Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Авторы высоко ценят доктора Лингли Ванг за ее помощь в составлении протокола о животных и кафедру педиатрии в Стэнфорде за поддержку инфраструктуры. Эта работа была поддержана NIH/NHLBI K99 HL135258 (до M.G.).

Все процедуры для животных были одобрены Административной группой по уходу за лабораторными животными (APLAC31608) Стэнфордского университета.
1. Подготовка буферов
<ol><li>Подготовьте буфер пищеварения с помощью реагентов, перечисленных в таблице 1.<ol>
<li>Подготовка DNase I фондовых решение: Растворите DNase I в RNase воды для фондового решения 2000 единиц / мл (1 мг /мл). Aliquot и хранить складе раствора при -20 градусах Цельсия.</li>
		<li>Подготовка раствора liberase: Растворите liberase с rNase-свободной водой для разрешения штока 5 мг/мл. Поверните его на роликовой банке при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Aliquot и храните складраствор при -20 градусов по Цельсию.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте сортировочный буфер путем разбавления 0,5 М этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА) и 10% раствора сыворотки сыворотки крупного рогатого скота (BSA) с 1x фосфатным буферным сольниковым раствором (PBS) для конечной концентрации 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA.</li>
</ol>2. Коллекция сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть крыс Sprague Dawley весом 50-100 г были использованы в этом протоколе. Не наблюдалось никаких гендерных различий.
<ol><li>Эвтанизировать крысу с CO2 и поместить ее в положение на спине на рассекающей платформе. Прикрепите конечности вниз и стерилизовать живот и грудь с 70% этанола.</li>
	<li>Откройте живот ножницами и вставьте 21 G иглу в часть задней полы вены, расположенной за кишечником. Потяните шприц поршень обратно, снятие крови из вены, пока печень появляется светлее в цвете и не больше крови могут быть сняты, что свидетельствует о достаточном удалении крови.</li>
	<li>Используя ножницы, откройте грудь тщательно, чтобы избежать повреждения легких и сердца. Поднимите арку аорты / атриум с щипками и сократить аорты, легочной артерии, легочных вен, и вены полы освободить и удалить сердце.</li>
	<li>Вымойте сердце с 50 мл холодного 1x Хэнкс 'сбалансированный солевой раствор (HBSS) буфер 3x, чтобы удалить чрезмерную кровь.</li>
	<li>Под микроскопом микродиссекции, удалить правый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM)(Рисунок 1A,B).<ol>
<li>Положите сердце на его льстить, заднее лицо, чтобы определить левую и правую сторону.</li>
		<li>Найдите легочную артерию, самую переднюю вену и артерии, разветвляющиеся с верхней части сердца, и прорежьте легочную артерию до правой желудочковой камеры. На передней стороне сердца, вырезать вдоль перегородки до достижения вершины. Продолжить резки с вершины до задней стороне сердца вдоль перегородки до легочной артерии и правой желудочковой камеры точки соединения(рисунок 1A).</li>
		<li>Начиная с легочной артерии и правой точки соединения желудочка, вырезать как переднюю и заднюю сторону сердца перпендикулярно к предыдущему вскрытию и от перегородки, пока правая стенка желудочков освобождается от остальной части сердца (Рисунок 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Под микроскопом микродиссекции, удалить левый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей DMEM(Рисунок 1C,D).<ol>
<li>Найдите аорту, ветвящийся от верхней части сердца за легочной артерией, и повторите метод, описанный в шаге 2.5, чтобы отрезать левую стенку желудочка.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Пищеварение ЕЭК
<ol><li>Поместите как правый, так и левый желудочковые свободные стены ткани в 60 см культуры блюдо с внутренней поверхностью лежал плоский, лицом вниз(Рисунок 2). ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя поверхность является внутренней поверхностью слегка вогнутой формы желудочка, как показано на рисунке 2A,C.</li>
	<li>Добавьте в блюдо 0,5-1 мл буфера пищеварения, поместив кончик пипетки прямо под ткань. Продолжайте, пока не будет погружена только внутренняя поверхность.</li>
	<li>Инкубировать блюдо в 5% CO2,37 КС инкубатор в течение 5 мин.</li>
	<li>Добавить EC среде в культуре блюдо, чтобы остановить пищеварение. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите количество буфера пищеварения к среде EC как коэффициент 1:5.</li>
	<li>Используйте 1 мл пипетки, чтобы промыть внутреннюю поверхность желудочков с помощью EC среды и перенести стока в трубку сбора 50 мл через 40 мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.</li>
</ol>4. Пищеварение ЦИК
<ol><li>Вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя(рисунок 2B,D) и поместите каждый в отдельной трубке 5 мл, содержащей 1 мл буфера пищеварения. ПРИМЕЧАНИЕ: Левый желудочек можно определить как более толстый желудочек, а внешняя поверхность может быть определена как внешняя грань слегка вогнутого желудочка.</li>
	<li>Используя рассечение ножницами, фарш стенки желудочка в малых, 1 мм3 штук.</li>
	<li>Инкубировать трубку в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 мин. Вортекс каждые 2-3 мин.</li>
	<li>Пипетка 4 мл EC среды в 5 мл трубки для прекращения пищеварения.</li>
	<li>Перенесите раствор с серологическим пипеткой 5 мл в трубку 50 мл через 40-мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.</li>
</ol>5. Коллекция клеток
<ol><li>Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем аспирации супернатанта.</li>
	<li>Если гранулы появляются красными, resuspend гранулы в 1-2 мл 1x красных кровяных телец (РБК) lysing буфера(рисунок 2F). ПРИМЕЧАНИЕ: Если НЕТ РБК, перейдите к шагу 6.</li>
	<li>Инкубировать трубки в водяной бане 37 градусов в течение 5 мин.</li>
	<li>Пипетка 10 мл PBS в 50 мл труб, чтобы остановить лиза.</li>
	<li>Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.</li>
</ol>6. Сортировка ЕС
<ol><li>Добавьте 90 кЛ сортирующего буфера и 10 зл анти-CD31 PE антитела в 50 мл труб.</li>
	<li>Vortex трубки, а затем инкубировать их в течение 10 минут в холодильнике 4 кс.</li>
	<li>Добавьте 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешайте, а затем центрифугу при 300 х г в течение 10 минут на RT.</li>
	<li>Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 80 злител сортировожного буфера и 20 Зл анти-PE микробусов.</li>
	<li>Вихрь трубки и инкубировать при 4 кв КС в течение 15 мин.</li>
	<li>Вымойте клетки, добавив 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешать, а затем центрифуги их на 300 х г в течение 10 минут на RT.</li>
	<li>Призадыхать супернатант и resuspend гранулы в 500 л сортировки буфера.</li>
	<li>Поместите столбец, содержащий суперпарамагнитные сферы, в магнитный сепаратор и промыть столбец 3 мл сортирующего буфера.</li>
	<li>После того, как колонна "остановка потока", пипетка 500 л ячеек подвески в колонны, а затем мыть колонны с сортировочным буфером. Повторите мыть 3x, каждый с 3 мл сортировки буфера(рисунок 2G).</li>
	<li>Снимите столбцы с сепаратора и поместите их поверх новой трубки коллекции 15 мл.</li>
	<li>С помощью пипетки добавьте 5 мл среды EC к столбику и продвиайте решение с помощью колонны.</li>
	<li>Centrifuge коллекции труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.</li>
	<li>Извлеките РНК из клеточных гранул образцов ЕЭК и ЦИК с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя. Минимум 500 нг РНК могут быть получены. ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения РНК образец может храниться при -80 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Обратный транскриб 500 нг РНК, чтобы получить cDNA с помощью случайного грунтовки и комплект, следуя инструкциям производителя.</li>
	<li>Выполните количественные ПЦР для проверки эндокардиальных и эндотелиальных популяций(рисунок 2H). Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2.<ol>
<li>Добавьте 5 кДНК ЕЭК или CEC (1 нг/Л) в скважины пластины 384 qPCR. Добавьте кДНК ЕЭК или ЦИК в достаточное количество скважин, чтобы было три скважины на количество грунтовок.</li>
		<li>Смешайте 6 qL 2x qPCR SYBR зеленый буфер с 0,5 л из каждого 10 км грунтовки, в том числе как вперед, так и обратной грунтовки, и добавить их в один хорошо соответствующие каждому кандидату гена.</li>
		<li>Запечатать пластину с пластиковой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 300 х г на RT.</li>
		<li>Поместите пластину в машину qPCR, а затем запустите программу при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин, затем 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 55 градусов по Цельсию в течение 60 с. Повторите последующие два шага в течение 45 циклов.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

ЦЦО и ЕЭК различаются по происхождению, маркерам и функциям и, таким образом, могут играть уникальную роль в развитии и заболеваниях. Существующие протоколы эндотелиальной изоляции клеток ограничиваются макрососудистыми тканями, пренебрегая сбором ЕЭК, тем самым ограничивая изучение функций ЦИК и ЕЭК. Важно, чтобы изолировать и изучить эти две популяции самостоятельно, так как эти знания будут служить ссылкой на дифференциацию iPSCs в CECs и EECs для будущих исследований и облегчить изучение этих популяций клеток для потенциальных терапевтических целей для различных сердечных заболеваний. Этот новый протокол излагает метод изоляции EECs от внутренней поверхности и CECs от внешней поверхности желудочковой свободной стенки взрослых крыс.
В этом протоколе крайне важно очень точно контролировать время каждого шага. Поскольку количество EECs очень ограничено в ткани сердца крысы, мы свели к минимуму время пищеварения внутреннего слоя сердца, чтобы предотвратить повреждение клеток и, что более важно, загрязнение ЦИК. Немедленное добавление среднего решения ЕС для прекращения ферментатической реакции также очень важно для поддержания высокой жизнеспособности клеток. Красный гранулы, следующие за сбором клеток, предполагают наличие большого количества РБК. В зависимости от количества загрязнения РБК, для деградации РБК можно добавить 1-2 мл буфера лисиса РБК. Используя текущий протокол, мы смогли изолировать 105 EECs от шести крысиных сердец. Эти клетки могут быть посеяны на блюдо клеточной культуры для дальнейшего расширения и характеристики.
При подготовке ткани для свободного сбора стены, сердце было промыто HBSS, чтобы удалить большинство оставшихся RBCs. HBSS является рекомендуемой среде из-за его четкого внешнего вида, что позволяет визуализации клеток крови, в отличие от DMED содержащие фенол красный. Состав буфера пищеварения обеспечивает достаточное освобождение эндотелиальных клеток, где фермент пищеварения liberase полоски ткани подвергаются клетки, DNase I удаляет ДНК из мертвых клеток для содействия отслоение клеток, которые могут быть ингибированы клеевого качества ДНК, HEPES буфер балансирует рН, и DMEM является модифицированной базальной среды с более высокой концентрацией аминокислот и витаминов для лучшего поддержания клеток и содержит необходимые для активации кальция.
Согласно одноклеточному секвенированию РНК (scRNA-seq), полученному как от человека15, так и от сердца мыши10,было сообщено несколько маркеров, приписываемых конкретным популяциям ЕС. Мы выбрали некоторые из наиболее обогащенных генов для изучения чистоты изолированных EECs (т.е., Npr3, Cdh11, и Hapln1) и EECs (т.е., Mgll, Fabp4, и Cd36). По сравнению с маркерами q-Actin, Npr3, Cdh11и Hapln1 продемонстрировали повышенное экспрессию в EECs по сравнению с ЦИКами. Аналогичным образом, выражение Mgll, Fabp4, и Cd36 маркеров было больше в ЦСПо по сравнению с EECs. Однозначно выраженные маркеры для каждого образца соответствуют маркерам, характерным для EECs и CECs соответственно, что свидетельствует об успешной изоляции.
Однако нынешний протокол не может исключить перекрестное загрязнение между двумя популяциями ЕС во время изоляции, даже при тщательно контролируемом последовательном пищеварении. Таким образом, некоторые маркеры поверхности клеток могут быть применены для дальнейшей очистки. Например, NPR3 обычно маркируетэндокардий 10,в то время как APJ может проследить большинство CECs16. Поскольку эти два маркера выражены на поверхности клетки, они могут быть использованы для флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), а также антитела, используемые для дальнейшей очистки различных популяций EC. Кроме того, человек15 и мышь10 сердце scRNA-seq может подтвердить обогащение Npr3 в EECs, и Cd36 потенциально может быть использован для очистки ЦИК.
В заключение, представленный протокол излагает независимую изоляцию EECs и CECs от крысиного сердца. Всесторонняя идентификация клеточных свойств, включенных путем изоляции клеток, может быть использована для значительных приложений вниз по течению.

В этой статье содержится подробный протокол (измененный из Gladka et al.1) для вскрытия и последующей изоляции эндокардиальных эндотелиальных клеток (EECs) и коронарных эндотелиальных клеток (CECs) от крысиных сердец. Способность исследовать эти популяции клеток независимо позволило бы исследовать механизмы типа клеток, лежащие в основе различных сердечных заболеваний, которые могли бы служить в качестве потенциальных терапевтических целей. Однако успешный метод самостоятельного сбора популяций этих клеток еще не опубликован.
ЦЭЦ отличаются от EECs в отношении их происхождения, маркеров и функций во время развития сердца и болезни11,22,3,4,,5,,6,7. EECs вытекают из брюшной поверхности сердечного мезодерма3. Они возникают из клеток-прародителей Flk1в ответ на сигнализацию VEGF и HIF и образуют внутренний слой трех дискретных областей развивающегося сердца: предсердий, желудочка и синусового вена3,6. Отслеживание генетической линии предполагает, что плюрипотентные эндокардиальные клетки синусовой веносвых венозных клеток, которые мигрируют в форме субэпикардиального слоя3. Впоследствии субэпикардиальный слой дифференцируется в коронарных артериях и венах, в том числе CECs, которые остаются через периферийные стенки желудочков3,4. Этот эндокардиальный эндотелиальный путь регулируется VEGFC, ELA/APJ и SOX17 сигнализации3,4,,6,,8,9. Желудочковый эндокардий получает меньше ЦЭк межжелудочковой перегородки неизвестным механизмом3. Впоследствии локализованная дифференциация между EECs и CECs предлагается маркерами, специфичными для этих двух популяций клеток, включая Mgll, Fabp4 и выражение Cd36 в ЦЭК, или Npr3, Cdh11 и Hapln1 выражение в EECs3,5,10.
EECs и CECs играют различные роли в сердечной функции. Эндокардиальный к мезенхимальному переходу, формированию клапанов, периоду камерного созревания, регулированию оттока тракта и развитию атриовентрикулярного канала зависит от EECs6. Кроме того, ЦЭК способствуют вазомоторному тону и воспалению коронарных артерий11. Эти отклонения в функции приводят к индивидуальной роли в развитии болезни4,12. Например, данные свидетельствуют о том, что неисправность EECs может привести к врожденному заболеванию клапана6, безумство миокарда6, атриовентрикулярной секторной перегородки эффект6, эндокардиальный фиброэластоз13, гипопластический синдром левого сердца13, желудочковой гипоплазии13, и сердечной гипертрофии12. Аналогичным образом, исследования показали, что ненормальные CECs способствовать ишемической болезни сердца14 и тромбоз11.
Успешная изоляция EECs и CECs необходима для достижения всеобъемлющих знаний об этих двух популяциях клеток, которые могут быть использованы как в исследованиях, так и в клинических условиях. Определение факторов роста и дифференциации этих популяций клеток даст рекомендацию для дифференциации эндотелиальных подтипов от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Кроме того, полная идентификация отклонений в развитии, регулировании и функции EECs и CECs имеет жизненно важное значение для понимания геномных и эпигеномных факторов, ответственных за многочисленные заболевания сердца в клеточном типе-специфическим образом. В этой статье излагаются шаги для успешного сбора EECs и CECs независимо, и предоставляет доказательства разделения путем оценки уровня экспрессии генов клеточных типконкретных маркеров.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

Было показано, что эндокардиальные эндотелиальные клетки (EECs) и коронарные эндотелиальные клетки (CECs) различаются по происхождению, развитию, маркерам и функциям. Следовательно, эти две популяции клеток играют уникальную роль в сердечных заболеваниях. Текущие исследования с участием изолированных эндотелиальных клеток исследуют популяции клеток, состоящие как из EECs, так и из ЦЭк. В этом протоколе излагается метод независимой изоляции этих двух популяций клеток для характеристик и конкретных клеток. После сбора левой и правой стенки желудочка, эндотелиальные клетки с внешней поверхности и внутренней поверхности отдельно освобождаются с помощью раствора буфера пищеварения. Последовательное пищеварение внешней поверхности и внутреннего эндокардиального слоя сохранило разделение двух эндотелиальных популяций клеток. Отдельная изоляция ЕЭК и ЦЭК проверяется еще раз путем выявления маркеров, характерных для каждой популяции. На основе ранее опубликованных одноклеточных РНК профилирования в сердце мыши, Npr3, Hapln1, и Cdh11 экспрессия генов является уникальным для EECs; в то время как экспрессия генов Fabp4, Mgllи Cd36 уникальна для ЦС. Данные qPCR выявили обогащенное выражение этих характерных маркеров в соответствующих образцах, что свидетельствует об успешной изоляции ЕЭК и ЦИК, а также поддержании клеточного фенотипа, что позволяет проводить дальнейший клеточный функциональный анализ.

Процесс изоляции ЕЭК и ЦИК описан на рисунке 2. Успешная изоляция ЕЭК и ЦЭК была определена путем оценки наличия панэндотелиальных маркеров клеток, а также маркеров, отличающихся от двух популяций подтипов. Как и предсказывалось, qPCR показал, что по отношению к β-актин, EECs выразил более высокие уровни эндокардиальных маркеров Npr3, Hapln1, и Cdh11 по сравнению с ЦЭк (Рисунок 3A). Аналогичным образом, CECs выразили более высокие уровни коронарных маркеров Fabp4, Mgll, и Cd36 по сравнению с EECs(рисунок 3B). Кроме того, как EECs и CECs выразил пан-EC маркер гена Cdh5, с несколько более высоким уровнем в ЦИК(рисунок 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Рисунок 1: Диаграмма вскрытия сердца. ()Первый разрез сделал, чтобы отделить правый желудочек свободной стенки от перегородки. (B) Второй разрез сделал, чтобы освободить правый желудочек полностью. (C) Первый разрез сделал, чтобы отделить левый желудочек свободной стенки от перегородки. (D) Второй разрез сделал, чтобы освободить левый желудочек полностью. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Рисунок 2: Диаграмма настройки пищеварения ЦЭК и EECs и следующий механизм для сортировки клеток. (A) Внутренняя бесплатная желудочковая стенка и (B) внешние желудочковой свободной стенки были (C) погружен в пищеварительной буфер или (D) переваривается в пищеварительном буфере соответственно. (E) Сбор и фильтрация клеточных растворов с последующим (F) красная кровяная клетка (РБК) лиза и (G) магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) с использованием антитела CD31. (h)Очищенные ECs были обработаны для проверки экспрессии генов с помощью qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Рисунок 3: данные qPCR, подтверждающие изоляцию ЦЭК и EECs. (A) Уровни экспрессии генов маркеров EEC Npr3, Cdh11и Hapln1 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (B) Уровни экспрессии генов маркеров ЦИК Mgll, Fabp4, и Cd36 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (C) маркер Cdh5 по пан-EC был количественно оценен в EECs и CECs в режиме реального времени PCR. (n No 3 в каждой группе). Бары представляют собой среднее для СЭМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Таблица 1. Пищеварительный буфер (1,5 мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Фондовый Con.</td>
			<td>Заключительный Con.</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Либерасе ТМ</td>
			<td>5 мг/мл</td>
			<td>0,5 мг/мл</td>
			<td>150 ул</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 мг/мл</td>
			<td>20 мкг/мл</td>
			<td>30 уль</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 мМ</td>
			<td>15 уль</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ул</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Рецепт буфера пищеварения.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Таблица 2. Праймер Последовательности</td>
		</tr>
<tr>
<td>Имя гена</td>
			<td>Вперед</td>
			<td>Обратный</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTGCAAATCATGTGGGGTTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCAGCTCTCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>ГТГААТГККККККТКГГКТГГГ</td>
			<td>GTAATTCTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTCAGCTGGTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мглл</td>
			<td>CCCGGGGCAAAGAC</td>
			<td>ГААГАГАГКЦкТГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGGTGGCTTCG</td>
			<td>АКТКТГАККГАГАГАГАГАГАГАГАГА</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAACGACTGCGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTCtCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>ККАТТАГАГАКАКАККККККККККККККККККККККККККК</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGTTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-актин</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATTACTTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Праймер Последовательности

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Мы представляем протокол для изоляции эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от крысиных сердец через последовательное пищеварение ткани в буфере пищеварения, сбор клеток от периодических циклов центрифуги, и очистка клеток с использованием анти-крысы CD31 микробусы.

Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции эндокардных клеток и коронарных эндотелиальных клеток отдельно от сердца, чтобы помочь людям понять экспрессию и функцию генов типа клетки. Основными преимуществами этого метода являются высокая чистота и жизнеспособность изолированных ЕЭК и ЭКВ и то, что клетки сохраняют свои физиологические свойства при изоляции. CECs и EECs отличают в много аспектов, поэтому способность независимо исследовать эти населенности клетки позволяет исследовать тип-специфические механизмы клетки в различных заболеваниях сердца.Этот метод может облегчить изучение транскриптономических и эпигенетических факторов, ответственных за многочисленные болезни сердца в клеточном типе конкретных образом. Самые сложные части этого метода определяют различные части сердца и сроки пищеварения правильно, чтобы избежать загрязнения типа клетки. Демонстрацией процедуры будет Ифэй Мяо, научный сотрудник из моей лаборатории.После сбора сердца от шести 50 до 100 грамм Sprague Dawley крыс, мыть органы с 50 миллилитров холодного HBSS три раза, чтобы удалить излишки крови и поместить одно сердце под рассечение микроскопа. Распоистите сердце на его более плоском заднем лице, чтобы определить левую и правую стороны ткани и найти легочную артерию. Используйте ножницы, чтобы прорезать легочную артерию до правой желудочковой камеры и вырезать вдоль перегородки, пока вершина не будет достигнута.Продолжить резки от вершины до задней стороны сердца вдоль перегородки, пока соединение легочной артерии и правой желудочковой камеры не будет достигнута. Начиная с этой точки, вырезать как передней и задней стороны сердца перпендикулярно предыдущей точки вскрытия и от перегородки, пока правой желудочковой свободной стенки освобождается от остальной части сердца. Затем поместите право желудочковой свободной стены в пять миллилитров трубки DMEM и найти аорты снова для облегчения сбора левого желудочка свободной стенки таким же образом, как только что продемонстрировали.Когда все желудочков свободные стены были собраны, передать образцы тканей в 60 сантиметров культуры блюдо с их внутренней поверхности лежал лицом вниз в блюдо. Используя один миллилитровый наконечник пипетки, добавьте 0,5-1 миллилитр буфера пищеварения к блюду прямо под кусочками ткани, пока не будут погружены только внутренние поверхности тканей. Чтобы избежать нежелательного загрязнения клеток, важно, чтобы только внутренняя поверхность желудочка была погружена в буфер пищеварения и переваривалась ровно пять минут.После пяти минут в инкубаторе клеточной культуры, остановить пищеварение с пяти раз объем эндотелиальной клеточной среды. Затем используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы промыть внутреннюю поверхность каждого желудочка со свежей средой, передавая сток через 40-метровый ситечко в 50-миллилитровую трубку сбора на льду. Для пищеварения коронарных эндотелиальных клеток, вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя и поместить каждый фрагмент трубки в отдельной пятими миллилитрной трубки, содержащей один миллилитр буфера пищеварения.Чтобы избежать загрязнения от ЭИК, важно только вырезать из внешней поверхности желудочка. Используя ножницы для вскрытия, измельчите желудочковой стенки на мелкие кусочки одного кубического миллиметра и поместите трубки в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 минут с вихрем каждые две-три минуты. Когда рубленые кусочки небольшие, но видимые, добавьте четыре миллилитров эндотелиальной клеточной среды в трубку и используйте пятими миллилитровую серологическую пипетку, чтобы передать весь объем раствора через 40-метровый ситечко в 50-миллилитровую трубку для сбора на льду.Чтобы изолировать положительные популяции клеток CD31 после их пищеварения, гранулировать клетки центрифугой и аспирировать супернатанты. Если какие-либо гранулы красные, повторного анализа клеток в один-два миллилитров красных кровяных телец лиза буфера на трубку в течение пяти минут инкубации в 37 градусов по Цельсию водяной бане. В конце инкубации остановите лиз с 10 миллилитров PBS и соберите клетки со второй центрифугации.Далее добавьте 90 микролитров буфера сортировки и 10 микролитров антител anti-CD31 PE к каждой трубке клеток. После вихря, инкубировать клетки в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации добавьте 10 миллилитров буфера сортировки в трубки с тщательным смешиванием и соберите клетки путем центрифугации.Повторное добавление гранул в 80 микролитров буфера сортировки на трубку, а затем добавление 20 микролитров анти-PE микробусов. После вихря, поместите трубки на четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут, а затем мыть в 10 миллилитров сортировки буфера центрифугации, как только что продемонстрировали. Повторное выделение гранул в 500 микролитров сортирования буфера на льду и место столбец, содержащий супер парамагнитных сфер в магнитный сепаратор.Промыть столбец тремя миллилитров буфера сортировки. Когда столбец опустеет, добавьте 500 микролитров эндокардиальной эндотелиальной клеточной подвески к столбец, а затем четыре моет с тремя миллилитров сортировки буфера на стирку. После последней стирки перенесите колонку в новую трубку сбора 15 миллилитров и используйте колонку поршень и пять миллилитров свежей эндотелиальной среды клеток, чтобы промыть CD31 положительные клетки из колонки в трубку сбора.Затем соберите бисер изолированных эндотелиальных клеток центрифугации. Как и предсказывалось, количественный ПЦР показывает, что по отношению к бета актину эндокардиальные эндотелиальные клетки выразили более высокие уровни маркеров эндокарда Npr3, Hapln1 и Cdn11 по сравнению с коронарными эндотелиальными клетками. Аналогичным образом, коронарные эндотелиальные клетки выражают более высокие уровни коронарных маркеров Fabp4, Mgll и Cd36 по сравнению с эндоцелеальными клетками эндоцелевых эндотелий эндокелея.Кроме того, оба типа клеток выразили пан-эндотелиальный клеточный маркер гена Cdh5 с несколько более высокими уровнями, наблюдаемыми в коронарных эндотелиальных клетках. Мы можем еще больше очистить клетки с помощью FACS и антител, характерных для популяций клеток. Например, мы можем использовать anti-Npr3 для сортировки ЭЭЗ и анти-Cd36 для сортировки ЭКГ.Этот метод проложил путь для исследователей, чтобы изучить роль ЕЭК и CECs в развитии сердца и болезней в клеточном типе конкретных образом.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Выделение и криоконсервация новорожденной крысы кардиомиоцитов

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Выделение и характеристика спутниковых клеток от Крыса Глава Branchiomeric мышц

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Выделение и характеристика основных крыса клапан интерстициальных клеток: Новая модель для изучения кальцификации клапана аорты

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...