilizzare una pipetta sierologica a cinque millilitri per trasferire l'intero volume della soluzione attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 millilitri sul ghiaccio.Per isolare le popolazioni di cellule positive cd31 dopo la loro digestione, pellet le cellule per centrifugazione e aspirare i supernatanti. Se i pellet sono rossi, rimescolare le cellule in uno o due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tubo per un'incubazione di cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, interrompere la lisi con 10 millilitri di PBS e raccogliere le cellule con una seconda centrifugazione.Successivamente, aggiungere 90 microlitri di tampone di cernita e 10 microlitri di anticorpi anti-CD31 PE a ciascun tubo di cellule. Dopo il vortice, incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di cernita ai tubi con miscelazione accurata e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Risostimato il pellet in 80 microlitri di tampone di cernita per tubo, seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di microperline anti-PE. Dopo il vortice, posizionare i tubi a quattro gradi Celsius per 15 minuti, seguito dal lavaggio in 10 millilitri di tampone di cernita per centrifugazione come appena dimostrato. Risostimato i pellet in 500 microlitri di tampone di cernita sul ghiaccio e posizionare una colonna contenente sfere super paramagnetiche in un separatore magnetico.Risciacquare la colonna con tre millilitri di tampone di smistamento. Quando la colonna si è svuotata, aggiungere alla colonna 500 microlitri della sospensione cellulare endocardiale endocardiale, seguiti da quattro lavaggi con tre millilitri di tampone di cernita per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 15 millilitri e utilizzare lo stantuffo a colonna e cinque millilitri di mezzo cellulare endoteliale fresco per sciacquare le cellule positive CD31 dalla colonna nel tubo di raccolta.Quindi raccogliere le cellule endoteliali isolate del tallone mediante centrifugazione. Come previsto, la PCR quantitativa rivela che rispetto all'actina beta, le cellule endoteliali endocardiali espressero livelli più elevati dei marcatori endocardiali Npr3, Hapln1 e Cdn11 rispetto alle cellule endoteliali coronarie. Allo stesso modo, le cellule endoteliali coronarie esprimerono livelli più elevati dei marcatori coronarico Fabp4, Mgll e Cd36 rispetto alle cellule endoteliali endocardiali.Inoltre, entrambi i tipi di cellule hanno espresso il gene del marcatore cellulare pan-endoteliale Cdh5 con livelli leggermente più alti osservati nelle cellule endoteliali coronarie. Possiamo purificare ulteriormente le cellule usando FACS e anticorpi specifici per le popolazioni cellulari. Ad esempio, possiamo usare anti-Npr3 per ordinare EEC e anti-Cd36 per ordinare i PEC.Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare il ruolo della CEE e dei PEC nello sviluppo cardiaco e nelle malattie in modo specifico per tipo di cellula.

Research

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Developmental Biology

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Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

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