Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Los autores aprecian enormemente a la Dra. Lingli Wang por su ayuda con el protocolo animal, y el Departamento de Pediatría de Stanford por el apoyo a la infraestructura. Este trabajo fue apoyado por NIH/NHLBI K99 HL135258 (a M.G.).

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC31608) en la Universidad de Stanford.
1. Preparación de tampones
<ol><li>Prepare el tampón de digestión utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1.<ol>
<li>Preparar la solución de stock DNase I: Disolver DNase I en agua libre de RNase para una solución de stock de 2.000 unidades/ml (1 mg/ml). Aliquot y almacenar la solución de stock a -20 oC.</li>
		<li>Preparar la solución liberadora: Disolver libera con agua libre de RNase para una solución en stock de 5 mg/ml. Gire en una caja de rodillos a 4 oC durante 30 minutos aliquot y almacene la solución de stock a -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el tampón de clasificación diluyendo 0,5 M de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 10% de albúmina sérica bovina (BSA) con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS) para una concentración final de 2 mM de EDTA y 0,5% de BSA.</li>
</ol>2. Colección de corazones
NOTA: En este protocolo se utilizaron seis ratas Sprague Dawley que pesaban entre 50 y 100 g. No se observó ninguna diferencia de género.
<ol><li>Eutanasia la rata con CO2 y colóquela en posición supina sobre una plataforma de diseción. Anclar las extremidades hacia abajo y esterilizar tanto el abdomen como el pecho con 70% de etanol.</li>
	<li>Abra el abdomen con tijeras e inserte una aguja de 21 G en la porción de la vena cava posterior situada detrás de los intestinos. Tire del émbolo de la jeringa hacia atrás, retirando la sangre de la vena hasta que el hígado parezca más claro de color y no se pueda extraer más sangre, lo que indica suficiente extracción de sangre.</li>
	<li>Con tijeras, abra el pecho cuidadosamente para evitar dañar el pulmón y el corazón. Levante el arco/aurícula de la aorta con los fórceps y corte la aorta, la arteria pulmonar, las venas pulmonares y la vena cava para liberar y extraer el corazón.</li>
	<li>Lavar el corazón con 50 ml de tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de 50 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 3 veces para eliminar el exceso de sangre.</li>
	<li>Bajo un microscopio de microdisección, retire la pared libre ventricular derecha en un tubo de 5 ml que contenga el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco(Figura 1A,B).<ol>
<li>Poner el corazón en su cara más plana, posterior para identificar el lado izquierdo y derecho.</li>
		<li>Localice la arteria pulmonar, la más anterior de las venas y arterias que se ramifican desde la parte superior del corazón y corte a través de la arteria pulmonar hasta la cámara ventricular derecha. En la cara anterior del corazón, corte a lo largo del tabique hasta llegar al ápice. Continúe cortando desde el ápice hacia arriba el lado posterior del corazón a lo largo del tabique hasta la arteria pulmonar y el punto de unión de la cámara ventricular derecha(Figura 1A).</li>
		<li>A partir de la arteria pulmonar y el punto de unión ventricular derecha, corte el lado anterior y posterior del corazón perpendicularmente a la disección anterior y lejos del tabique, hasta que la pared libre ventricular derecha se libere del resto del corazón(Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bajo el microscopio de microdisección, retire la pared libre del ventrículo izquierdo en un tubo de 5 ml que contenga DMEM(Figura 1C,D).<ol>
<li>Localice la aorta, ramificándose desde la parte superior del corazón detrás de la arteria pulmonar, y repita el método descrito en el paso 2.5 para cortar la pared libre del ventíndor izquierdo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Digestión CEE
<ol><li>Coloque los tejidos de pared libre del ventular derecho e izquierdo en un plato de cultivo de 60 cm con la superficie interior acostada plana, mirando hacia abajo(Figura 2). NOTA: La superficie interior es la cara interior del ventrículo de forma ligeramente cóncava, como se muestra en la Figura 2A,C.</li>
	<li>Añadir 0,5–1 ml de tampón de digestión al plato, colocando la punta de la pipeta directamente debajo del tejido. Continúe hasta que sólo se sumerja la superficie interior.</li>
	<li>Incubar el plato en una incubadora de CO2al 5%, 37oC durante 5 min.</li>
	<li>Agregue el medio EC al plato de cultivo para detener la digestión. NOTA: Mantenga la cantidad de tampón de digestión en medio EC como una proporción de 1:5.</li>
	<li>Utilice una pipeta de 1 ml para vaciar la superficie interna de los ventrículos con medio EC y transferir la escorrenta a un tubo de recogida de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo.</li>
</ol>4. Digestión CEC
<ol><li>Corte a lo largo de la superficie exterior del ventrículo izquierdo sin contaminación de la capa interna(Figura 2B,D)y coloque cada uno en un tubo separado de 5 ml que contenga 1 ml del tampón de digestión. NOTA: El ventrículo izquierdo se puede identificar como el ventrículo más grueso, y la superficie exterior se puede determinar como la cara exterior del ventrículo ligeramente cóncavo.</li>
	<li>Usando tijeras de disección, picar la pared ventricular en pequeñas piezas de 1 mm3.</li>
	<li>Incubar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante unos 15-20 minutos de vórtice cada 2-3 min.</li>
	<li>Pipetear 4 ml de medio EC en el tubo de 5 ml para terminar la digestión.</li>
	<li>Transfiera la solución con una pipeta serológica de 5 ml a un tubo de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo.</li>
</ol>5. Colección de células
<ol><li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Si el pellet aparece rojo, resuspenda el pellet en 1–2 ml de 1x tampón de lising de glóbulos rojos (RBC)(Figura 2F). NOTA: Si no hay RCO, continúe con el paso 6.</li>
	<li>Incubar los tubos en un baño de agua de 37oC durante 5 min.</li>
	<li>Pipetear 10 ml de PBS en los tubos de 50 ml para detener la lisis.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos en RT, y luego aspirar el sobrenadante.</li>
</ol>6. Clasificación CE
<ol><li>Añadir 90 ml de tampón de clasificación y 10 l de anticuerpo anti-CD31 PE en los tubos de 50 ml.</li>
	<li>Vortex los tubos y luego incubarlos durante 10 minutos en un refrigerador de 4 oC.</li>
	<li>Añadir 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezclar a fondo, y luego centrifugar a 300 x g durante 10 minutos en RT.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 80 l de tampón de clasificación y 20 l de microperlas.</li>
	<li>Vortic los tubos e incubar a 4oC durante 15 min.</li>
	<li>Lave las células agregando 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezcle bien y luego centrifugarlas a 300 x g durante 10 minutos a RT.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 l de tampón de clasificación.</li>
	<li>Coloque una columna que contenga esferas superparamagnéticas en un separador magnético y enjuague la columna con 3 ml de tampón de clasificación.</li>
	<li>Después de que la columna sea "parada de flujo", pipeta 500 l de la suspensión celular en las columnas y luego lave las columnas con búfer de clasificación. Repita el lavado 3x, cada uno con 3 ml de búfer de clasificación(Figura 2G).</li>
	<li>Retire las columnas del separador y colóquelas encima de un nuevo tubo de recogida de 15 ml.</li>
	<li>Con una pipeta, añada 5 ml de medio EC a las columnas e propulse la solución mediante un émbolo de columna.</li>
	<li>Centrifugar los tubos de recogida a 300 x g durante 10 minutos a RT y luego aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Extraiga el ARN del pellet celular de las muestras CEE y CEC utilizando un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se puede obtener un mínimo de 500 ng de ARN. NOTA: Después de la extracción del ARN, la muestra se puede almacenar a -80 oC.</li>
	<li>Trasvierta 500 ng de ARN para obtener ADNc usando una imprimación aleatoria y un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Realizar un ITP cuantitativo para la validación de poblaciones endocardiales y endoteliales(Figura 2H). Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla 2.<ol>
<li>Añadir 5 l de ADNC CEE o CEC (1 ng/L) en los pocillos de una placa de 384 qPCR. Agregue el ADNC CEE o CEC en suficientes pozos para que haya tres pozos por número de imprimaciones.</li>
		<li>Mezclar 6 l de tampón verde QPCR SYBR de 2x con 0,5 ml de cada imprimación de 10 m, incluidas las imprimaciones delanteras e inversas, y añadirlas en un solo pozo correspondiente a cada gen candidato.</li>
		<li>Sellar la placa con película de plástico y centrífuga durante 1 min a 300 x g a RT.</li>
		<li>Coloque la placa en una máquina qPCR y, a continuación, inicie el programa a 95 oC durante 3 min, seguido de 95 oC durante 15 s, y luego 55 oC durante 60 s. Repita los dos pasos siguientes para 45 ciclos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las CEC y las CEE difieren en origen, marcadores y funciones, por lo que podrían desempeñar un papel único en el desarrollo y las enfermedades. Los protocolos existentes para el aislamiento de células endoteliales se limitan a los tejidos macrovasculares, descuidando la recolección de CEO, restringiendo así el estudio de las funciones específicas de cec y CEE. Es esencial aislar y estudiar estas dos poblaciones de forma independiente, ya que este conocimiento proporcionaría una referencia para la diferenciación de los CIE en CEC y CEC para futuros estudios y facilitaría el examen de estas poblaciones celulares en busca de posibles dianas terapéuticas para diversas enfermedades cardíacas. Este novedoso protocolo describe un método para el aislamiento de los CEE de la superficie interna y los CEC de la superficie exterior de la pared libre ventricular de ratas adultas.
Es fundamental controlar la sincronización de cada paso con mucha precisión en este protocolo. Debido a que el número de EEC es muy limitado en el tejido del corazón de rata, minimizamos el tiempo de digestión de la capa interna del corazón para prevenir el daño celular y, lo que es más importante, la contaminación por CEC. La adición inmediata de la solución media CE para poner fin a la reacción enzimática también es muy importante para mantener una alta viabilidad celular. Un pellet rojo después de la recolección de células sugiere la presencia de un gran número de glóbulos rojos. Dependiendo de la cantidad de contaminación por RBC, se puede agregar 1-2 ml de tampón de lisis RBC para degradar los glóbulos rojos. Usando el protocolo actual, pudimos aislar 105 EECs de seis corazones de ratas. Estas células podrían ser sembradas en un plato de cultivo celular para una mayor expansión y caracterización.
Al preparar el tejido para la recolección libre de la pared, el corazón fue lavado con HBSS para eliminar la mayoría de los glóbulos rojos restantes. La composición del tampón de digestión asegura una liberación suficiente de las células endoteliales, donde la enzima de digestión liberasa el tejido de las células expuestas, DNase I elimina el ADN de las células muertas para promover el desprendimiento celular que puede ser inhibido por la calidad adhesiva del ADN, HEPES buffer equilibra el pH, y DMEM es un medio basal modificado con una mayor concentración de aminoácidos y vitaminas para un mejor mantenimiento celular y contiene el calcio necesario para activar la liberación.
Según la secuenciación del ARN de una sola célula (scRNA-seq) obtenida de15 humanos y del corazón del ratón10,se notificaron varios marcadores atribuidos a poblaciones específicas de la CE. Seleccionamos algunos de los genes más enriquecidos para examinar la pureza de las EEC aisladas (es decir, Npr3, Cdh11y Hapln1)y las EEC (es decir, Mgll, Fabp4y Cd36). En relación con los marcadores β-Actin, Npr3, Cdh11y Hapln1, se ha demostrado un aumento de la expresión en los CEC en comparación con los CEC. Del mismo modo, la expresión de los marcadores Mgll, Fabp4y Cd36 fue mayor en los CEC en comparación con los CEC. Los marcadores expresados de forma única para cada muestra están de acuerdo con los marcadores característicos de las CEC y las CEC, respectivamente, lo que indica un aislamiento satisfactorio.
Sin embargo, el protocolo actual no puede descartar la contaminación cruzada entre las dos poblaciones de las CE durante el aislamiento, incluso con digestiones secuenciales cuidadosamente controladas. Por lo tanto, algunos marcadores de superficie celular se pueden aplicar para una mayor purificación. Por ejemplo, NPR3 generalmente etiqueta el endocardio10, mientras que APJ puede rastrear la mayoría de los CCEP16. Debido a que estos dos marcadores se expresan en la superficie celular, podrían utilizarse para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los anticuerpos utilizados para purificar aún más las poblaciones EC distintas. Además, el15 humano y el ratón10 corazón scRNA-seq pueden confirmar el enriquecimiento de Npr3 en eEC, y Cd36 se puede utilizar potencialmente para la purificación CEC.
En conclusión, el protocolo presentado describe el aislamiento independiente de las CEC y las CEC del corazón de la rata. La identificación integral de las propiedades celulares, habilitada por el aislamiento celular, se puede utilizar para aplicaciones descendentes significativas.

Este artículo proporciona un protocolo detallado (modificado de Gladka et al.1) para la disección y posterior aislamiento de células endoteliales endocardiales (ECEP) y células endoteliales coronarias (CEC) de corazones de rata. La capacidad de investigar estas poblaciones celulares de forma independiente permitiría la exploración de mecanismos específicos de tipo celular subyacentes a una variedad de enfermedades cardíacas que podrían servir como posibles dianas terapéuticas. Sin embargo, aún no se ha publicado un método exitoso para la recopilación de estas poblaciones celulares de forma independiente.
Las CEC difieren de las CEO en cuanto a su origen, marcadores y funciones durante el desarrollo cardíaco y la enfermedad1,2,3,4,5,6,7. Las ECE provienen de la superficie ventrales del mesodermo cardíaco3. Surgen de células Flk1+ progenitoras en respuesta a la señalización VEGF e HIF y forman la capa más interna de las tres regiones discretas del corazón en desarrollo: la aurícula, el ventrículo y el venoso sinusal3,6. El rastreo genético del linaje sugiere que las células endocardiales pluripotentes del sinus venosus derivan células venosas, que migran para formar la capa subepicardial3. Posteriormente, la capa subepicardial se diferencia en arterias y venas coronarias, incluyendo CEC, que permanecen a través de la pared libre ventricular periférica3,4. Esta vía endocardial a endotelial está regulada por la señalización VEGFC, ELA/APJ y SOX173,4,6,8,9. El endocardio ventricular deriva el menor ceC del tabique interventricular por un mecanismo desconocido3. Posteriormente, la diferenciación localizada entre LAS CEOs y las CEC se sugiere mediante marcadores específicos para estas dos poblaciones celulares, incluida la expresión Mgll, Fabp4 y Cd36 en CEC, o expresión Npr3, Cdh11 y Hapln1 en eECs3,5,10.
Las CEE y las CEC desempeñan diferentes funciones en la función cardíaca. La transición endocardial a mesenquimal, la formación de válvulas, la maduración de la cámara, la regulación del tracto de salida y el desarrollo del canal auriculoventricular están supeditados a las CEE6. Alternativamente, los CCCe contribuyen al tono vasomotor y a la inflamación de las arterias coronarias11. Estas varianzas en la función dan lugar a roles individualizados en el desarrollo de la enfermedad4,12. Por ejemplo, la evidencia sugiere que el mal funcionamiento de las EEC puede conducir a la enfermedad de la válvula congénita6, no compaccion myocardium6, efecto septal auriculoventricular6, fibroelastosis endocardial13, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico13, hipoplasia ventricular13e hipertrofia cardíaca12. Del mismo modo, los estudios han encontrado que los ENC anormales contribuyen a la enfermedad de las arterias coronarias14 y a la trombosis11.
El aislamiento exitoso de las CEC y las CEC es necesario para lograr un conocimiento integral de estas dos poblaciones celulares, que podrían utilizarse tanto en la investigación como en los entornos clínicos. Determinar los factores de crecimiento y diferenciación de estas poblaciones celulares proporcionaría una referencia para la diferenciación de subtipos endoteliales de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Además, la identificación completa de las varianzas en el desarrollo, la regulación y la función de las CEC y las CEC es vital para comprender los factores genómicos y epigenómicos responsables de numerosas enfermedades cardíacas de una manera específica del tipo de célula. En este artículo se describen los pasos para la recopilación exitosa de CEC y CEC de forma independiente, y se proporcionan pruebas de separación mediante la evaluación de los niveles de expresión génica de los marcadores específicos del tipo de célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

Se ha demostrado que las células endoteliales endocardiales (ECEP) y las células endoteliales coronarias (CEC) difieren en origen, desarrollo, marcadores y funciones. En consecuencia, estas dos poblaciones celulares desempeñan un papel único en las enfermedades cardíacas. Estudios actuales con células endoteliales aisladas investigan poblaciones celulares compuestas tanto por CEC como en CEC. Este protocolo describe un método para aislar de forma independiente estas dos poblaciones de células para la caracterización específica de la celda. Después de la recolección de la pared libre ventricular izquierda y derecha, las células endoteliales de la superficie exterior y la superficie interna se liberan por separado utilizando una solución de amortiguación de digestión. La digestión secuencial de la superficie exterior y la capa interna endocardial retuvieron la separación de las dos poblaciones de células endoteliales. El aislamiento separado de las CEC y las CEC se verifica aún más mediante la identificación de marcadores específicos para cada población. Basado en la generación de perfiles de ARN de una sola célula publicados anteriormente en el corazón del ratón, la expresión génica Npr3, Hapln1y Cdh11 es única para las CE; mientras que la expresión génica Fabp4, Mglly Cd36 es única para los CEC. Los datos qPCR revelaron una expresión enriquecida de estos marcadores característicos en sus respectivas muestras, lo que indica el aislamiento exitoso de la CEE y la CEC, así como el mantenimiento del fenotipo celular, lo que permite un análisis funcional específico de las células.

El proceso de aislamiento CEE y CEC se describe en la Figura 2. El aislamiento exitoso de las CEE y las CEC se determinó evaluando la presencia de marcadores de células pandoteliales, así como los distintos de las dos poblaciones de subtipos. Como se predijo, qPCR reveló que en relación con β-actin, los CEO expresaron niveles más altos de marcadores endocárdcos Npr3, Hapln1 y Cdh11 en comparación con los CEC(Figura 3A). Asimismo, los CCA expresaron niveles más altos de marcadores coronarios Fabp4, Mglly Cd36 en comparación con las CEC(Figura 3B). Además, tanto las CEC como las CEC expresaron el gen marcador pan-EC Cdh5, con niveles ligeramente más altos en CEC(Figura 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Figura 1: Diagrama de disección cardíaca. (A) Primer corte hecho para separar la pared libre del ventrículo derecho del tabique. (B) Segundo corte hecho para liberar completamente el ventrículo derecho. (C) Primer corte realizado para separar la pared libre del ventrículo izquierdo del tabique. (D) Segundo corte hecho para liberar completamente el ventrículo izquierdo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Figura 2: Diagrama de la configuración de digestión de las CEC y CEC y la siguiente disposición para la clasificación celular. (A) La pared ventricular libre más interna y (B) la pared libre ventricular ultraperiférica se sumergieron (C) en el tampón de digestión o (D) digeridos en el tampón de digestión respectivamente. (E) Recopilación y filtración de soluciones celulares seguidas de (F) lisis de glóbulos rojos (RBC) y (G) clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) utilizando el anticuerpo CD31. (h) Los CO purificados se procesaron para la verificación de la expresión génica utilizando qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Figura 3: datos qPCR que verifican el aislamiento de CEC y ECE. (A) Los niveles de expresión génica de los marcadores CEE Npr3, Cdh11y Hapln1 en las CEC y los CCA se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. (B) Los niveles de expresión génica de los marcadores CEC Mgll, Fabp4y Cd36 en las CEE y los CEC se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. (C) El marcador pan-EC Cdh5 se cuantificó en las CEC y las CEC mediante PCR en tiempo real. (n 3 en cada grupo). Las barras representan la media de la sede *p < 0,05, **p < 0,01 frente a la CEE, prueba t no emparejada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabla 1. Búfer de digestión (1,5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Stock Con.</td>
			<td>Con final.</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Receta para el tampón de digestión.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Cuadro 2. Secuencias de primerplano</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gene Name</td>
			<td>Adelante</td>
			<td>Marcha atrás</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGGGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCACTTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACACCCGAC</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-actin</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Secuencias de imprimación

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Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Presentamos un protocolo para el aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de corazones de rata a través de la digestión secuencial del tejido en un tampón de digestión, la recolección celular de ciclos de centrífuga recurrentes y la purificación celular mediante microperlas CD31 anti-rata.

Aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de la pared libre ventricular del corazón de rata

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para aislar las células endocardiales y las células endoteliales coronarias por separado del corazón para ayudar a las personas a entender la expresión y función génica específica del tipo celular. Las principales ventajas de este método son la alta pureza y viabilidad de la CEE aislada y los CEC y que las células mantienen sus propiedades fisiológicas tras el aislamiento. Los CEC y los CEC difieren en muchos aspectos, por lo que la capacidad de investigar independientemente estas poblaciones celulares permite la exploración de mecanismos específicos del tipo de células en diversas enfermedades cardíacas.Este método podría facilitar el estudio de factores transcriptonómicos y epigenéticos responsables de numerosas enfermedades cardíacas de una manera específica del tipo celular. Las partes más difíciles de este método son determinar las diferentes porciones del corazón y cronometrar la digestión correctamente para evitar la contaminación del tipo celular. Demostrando el procedimiento estará Yifei Miao, un científico de investigación de mi laboratorio.Después de cosechar corazones de seis ratas Sprague Dawley de 50 a 100 gramos, lave los órganos con 50 mililitros de HBSS frío tres veces para eliminar cualquier exceso de sangre y coloque un corazón bajo un microscopio de disección. Coloque el corazón en su cara posterior más plana para identificar los lados izquierdo y derecho del tejido y localizar la arteria pulmonar. Use tijeras para cortar a través de la arteria pulmonar hasta la cámara ventricular derecha y cortar a lo largo del tabique hasta que se alcance el ápice.Continúe cortando desde el ápice hasta el lado posterior del corazón a lo largo del tabique hasta que se alcance la unión de la arteria pulmonar y la cámara ventricular derecha. A partir de este punto, corte los lados anterior y posterior del corazón perpendicularmente al punto de disección anterior y lejos del tabique hasta que la pared libre ventricular derecha se libere del resto del corazón. A continuación, coloque la pared libre ventricular derecha en un tubo de cinco mililitros de DMEM y localice la aorta de nuevo para facilitar la recolección de la pared libre ventricular izquierda de la misma manera que acaba de demostrar.Cuando se hayan recogido todas las paredes libres de ventriculares, transfiera las muestras de tejido a un plato de cultivo de 60 centímetros con sus superficies internas tumbadas boca abajo en el plato. Con una punta de pipeta de un mililitro, agregue 0,5 a un mililitro de tampón de digestión al plato directamente debajo de las piezas de tejido hasta que solo se sumerjan las superficies internas de los tejidos. Para evitar la contaminación celular no deseada, es importante que solo la superficie interna del ventrículo se sumerja en el tampón de digestión y se digiere durante exactamente cinco minutos.Después de cinco minutos en la incubadora de cultivo celular, detenga la digestión con cinco veces el volumen de medio celular endotelial. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para lavar la superficie interna de cada ventrículo con un medio fresco que transfiera la escorrentía a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de recogida de 50 mililitros sobre hielo. Para la digestión de células endoteliales coronarias, corte a lo largo de la superficie externa del ventrículo izquierdo sin contaminación de la capa interna y coloque cada fragmento de tubo en un tubo separado de cinco mililitros que contenga un mililitro de tampón de digestión.Para evitar la contaminación por EECs, es importante cortar sólo desde la superficie externa del ventrículo. Usando tijeras de disección, picar la pared ventricular en pequeñas piezas de un milímetro cúbico y colocar los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 15 a 20 minutos con vórtice cada dos a tres minutos. Cuando las piezas picadas sean pequeñas pero visibles, agregue cuatro mililitros de medio de célula endotelial al tubo y utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para transferir todo el volumen de solución a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de recolección de 50 mililitros sobre hielo.Para aislar las poblaciones de células positivas CD31 después de su digestión, pele el líquido de las células por centrifugación y aspirar los sobrenadantes. Si los gránulos son rojos, resuspender las células en uno a dos mililitros de tólisis de glóbulos rojos tampón por tubo para una incubación de cinco minutos en un baño de agua celsius de 37 grados. Al final de la incubación, detener la lelisis con 10 mililitros de PBS y recoger las células con una segunda centrifugación.A continuación, agregue 90 microlitros de tampón de clasificación y 10 microlitros de anticuerpos anti-CD31 PE a cada tubo de células. Después del vórtice, incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, añadir 10 mililitros de tampón de clasificación a los tubos con mezcla completa y recoger las células por centrifugación.Resuspender los pellets en 80 microlitros de tampón de clasificación por tubo, seguido de la adición de 20 microlitros de microperas anti-PE. Después del vórtice, coloque los tubos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, seguidos de lavado en 10 mililitros de tampón de clasificación por centrifugación como se acaba de demostrar. Resuspender los pellets en 500 microlitros de tampón de clasificación sobre hielo y colocar una columna que contenga esferas superparamagnéticas en un separador magnético.Enjuague la columna con tres mililitros de tampón de clasificación. Cuando la columna se haya vaciado, agregue 500 microlitros de la suspensión de celda endotelial endocardial a la columna, seguido de cuatro lavados con tres mililitros de tampón de clasificación por lavado. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 15 mililitros y utilice el émbolo de columna y cinco mililitros de medio de celda endotelial fresco para vaciar las células positivas CD31 de la columna en el tubo de recolección.Luego recoja las células endoteliales aisladas del cordón por centrifugación. Como se predijo, la PCR cuantitativa revela que, en relación con la beta actina, las células endoteliales endocardiales expresaron niveles más altos de los marcadores endocardiales Npr3, Hapln1 y Cdn11 en comparación con las células endoteliales coronarias. Del mismo modo, las células endoteliales coronarias expresaron niveles más altos de los marcadores coronarios Fabp4, Mgll y Cd36 en comparación con las células endoteliales endocardiales.Además, ambos tipos de células expresaron el gen marcador de células pan-endoteliales Cdh5 con niveles ligeramente más altos observados en las células endoteliales coronarias. Podemos purificar aún más las células usando FACS y anticuerpos específicos para las poblaciones celulares. Por ejemplo, podemos usar anti-Npr3 para ordenar los EEC y los anti-Cd36 para ordenar los CEC.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el papel de la CEE y los CEC en el desarrollo cardíaco y la enfermedad de una manera específica del tipo de célula.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

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Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

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Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

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Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

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Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

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The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...