Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

저자는 동물 프로토콜에 대한 그녀의 도움에 대한 박사 Lingli 왕, 인프라 지원을위한 스탠포드 소아과의 부서에 크게 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NHLBI K99 HL135258 (M.G.에 의해 지원되었습니다).

모든 동물 절차는 스탠포드 대학에서 실험실 동물 관리에 행정 패널에 의해 승인되었다 (APLAC31608) .
1. 버퍼준비
<ol><li>표 1에나열된 시약을 사용하여 소화 버퍼를 준비합니다.<ol>
<li>DNase I 재고 솔루션 준비: DNase I을 RNase 가 없는 물에 녹여 2,000 단위/mL(1 mg/mL)의 재고 용액을 제공합니다. Aliquot및 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오.</li>
		<li>해방용 용액 준비: 5 mg/mL의 재고 용액을 위해 RNase가 없는 물로 해방을 용해하십시오. 30 분 동안 4 °C에서 롤러 뱅크에 회전, 알리쿼트 및 -20 °C에서 재고 용액을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTA 의 2 mM 및 BSA의 0.5%의 최종 농도에 대해 1x 인산완충식염수(PBS)를 1회 가루로 0.5M 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 및 10% 소 혈청 알부민(BSA) 스톡 용액을 희석하여 선별 완충제를 준비한다.</li>
</ol>2. 하트 컬렉션
참고: 50-100 g의 무게의 6마리의 스프라그 도울리 쥐가 이 프로토콜에 사용되었습니다. 성별 차이는 관찰되지 않았습니다.
<ol><li>CO2로 쥐를 안락사시키고 해부 플랫폼에 소인 위치에 놓습니다. 사지를 아래로 고정하고 70 % 에탄올로 복부와 가슴을 모두 살균하십시오.</li>
	<li>가위로 복부를 열고 창자 뒤에위치한 후방 정맥 의 부분에 21G 바늘을 삽입하십시오. 주사기 플런저를 다시 당겨, 간이 색깔이 더 밝게 나타나고 더 이상 혈액이 철회 될 수 없을 때까지 정맥에서 혈액을 철회, 충분한 혈액 제거를 나타내는.</li>
	<li>가위를 사용하여 폐와 심장이 손상되지 않도록 조심스럽게 가슴을 엽니다. 집게로 대동맥 아치 / 아트리움을 들어 올리고 대동맥, 폐 동맥, 폐 정맥 및 정맥을 잘라 심장을 해방하고 제거합니다.</li>
	<li>차가운 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 완충액 3x로 심장을 씻어 과도한 혈액을 제거합니다.</li>
	<li>미세 해부 현미경으로, Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 포함하는 5 mL 튜브로 우심실 무료 벽을 제거하십시오(그림 1A,B).<ol>
<li>왼쪽과 오른쪽을 식별하기 위해 아첨, 후방 얼굴에 마음을 놓습니다.</li>
		<li>심장 의 상단에서 분기 정맥과 동맥의 가장 앞쪽폐 동맥을 찾아 오른쪽 심실 챔버아래로 폐 동맥을 통해 잘라. 심장의 앞쪽 면에서 정점에 도달 할 때까지 중격을 따라 자른다. 폐 동맥 및 우심실 챔버 접합점까지 중격을 따라 심장의 후방쪽으로 정점에서 절단을 계속(그림 1A).</li>
		<li>폐 동맥 과 우심실 접합 지점에서 시작하여, 오른쪽 심실 무료 벽이 심장의 나머지 부분에서 해방 될 때까지, 이전 해부에 수직으로 심장의 전방과 후방 측면을 모두 잘라( 그림1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 해부 현미경하에서, DMEM을 포함하는 5 mL 관으로 좌심실 자유 벽을 제거하십시오(그림 1C,D).<ol>
<li>대동맥을 찾아, 폐 동맥 뒤의 심장 의 상부에서 분기하고, 좌심실 자유 벽을 잘라 단계 2.5에 설명 된 방법을 반복.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EEC 소화
<ol><li>오른쪽과 왼쪽 심실 자유 벽 조직을 60cm 배양 접시에 놓고 안쪽 표면을 평평하게 눕고 아래를 향합니다(그림 2). 참고: 내부 표면은 그림 2A,C에표시된 것처럼 약간 오목한 모양의 심실의 내부 면입니다.</li>
	<li>접시에 소화 완충제 0.5-1 mL을 추가하여 파이펫 끝을 티슈 바로 아래에 놓습니다. 내부 표면만 침지될 때까지 계속합니다.</li>
	<li>접시를 5%CO2,37°C 인큐베이터에서 5분 동안 배양한다.</li>
	<li>소화를 막기 위해 배양 접시에 EC 배지를 추가합니다. 참고: 소화 버퍼의 양을 EC 배지에 1:5 비율로 유지합니다.</li>
	<li>1 mL 파이펫을 사용하여 EC 배지로 심실의 내부 표면을 세척하고 유출을 40 mm 스트레이너를 통해 50 mL 수집 튜브로 옮니다(그림 2E). 하류 정화를 위해 얼음에 수집물을 보관하십시오.</li>
</ol>4. CEC 소화
<ol><li>내측층으로부터의 오염 없이 좌심실의 외부 표면을 따라절단(도 2B,D)각각 소화 완충액의 1 mL을 포함하는 별도의 5 mL 튜브에 각각 놓는다. 참고 : 좌심실은 두꺼운 심실로 식별 될 수 있으며, 외부 표면은 약간 오목 한 심실의 외부 면으로 결정 될 수있다.</li>
	<li>해부를 사용하여 심실 벽을 작은 1mm3 개로 잘라내보릅니다.</li>
	<li>튜브를 37°C 수조에서 약 15-20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>EC 배지의 피펫 4 mL을 5 mL 튜브 내로 소화를 종료한다.</li>
	<li>40 mm 스트레이너를 통해 5 mL 혈청학적 파이펫으로 용액을 50 mL 튜브로 이송합니다(그림2E). 하류 정화를 위해 얼음에 수집물을 보관하십시오.</li>
</ol>5. 셀 수집
<ol><li>실온 (RT)에서 10 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상월체를 흡인합니다.</li>
	<li>펠릿이 빨간색으로 나타나면 1x 적혈구 (RBC) 라싱 버퍼의 1-2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오(그림 2F). 참고: RBC가 없는 경우 6단계로 진행합니다.</li>
	<li>튜브를 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 PBS의 피펫 10 mL은 매란을 중지합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상월체를 흡인합니다.</li>
</ol>6. EC 정렬
<ol><li>90 μL의 선별 버퍼와 50 mL 튜브에 항 CD31 PE 항체 10 μL을 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 소용돌이시키고 4 °C 냉장고에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>튜브에 10 mL의 선별 버퍼를 넣고 철저히 섞은 다음 RT에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기를 넣습니다.</li>
	<li>상판을 흡인하고 80 μL의 선별 버퍼 및 20 μL의 항 PE 마이크로비드에서 펠릿을 재중단시켰다.</li>
	<li>튜브를 소용돌이시키고 4°C에서 15분 동안 배양한다.</li>
	<li>튜브에 10 mL의 버퍼를 추가하여 세포를 세척하고 철저히 혼합 한 다음 RT에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리합니다.</li>
	<li>상월체를 흡인하고 500 μL의 선별 버퍼에서 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>초자기 구가 포함된 열을 자기 구분기호에 넣고 3mL의 정렬 버퍼로 컬럼을 헹구습니다.</li>
	<li>컬럼이 "흐름 정지"가 된 후, 셀 서스펜션의 피펫 500 μL을 컬럼내로 내보낸 다음 정렬 버퍼로 컬럼을 세척한다. 세척을 3x 반복하고 각각 3 mL의 정렬 버퍼(그림 2G)를반복합니다.</li>
	<li>분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 컬렉션 튜브 위에 놓습니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 기둥에 EC 배지 5mL를 추가하고 컬럼 플런저를 사용하여 솔루션을 추진합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 300 x g의 수집 튜브를 원심 분리한 다음 상급을 흡인합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 키트를 사용하여 EEC 및 CEC 샘플의 세포 펠릿에서 RNA를 추출합니다. 최소 500 ng의 RNA를 얻을 수 있다. 참고: RNA 추출 후, 시료는 -80°C에서 보관할 수 있다.</li>
	<li>RNA의 500 ng를 역으로 전사하여 제조사의 지시에 따라 무작위 프라이머와 키트를 사용하여 cDNA를 얻습니다.</li>
	<li>내심 내피 및 내피 집단의 유효성 검사를 위한 정량적 PCR을 수행한다(그림2H). 프라이머 서열은 표 2에나열되어 있습니다.<ol>
<li>384 qPCR 플레이트의 우물에 EEC 또는 CEC cDNA(1 ng/μL)의 5 μL을 넣습니다. 프라이머 의 수 당 세 개의 우물이 있도록 충분한 우물에 EEC 또는 CEC cDNA를 추가합니다.</li>
		<li>6 μL의 2x qPCR SYBR 녹색 완충액을 전진 및 후진 프라이머를 포함한 각 10 μM 프라이머의 0.5 μL과 혼합하고, 각 후보 유전자에 해당하는 단일 웰에 첨가한다.</li>
		<li>RT에서 300 x g에서 1 분 동안 플라스틱 필름과 원심 분리기로 접시를 밀봉하십시오.</li>
		<li>플레이트를 qPCR 기계에 넣고 3분 동안 95°C에서 프로그램을 시작한 다음 15초에 95°C를, 60초에 55°C를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

CECs와 EECs는 기원, 마커 및 기능이 다르므로 개발 및 질병에서 독특한 역할을 할 수 있습니다. 내피 세포 격리를 위한 기존 프로토콜은 거대 혈관 조직으로 제한되며 EEC 의 수집을 무시하고 CEC- 및 EEC 특정 기능에 대한 연구를 제한합니다. 이 지식은 미래 연구를 위한 CECs및 EECs로 iPSCs의 분화를 위한 참조를 제공하고 각종 심장 질병을 위한 잠재적인 치료 표적을 위한 이 세포 인구의 검사를 촉진하기 때문에 이 2개의 인구를 독립적으로 격리하고 공부하는 것이 필수적입니다. 이 새로운 프로토콜은 성인 쥐의 심실 자유 벽의 외부 표면으로부터 내부 표면 및 CECs로부터 EECs를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다.
이 프로토콜에서 각 단계의 타이밍을 매우 정확하게 제어하는 것이 중요합니다. EECs의 수는 쥐 심장 조직에서 매우 제한되어 있기 때문에, 우리는 세포 손상을 방지하기 위해 심장의 내부 층의 소화 시간을 최소화하고 더 중요한 것은, CEC 오염. 효소 반응을 종결하는 EC 배지 용액의 즉각적인 첨가는 또한 높은 세포 생존성을 유지하는 데 매우 중요하다. 적색 펠릿 다음 세포 수집은 RBC 오염의 양에 따라 RBC 오염의 양에 따라 RBC 라딕스를 저하시키기 위해 1-2 mL의 RBC 라딕스 버퍼의 존재를 시사합니다. 현재 프로토콜을 사용하여 6마리의 쥐 하트에서10개의 5EECs를 분리할 수 있었습니다. 이들 세포는 추가적인 팽창 및 특성화를 위해 세포 배양 접시상에 시드될 수 있었다.
자유 벽 수집을 위한 조직을 준비할 때, 심장은 나머지 RBC의 대부분을 제거하기 위하여 HBSS로 세척되었습니다. HBSS는 페놀 적색을 포함하는 DMED와는 대조적으로 혈액 세포의 가시화를 가능하게 하는 그것의 명확한 외관 때문에 추천된 매체입니다. 소화 완충제의 조성은 내피 세포의 충분한 해방을 보장하고, 해방 소화 효소가 노출된 세포의 조직을 제거하는 경우, DNase I는 죽은 세포에서 DNA를 제거하여 DNA의 접착 품질에 의해 억제될 수 있는 세포 분리를 촉진하고, HEPES 버퍼는 pH의 균형을 맞추고, DMEM은 세포 유지를 위해 아미노산과 비타민의 농도가 높은 수정된 기저 배지이며, 더 나은 세포 유지를 위해 필요한 칼슘을 함유하고 있습니다.
인간15 및 마우스 심장10둘다에서 얻어진 단세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)에 따르면, 특정 EC 집단에 기인하는 몇몇 마커가 보고되었다. 우리는 고립 된 EECs (즉, Npr3, Cdh11및 Hapln1)및 EECs (즉, Mgll, Fabp4및 Cd36)의순도를 검사하기 위해 가장 농축 된 유전자 중 일부를 선택했습니다. ββ-액틴, Npr3, Cdh11및 Hapln1 마커에 비해 CECs에 비해 EIC에서 증가된 발현을 입증하였다. 유사하게, Mgll, Fabp4및 Cd36 마커의 발현은 EIC에 비해 CECs에서 더 컸다. 각 샘플에 대해 고유하게 표현된 마커는 각각 EIC 및 CEC에 고유한 마커와 일치하여 성공적인 격리를 나타냅니다.
그러나, 현재 프로토콜은 격리 하는 동안 두 EC 인구 간의 교차 오염을 배제할 수 없다, 심지어 신중 하 게 제어 된 순차 소화. 따라서, 일부 세포 표면 마커는 추가 정제를 위해 적용될 수 있다. 예를 들어 NPR3는 일반적으로 심내막10에레이블을 지정하는 반면 APJ는 CECs16의대부분을 추적할 수 있습니다. 이 2개의 마커는 세포 표면에 표현되기 때문에, 그(것)들은 형광 활성화세포 분류 (FACS) 및 항체를 위해 추가 로 명백한 EC 인구를 정화하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 또한, 인간15 및 마우스10 심장 scRNA-seq는 EIC에서 Npr3의 농축을 확인할 수 있으며, Cd36은 잠재적으로 CEC 정제에 사용될 수 있다.
결론적으로, 제시된 프로토콜은 쥐 심장으로부터 EECs 및 CEC의 독립적인 격리를 간략하게 설명합니다. 셀 격리에 의해 활성화된 셀룰러 특성의 포괄적인 식별은 중요한 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다.

본 문서는 쥐의 심장으로부터 내심 내피 세포(EECs) 및 관상동맥 내피 세포(CECs)의 해부 및 후속 격리에 대한 상세한 프로토콜(Gladka 등에서 수정)을 제공한다.1 이 세포 집단을 독립적으로 조사하는 기능은 잠재적인 치료 표적으로 봉사할 수 있는 심장병의 다양한 근본적인 세포 모형 특정 기계장치의 탐사를 가능하게 할 것입니다. 그러나 이러한 세포 집단의 수집을 위한 성공적인 방법은 아직 출판되지 않았습니다.
CECs는 심장 발달 및 질병,,1,2,2,3,,4,,5,6,7동안 의 기원, 마커 및 기능에 관한 EIC와 다릅니다. EIC는 심장중이도3의복부 표면에서 유래합니다. 그들은 VEGF 및 HIF 신호에 대한 응답으로 Flk1+ 전구 세포에서 발생하고 개발 심장의 세 가지 이산 영역의 가장 안쪽 층을 형성 : 심방, 심실, 부비동3,,6. 유전 계보 추적은 부비동 정맥의 다능성 내분비 세포가 정맥 세포를 유도한다는 것을 시사하며, 이는 상피성 층3을형성하기 위해 이동한다. 이어서, 상피성 층은 말초 심실 자유 벽3,,4를가로 질러 남아 있는 CEC를 포함하여 관상 동맥 및 정맥으로 분화한다. 내피 통로에 이 내피 통로는 VEGFC, ELA/APJ 및 SOX17 신호3,,4,,6,,8,,9에의해 통제됩니다. 심실 심간막은 알 수없는 메커니즘에 의해 심실 중격의 적은 CEC를 유도3. 이어서, EIC와 CECs 사이의 국부화된 분화는 이 두 세포 집단에 특이적인 마커에 의해 제안되며, 여기에는 Mgll, Fabp4, 및 CeCs에서의 Cd36 발현, 또는 ECs3,3,5,,10에서의 Npr3, Cdh11 및 Hapln1 발현을 포함한다.
EIC와 CEC는 심장 기능에서 서로 다른 역할을 합니다. 중간엽 전이, 판막 형성, 챔버 성숙, 유출 관 조절 및 내실 운하 개발에 대한 내분은 EECs6에우발적입니다. 대안적으로, CEC는 관상 동맥의 혈관 운동 톤 및 염증에 기여11. 기능의 이러한 차이는 질병 발달4,,12에서개별화된 역할을 초래한다. 예를 들어, 고장난 EECs가 선천성 판막 질환6,비다짐 심근6,방실 중격 효과6,내분부 섬유 아소증13,hypoplastic 좌심 성 심장 증후군13,심실 형성 부전증 13및 심장 비대12로이어질 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 연구 결과는 이상한 CECs가 관상 동맥 질병14 및 혈전증11에기여한다는 것을 것을을 발견했습니다.
EECs와 CEC의 성공적인 격리는 연구 및 임상 설정 모두에서 이용될 수 있는 이 2개의 세포 집단의 포괄적인 지식을 달성하기 위하여 필요합니다. 이들 세포 집단의 성장 및 분화 인자를 결정하는 것은 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 내피 아류형의 분화를 위한 기준을 제공할 것이다. 또한, EIC 및 CECs의 개발, 조절 및 기능의 차이를 완전히 식별하는 것은 세포 유형별 방식으로 수많은 심장 질환을 담당하는 게놈 및 후성 유전체 인자를 이해하는 데 필수적입니다. 이 문서에서는 EECs 및 CECs의 성공적인 수집을 위한 단계를 독립적으로 간략하게 설명하고, 세포 유형 특정 마커의 유전자 발현 수준을 평가하여 분리의 증거를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

내심 내피 세포 (EECs) 및 관상 동맥 내피 세포 (CECs)는 기원, 발달, 마커 및 기능에서 다르다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 이 2개의 세포 인구는 심장 병에 있는 유일한 역할을 합니다. 고립 된 내피 세포를 관련 시키는 현재 연구 EIC와 CECs의 구성 된 세포 인구를 조사. 이 프로토콜은 세포 특이적 특성화를 위해 이 두 세포 집단을 독립적으로 격리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 왼쪽 및 우심실 자유 벽의 수집에 따라, 외부 표면과 내부 표면에서 내피 세포는 소화 완충액을 사용하여 별도로 해방된다. 외부 표면과 내부 내피 층의 순차적 소화는 두 내피 세포 집단의 분리를 유지했다. EIC와 CEC의 분리된 격리는 각 모집단에 특정한 마커의 식별을 통해 더욱 검증됩니다. 마우스 심장에서 이전에 발표된 단세포 RNA 프로파일링을 기반으로, Npr3, Hapln1,및 Cdh11 유전자 발현은 EIC에 특이적; Fabp4, Mgll및 Cd36 유전자 발현은 CEC에 고유합니다. qPCR 데이터는 그들의 각각 견본에 있는 이 특성 마커의 풍부하게 한 표현을 밝혔습니다, 성공적인 EEC 및 CEC 격리를 나타내는, 세포 표현형의 유지보수, 추가 세포 특정 기능 분석을 가능하게 하.

EEC 및 CEC 격리 과정은 그림 2에설명되어 있습니다. EIC및 CEC의 성공적인 격리는 범내피 세포 마커의 존재뿐만 아니라 두 아류형 집단에 구별되는 것을 평가함으로써 결정되었다. 예측된 바와 같이, qPCR은 ββ-액틴에비해, EECs는 CECs에 비해 내분체 마커 Npr3, Hapln1 및 Cdh11의 상부를 발현하였다(도3A). 마찬가지로, CECs는 EIC에 비해 관상 동맥 마커 Fabp4, Mgll및 Cd36의 높은 수준을 나타냈다(그림 3B). 추가적으로, EEC 와 CECs 둘 다 CEC에 있는 약간 더 높은 수준으로, PAN-EC 마커 유전자 Cdh5를표현했습니다(그림 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> 그림 1 : 심장 해부 다이어그램. (A)우심실 프리 벽을 중격으로부터 분리하기 위해 만든 첫 번째 절단. (B)우심실을 완전히 해방시키기 위해 만든 두 번째 컷. (C)먼저 좌심실 자유벽을 중격으로부터 분리하도록 하였다. (D)좌심실을 완전히 해방시키기 위해 만들어진 두 번째 컷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> 그림 2: CECs 및 EIC의 소화 설정 다이어그램 및 세포 정렬을 위한 다음 배열. (a)가장 안쪽의 무심소실 벽과(B)가장 바깥쪽 심실 자유벽은C소화완충액에 침지하거나(D)각각 소화완충액으로 소화하였다. (e)CD31 항체를 이용한 세포 용액의 수집 및 여과(F)적혈구(RBC) 용해 및(G)자기 활성화 세포 선별(MACS)이 뒤따른다. (h)정제된 ECs를 qPCR을 사용하여 유전자 발현 검증을 위해 처리하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> 그림 3: CECs 및 EECs의 격리를 확인하는 qPcR 데이터입니다. (a)EEC 마커 Npr3, Cdh11및 EIC 및 CEC에서 Hapln1의 유전자 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 정량화하였다. (B)CEC 마커 Mgll, Fabp4및 Cd36의 유전자 발현 수준은 EIC 및 CEC에서 실시간 PCR에 의해 정량화되었다. (C)팬-EC 마커 Cdh5를 실시간 PCR에 의해 EEC 및 CEC에서 정량화하였다. (n = 각 그룹에서 3). 막대는 평균 ± SEM. *p&0.05, **p&lt, 0.01 대 EEC, 페어링되지 않은 t 검정을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">표 1. 소화 버퍼 (1.5ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>스톡 콘.</td>
			<td>최종 콘.</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>리베라아제 TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 소화 버퍼에 대한 레시피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">표 2. 프라이머 시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>유전자 이름</td>
			<td>전달</td>
			<td>역방향</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAATATTGTGGCCTA</td>
			<td>가타CTCCCGCTCTCtCtC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGACTGGGG그</td>
			<td>GTATTTTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>하플1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCAGCTTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll (주)</td>
			<td>CCCGGCCCAAAGAC</td>
			<td>가가트그그트그그그그그</td>
		</tr>
<tr>
<td>팹4</td>
			<td>아가그그그그게트트트트CG</td>
			<td>ACTCTCTGACC가트가그카</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAACGGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTTTTTTTTTTTTTTTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGCCGAC</td>
			<td>TGTGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-액틴</td>
			<td>TCTGTGTGT가트그그그</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 프라이머 시퀀스

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Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

우리는 소화 완충제에서 순차적 조직 소화를 통해 쥐 심혼에서 내심 과 관상 관상 내피 세포의 격리를 위한 프로토콜을 제시하고, 재발하는 원심분리기 주기에서 세포 수집 및 반대로 쥐 CD31 마이크로비드를 사용하여 세포 정화.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

여기서, 우리는 사람들이 세포 모형 특정 유전자 발현 및 기능을 이해하는 것을 돕기 위하여 심근 세포 및 관상 동맥 내피 세포를 심혼에서 별도로 격리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 고립 된 EEC 및 CEC의 높은 순도 및 생존력과 세포가 격리 시 생리적 특성을 유지한다는 것입니다. CEC와 EEC는 많은 양상에서 다르므로 이러한 세포 집단을 독립적으로 조사하는 능력은 다양한 심장 질환에서 세포 유형 별 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.이 방법은 세포 모형 특정 방식으로 수많은 심장 질병을 책임지는 전사성 및 후성 유전학 요인의 연구를 촉진할 수 있었습니다. 이 방법의 가장 까다로운 부분은 세포 유형 오염을 피하기 위해 다른 심장 부분을 결정하고 소화타이밍을 올바르게 타이밍을 조정하는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 과학자 인 Yifei Miao가 될 것입니다.650에서 100 그램 Sprague Dawley 쥐에서 심장을 수확 한 후, 여분의 혈액을 제거하고 해부 현미경 아래에 하나의 심장을 배치하기 위해 차가운 HBSS의 50 밀리리터로 장기를 세 번 세척합니다. 심장을 평평한 후방 얼굴에 배치하여 조직의 왼쪽과 오른쪽면을 식별하고 폐 동맥을 찾습니다. 가위를 사용하여 폐 동맥을 오른쪽 심실 챔버로 자르고 정점에 도달 할 때까지 중격을 따라 자른다.폐 동맥과 오른쪽 심실 챔버의 접합이 도달 할 때까지 중격을 따라 심장의 후방 측까지 정점에서 절단을 계속합니다. 이 시점부터 심장의 전방 및 후방 측면을 이전 해부 지점에 수직으로 자르고 중격에서 떨어져 오른쪽 심실 자유 벽이 심장의 나머지 부분에서 해방될 때까지 잘라냅니다. 그런 다음 오른쪽 심실 프리 월을 DMEM의 5 밀리리터 튜브에 넣고 대동맥을 다시 찾아 서 방금 입증된 것과 동일한 방식으로 왼쪽 심실 프리 월의 수집을 용이하게합니다.심실 이없는 벽이 모두 수집되면 조직 샘플을 60센티미터 문화 요리로 옮기고 내부 표면이 접시에 엎드린 채로 놓습니다. 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 조직의 내부 표면만 침지 될 때까지 조직 조각 바로 아래 접시에 0.5 ~ 1 밀리리터의 소화 버퍼를 넣습니다. 원치 않는 세포 오염을 피하기 위해 심실의 내부 표면만 소화 버퍼에 침지되어 정확히 5 분 동안 소화되는 것이 중요합니다.세포 배양인배기에서 5분 후, 내피세포 배지의 5배의 부피로 소화를 중단한다. 그런 다음 1밀리리터 파이펫을 사용하여 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 유출을 얼음 위에 50 밀리리터 수집 튜브로 옮기는 신선한 매체로 각 심실의 내부 표면을 플러시합니다. 관상 동맥 내피 세포 소화의 경우, 내부 층에서 오염없이 왼쪽 심실의 외부 표면을 따라 잘라 소화 버퍼 1 밀리리터를 포함하는 별도의 5 밀리리터 튜브에 각 튜브 조각을 배치합니다.EEC의 오염을 방지하려면 심실의 외부 표면에서만 절단하는 것이 중요합니다. 해부 가위를 사용하여 심실 벽을 작은 1 입방 밀리미터 조각으로 다진 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 2~3분마다 소용돌이를 가꾸어 15~20분 동안 튜브를 배치합니다. 다진 조각이 작지만 눈에 띄는 경우 내피 세포 배지 4 밀리리터를 튜브에 추가하고 5 밀리리터 세로지피펫을 사용하여 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 용액 의 전체 볼륨을 얼음의 50 밀리리터 수집 튜브로 전송합니다.소화 후 CD31 양성 세포 집단을 분리하려면 세포를 원심분리에 의해 펠릿을 흡입하고 슈퍼나티를 흡인시합니다. 어떤 펠릿이 적색인 경우에, 37섭씨 수조에 있는 5 분 잠복에 대한 관 당 적혈구 용해 완충제의 1- 2 밀리리터에 있는 세포를 재중단합니다. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 10 밀리리터와 용액을 중지하고 두 번째 원심 분리와 세포를 수집.다음으로, 선별 완충제 90 마이크로리터와 각 세포 튜브에 항 CD31 PE 항체10 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이 후, 4섭씨에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 철저한 혼합과 튜브에 정렬 버퍼의 10 밀리리터를 추가하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.튜브 당 정렬 버퍼의 80 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단, 안티 PE 마이크로 비드의 20 마이크로 리터의 추가 다음. 소용돌이 후, 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 놓고, 10밀리리터의 선별 완충제에서 단지 입증된 대로 세척합니다. 얼음에 버퍼를 분류하는 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 슈퍼 파라자성 구가 들어 있는 컬럼을 자기 분리기로 놓습니다.정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 헹구는 다. 컬럼이 비워지면 내막 내피 세포 서스펜션 500마이크로리터를 컬럼에 넣고 세척당 3밀리리터의 정렬 버퍼로 4개의 세척을 넣습니다. 마지막 세척 후, 새로운 15 밀리리터 수집 튜브로 컬럼을 전송하고 수집 튜브로 CD31 양성 세포를 플러시하기 위해 신선한 내피 세포 매체의 컬럼 플런서와 5 밀리리터를 사용합니다.그런 다음 원심분리에 의해 비드 분리된 내피 세포를 수집한다. 예측된 바와 같이, 정량적 PCR은 관상 동맥 내피 세포에 비해 내막 마커 Npr3, Hapln1 및 Cdn11의 높은 수준을 발현하는 베타 액틴, 내피 성 내피 세포에 비해 있음을 밝힙니다. 마찬가지로, 관상 동맥 내피 세포는 내피 내피 세포에 비해 관상 동맥 마커 Fabp4, Mgll 및 Cd36의 상부를 발현하였다.추가적으로, 세포의 두 모형은 관상 동맥 내피 세포에서 관찰된 약간 더 높은 수준으로 범내피 세포 마커 유전자 Cdh5를 발현했습니다. 우리는 세포 집단에 특정한 FACS 및 항체를 사용하여 세포를 더 정화할 수 있습니다. 예를 들어 Npr3 반대를 사용하여 EEC 및 안티 Cd36을 정렬하여 CE를 정렬할 수 있습니다.이 기술은 연구원이 세포 모형 특정 방식으로 심장 발달 및 질병에 있는 EEC와 CECs의 역할을 탐구하는 도로를 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...