Name: isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Författarna uppskattar mycket Dr Lingli Wang för hennes hjälp med djurprotokollet, och Institutionen för pediatrik vid Stanford för infrastruktur stöd. Detta arbete stöddes av NIH/NHLBI K99 HL135258 (till M.G.).

Alla djurförsök godkändes av den administrativa panelen för laboratoriedjurvård (APLAC31608) vid Stanford University.
1. Beredning av buffertar
<ol><li>Förbered rötningsbufferten med hjälp av reagenserna i tabell 1.<ol>
<li>Förbered DNase I-stamlösningen: Lös DNase I i RNase-fritt vatten för en stamlösning på 2 000 enheter/ml (1 mg/ml). Aliquot och förvara lagerlösningen vid -20 °C.</li>
		<li>Förbered liberaslösningen: Lös liberas med RNase-fritt vatten för en stamlösning på 5 mg/ml. Rotera den på en rullbank vid 4 °C i 30 min. Aliquot och förvara stamlösningen vid -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beredta och 10 % bovin serumalbuminlösning (BSA) med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för en slutlig koncentration på 2 mM EDTA och 0,5 % BSA.Prepare the sorting buffert by späda ut 0,5 M etylengaminettraättsyra (EDTA) och 10 % bovin serumalbumin (BSA) med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för en slutlig koncentration på 2 mM EDTA och 0,5 % BSA.</li>
</ol>2. Hjärtsamling
OBS: Sex Sprague Dawley råttor som väger 50-100 g användes i detta protokoll. Ingen könsskillnad observerades.
<ol><li>Avliva råttan med CO2 och placera den i en ryggläge på en dissekeringsplattform. Pin extremiteterna ner och sterilisera både buken och bröstet med 70% etanol.</li>
	<li>Öppna buken med sax och sätt in en 21 G nål i den del av den bakre vena cava som ligger bakom tarmarna. Dra tillbaka sprutkolven och dra tillbaka blodet från venen tills levern verkar ljusare till färgen och inget mer blod kan dras tillbaka, vilket tyder på tillräckligt med blodborttagning.</li>
	<li>Använd sax, öppna bröstet försiktigt för att undvika att skada lungan och hjärtat. Lyft aortabågen/atriumet med pincetten och skär aorta, lungartär, lungvener och vena cava för att befria och ta bort hjärtat.</li>
	<li>Tvätta hjärtat med 50 ml kall 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) buffert 3x för att avlägsna överdrivet blod.</li>
	<li>Under ett mikrodissectionmikroskop, ta bort den högra ventrikulära fria väggen i ett 5 ml-rör som innehåller Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) (figur 1A,B).<ol>
<li>Lägg hjärtat på dess plattare, bakre ansikte för att identifiera vänster och höger sida.</li>
		<li>Lokalisera pulmonell artär, den mest främre av venerna och artärerna förgrening från toppen av hjärtat och skär genom lungartären ner till rätt Ventrikulärt kammare. På hjärtats främre ansikte, skär längs septumet tills du når spetsen. Fortsätt skära från spetsen upp den bakre sidan av hjärtat längs septum tills lungartären och höger ventrikulära kammaren knutpunkten (Figur 1A).</li>
		<li>Från lungartären och höger ventrikulära knutpunkten, skär både den främre och bakre sidan av hjärtat vinkelrätt till föregående dissekering och bort från septum, tills den högra ventrikulära fria väggen frigörs från resten av hjärtat (Figur 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Under mikrodissectionmikroskopet, ta bort den vänstra ventrikulära fria väggen i ett 5 ml-rör som innehåller DMEM (figur 1C,D).<ol>
<li>Lokalisera aorta, förgrening från toppen av hjärtat bakom lungartären, och upprepa den metod som beskrivs i steg 2.5 för att skära av den vänstra ventrikulära fria väggen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EEG-rötning
<ol><li>Placera både höger och vänster ventrikulära fria väggvävnader i en 60 cm kulturskål med den inre ytan liggande platt, vänd nedåt (figur 2). OBS: Den inre ytan är den inre ytan av den något konkava formade ventrikeln som visas i figur 2A,C.</li>
	<li>Tillsätt 0,5–1 ml rötningsbuffert till skålen och placera pipettens spets direkt under vävnaden. Fortsätt tills endast den inre ytan är nedsänkt.</li>
	<li>Inkubera skålen i en 5% CO2, 37 °C inkubator i 5 min.</li>
	<li>Tillsätt EG-medium till kulturskålen för att stoppa matsmältningen. OBS: Håll mängden rötningsbuffert till EG-medium som ett 1:5-förhållande.</li>
	<li>Använd en 1 ml-pipett för att spola ventriklarnas inre yta med EC-medium och överför avrinningen till ett 50 ml uppsamlingsrör genom en 40 mm sil (figur 2E). Förvara samlingarna på is för nedströmsrening.</li>
</ol>4. CEC-rötning
<ol><li>Skär längs den vänstra ventrikelns utsida utan kontaminering från det inre lagret (figur 2B,D) och placera var och en i ett separat 5 ml-rör som innehåller 1 ml av rötningsbufferten. OBS: Den vänstra ventrikeln kan identifieras som den tjockare ventrikeln, och den yttre ytan kan bestämmas som utsidan av den något konkava ventrikeln.</li>
	<li>Med hjälp av dissekering sax, färs ventrikulära väggen i små, 1 mm3 stycken.</li>
	<li>Inkubera röret i ett 37 °C vattenbad i ca 15–20 min. Vortex var 2–3 minut.</li>
	<li>Pipett 4 ml EC medium i 5 ml-röret för att avsluta matsmältningen.</li>
	<li>Överför lösningen med en 5 ml serologisk pipett till ett 50 ml-rör genom en 40 mm sil (figur 2E). Förvara samlingarna på is för nedströmsrening.</li>
</ol>5. Cellsamling
<ol><li>Centrifugera rören vid 300 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT) och aspirera sedan supernatanten.</li>
	<li>Om pelleten syns röd, sätt tillbaka pelleten i 1–2 ml 1x röda blodkroppar (RBC) lysingbuffert (figur 2F). OM det inte finns några RBC:er går du vidare till steg 6.</li>
	<li>Inkubera rören i ett 37 °C vattenbad i 5 min.</li>
	<li>Pipettera 10 ml PBS i 50 ml-rören för att stoppa lysen.</li>
	<li>Centrifugera rören i 300 x g i 10 min vid RT, och aspirera sedan supernatanten.</li>
</ol>6. EG-sortering
<ol><li>Tillsätt 90 μL sorteringsbuffert och 10 μl anti-CD31 PE-antikropp i 50 ml-rören.</li>
	<li>Vortex rören och sedan ruva dem i 10 min i en 4 ° C kylskåp.</li>
	<li>Tillsätt 10 ml sorteringsbuffert i rören, blanda noggrant och centrifugera sedan vid 300 x g i 10 min vid RT.</li>
	<li>Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 80 μL sorteringsbuffert och 20 μL anti-PE-mikropärlor.</li>
	<li>Vortex rören och inkubera vid 4 °C i 15 min.</li>
	<li>Tvätta cellerna genom att lägga till 10 ml sorteringsbuffert i rören, blanda noggrant och centrifugera dem sedan vid 300 x g i 10 min vid RT.</li>
	<li>Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 500 μL sorteringsbuffert.</li>
	<li>Placera en kolumn som innehåller superparagnegenetiska sfärer i en magnetisk avgränsare och skölj kolonnen med 3 ml sorteringsbuffert.</li>
	<li>Efter att kolonnen är "flödesstopp", pipett 500 μL av cellfjädringen i kolumnerna och tvätta sedan kolumnerna med sorteringsbuffert. Upprepa tvätten 3x, var och en med 3 ml sorteringsbuffert (bild 2G).</li>
	<li>Ta bort kolumnerna från separatorn och placera dem ovanpå ett nytt 15 ml-uppsamlingsrör.</li>
	<li>Med en pipett, tillsätt 5 ml EC-medium till kolumnerna och driva lösningen genom att använda en kolonnkolv.</li>
	<li>Centrifugera uppsamlingsrören i 300 x g i 10 min vid RT och aspirera sedan supernatanten.</li>
	<li>Extrahera RNA från cellpelleterna i EEG- och CEC-proverna med hjälp av ett kit, i dess anvisningar. Minst 500 ng ng RNA kan erhållas. OBS: Efter RNA-extraktion kan provet förvaras vid -80 °C.</li>
	<li>Omvänd transkribera 500 ng ng RNA för att få cDNA med hjälp av en slumpmässig primer och ett kit, enligt tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Utför kvantitativ PCR för validering av endokardiella och endotelpopulationer (figur 2H). Primersekvenser listas i tabell 2.<ol>
<li>Tillsätt 5 μl EEG- eller CEC cDNA (1 ng/μL) i brunnarna på en 384 qPCR-platta. Lägg till EEG eller CEC cDNA i tillräckligt bras så att det finns tre brunnar per antal grundfärger.</li>
		<li>Blanda 6 μL 2x qPCR SYBR grön buffert med 0,5 μL av varje 10 μM primer, inklusive både framåt och omvänd primers, och tillsätt dem i en enda brunn som motsvarar varje kandidatgen.</li>
		<li>Täta plattan med plastfilm och centrifug i 1 min vid 300 x g vid RT.</li>
		<li>Placera plattan i en qPCR-maskin och starta sedan programmet vid 95 °C i 3 min, följt av 95 °C för 15 s, och sedan 55 °C för 60 s. Upprepa de följande två stegen i 45 cykler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation.">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+and+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development,+Diseases+and+Regeneration.">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions.">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner.">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls.">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li><li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+coronary+artery+disease.">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li><li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy.">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li><li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome:+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease.">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease.">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Central- och östeuropeiska länder och eECs skiljer sig åt i ursprung, markörer och funktioner, och kan därför spela en unik roll i utveckling och sjukdom. Befintliga protokoll för endotelcellsisolering är begränsade till makrovaskulära vävnader, försummar insamlingen av EECs, vilket begränsar studien av CEC- och EEG-specifika funktioner. Det är viktigt att isolera och studera dessa två populationer självständigt, eftersom denna kunskap skulle ge en referens för differentiering av iPSCs i central- och östeuropeiska länder för framtida studier och underlätta undersökningen av dessa cellpopulationer för potentiella terapeutiska mål för olika hjärtsjukdomar. Detta nya protokoll beskriver en metod för isolering av EECs från den inre ytan och CECs från den yttre ytan av ventrikulära fria väggen av vuxna råttor.
Det är viktigt att kontrollera tidpunkten för varje steg mycket exakt i detta protokoll. Eftersom antalet EECs är mycket begränsad i råtta hjärtvävnad, minimerade vi matsmältningstiden för det inre lagret av hjärtat för att förhindra cellulära skador och ännu viktigare, CEC kontaminering. Omedelbar tillsats av EG-mediumlösningen för att avsluta den enzymatiska reaktionen är också mycket viktigt för att upprätthålla hög cellens livskraft. En röd pellet efter cellsamling föreslår förekomsten av ett stort antal RBCs. Beroende på mängden RBC kontaminering, 1-2 ml RBC lysis buffert kan läggas till för att försämra RBCs. Inkubation måste noggrant tidsinställs för att undvika betydande skador på cellerna, och PBS läggs omedelbart till för att avsluta reaktionen. Med hjälp av det nuvarande protokollet kunde vi isolera 105 EECs från sex råtthjärtan. Dessa celler kan sås på en cell kultur skålen för ytterligare expansion och karakterisering.
Vid beredning av vävnaden för fri väggsamling, hjärtat tvättades med HBSS för att ta bort majoriteten av de återstående RBCs. HBSS är det rekommenderade mediet på grund av dess tydliga utseende, vilket möjliggör visualisering av blodkroppar, i motsats till DMED som innehåller fenol röd. Rötningsbuffertens sammansättning säkerställer tillräcklig frigörelse av endotelceller, Där liberasnedsmältningsenzym remsor vävnaden i de exponerade cellerna, DNase I eliminerar DNA från de döda cellerna för att främja cellavlossning som kan hämmas av DNA: s självhäftande kvalitet, HEPES buffert balanserar pH, och DMEM är ett modifierat basalt medium med en högre koncentration av aminosyror och vitaminer för bättre cellunderhåll och innehåller kalcium som behövs för att aktivera liberas.
Enligt den enda cell RNA sekvensering (scRNA-seq) som erhållits från både mänskliga15 och mus hjärta10,flera markörer tillskrivs specifika EG populationer rapporterades. Vi valde ut några av de mest berikade generna för att undersöka renhetsgraden hos isolerade EECs (dvs Npr3, Cdh11och Hapln1)och EECs (dvs Mgll, Fabp4och Cd36). I förhållande tillβ-Actin, Npr3, Cdh11och Hapln1 markörer visat ökat uttryck i EECs jämfört med CECs. β På samma sätt var uttrycket för Mgll, Fabp4och Cd36 markörer större i central- och östeuropeiska länder jämfört med EECs. De unikt uttryckta markörer för varje prov överensstämmer med markörer som är karakteristiska för EECs respektive Central- och östeuropeiska länder, vilket indikerar lyckad isolering.
Det nuvarande protokollet kan dock inte utesluta korskontaminering mellan de två EG-populationerna under isoleringen, inte ens med noggrant kontrollerade sekventiella matsmältningssammandragningar. Därför kan vissa cellytmarkörer användas för ytterligare rening. Npr3 märker till exempel i allmänhet endokardiet10,medan APJ kan spåra en majoritet av de central- och östeuropeiska länderna16. Eftersom dessa två markörer uttrycks på cellytan kan de användas för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och antikroppar som används för att ytterligare rena olika EG-populationer. Dessutom kan mänskliga15 och mus10 hjärta scRNA-seq bekräfta anrikning av Npr3 i EECs, och Cd36 kan potentiellt användas för CEC rening.
Sammanfattningsvis beskrivs i det presenterade protokollet den oberoende isoleringen av EECs och Central- och östeuropeiska länder från råtthjärtat. Den omfattande identifieringen av cellulära egenskaper, aktiverad av cellisolering, kan användas för betydande nedströmsprogram.

Denna artikel ger ett detaljerat protokoll (ändrad från Gladka et al.1) för dissekering och efterföljande isolering av endokrial endotelceller (EECs) och koronar endotelceller (CECs) från råtthjärtan. Förmågan att självständigt undersöka dessa cellpopulationer skulle möjliggöra utforskning av celltypspecifika mekanismer bakom en mängd olika hjärtsjukdomar som skulle kunna fungera som potentiella terapeutiska mål. En framgångsrik metod för insamling av dessa cellpopulationer självständigt har dock ännu inte offentliggjorts.
Central- och östeuropeiska länder skiljer sig från EECs när det gäller ursprung, markörer och funktioner under hjärtutveckling och sjukdom1,,2,,3,,4,,5,,6,7. EECs härrör från ventrala ytan av hjärt mesoderm3. De uppstår från Flk1+ stamceller som svar på VEGF och HIF signalering och utgör det innersta lagret av de tre diskreta regionerna i det växande hjärtat: atriumet, ventrikeln och sinus venosus3,6. Genetisk härstamning spårning tyder på att pluripotenta endokardiella celler i sinus venosus härleda venösa celler, som migrerar för att bilda subepicardialskiktet 3. Därefter skiljer subepicardial skiktet i kranskärl och vener, inklusive CECs, som förblir över perifera Ventrikulärt fri vägg3,4. Denna endokardiella till endotel väg regleras av VEGFC, ELA / APJ, och SOX17 signalering3,,4,,6,8,9. Ventrikulärt endokardiet härleder de färre central- och östeuropeiska länderna i interventricular septum med en okänd mekanism3. Därefter föreslås lokaliserad differentiering mellan EECs och CECs av markörer som är specifika för dessa två cellpopulationer, inklusive Mgll, Fabp4 och Cd36 uttryck i CECs, eller Npr3, Cdh11 och Hapln1 uttryck i EECs3,5,10.
EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder spelar olika roller i hjärtfunktionen. Endokardiell till mesenkymal övergång, ventilbildning, kammarmognad, utflödeskanalreglering och atrioventricular kanalutveckling är beroende av EECs6. Alternativt bidrar CECs till vasomotorisk ton och inflammation i kranskärl11. Dessa variationer i funktion resulterar i individualiserade roller i sjukdomsutveckling4,12. Till exempel, bevis tyder på att felaktige EECs kan leda till medfödd ventil sjukdom6, icke-compaction hjärtmuskeln6, atrioventricular septal effekt6, endokardiell fibroelastosis13, hypoplastiskt vänster hjärtsyndrom13, Ventrikulärt hypoplasi13, och hjärt hypertrofi12. På samma sätt har studier visat att onormala cecs bidrar till kranskärlssjukdom14 och trombos11.
Framgångsrik isolering av EED och CENTRAL- och östeuropeiska länder är nödvändig för att uppnå omfattande kunskap om dessa två cellpopulationer, som skulle kunna användas i både forsknings- och kliniska miljöer. Fastställande av tillväxt- och differentieringsfaktorerna för dessa cellpopulationer skulle ge en referens för differentiering av endotelsubtyper från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Vidare är fullständig identifiering av varianserna i EECs och Central- och östeuropeiska länders och central- och östeuropeiska länders utveckling, reglering och funktion avgörande för att förstå de genomiska och epigenomiska faktorer som är ansvariga för många hjärtsjukdomar på ett celltypspecifikt sätt. I den här artikeln beskrivs steg för en framgångsrik samling av EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder oberoende av detta och ger belägg för separation genom att bedöma genuttrycksnivåerna för celltypspecifika markörer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Tubes</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-115-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1855485</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK 003172</td>
			<td>1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EC Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP3805</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>For EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Sterile Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1001023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Microprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1050</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14574-11</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>For heart harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endocardial and coronary endothelial cells from the ventricular free wall of the rat heart

Det har visat sig att endokardiella endotelceller (EECs) och koronar endotelceller (CECs) skiljer sig åt i ursprung, utveckling, markörer och funktioner. Följaktligen spelar dessa två cellpopulationer unika roller i hjärtsjukdomar. Aktuella studier med isolerade endotelceller undersöker cellpopulationer som består av både EECs och CECs. Det här protokollet beskriver en metod för att självständigt isolera dessa två cellpopulationer för cellspecifik karakterisering. Efter insamling av den vänstra och högra ventrikulära fria väggen frigörs endotelceller från den yttre ytan och den inre ytan separat med hjälp av en rötningsbuffertlösning. Den sekventiella matsmältningen av den yttre ytan och den inre endokardiell skiktet behöll separation av de två endotel cell populationer. Den separata isoleringen av EIC och Central- och östeuropeiska länder kontrolleras ytterligare genom identifiering av markörer som är specifika för varje population. Baserat på tidigare publicerad encellig RNA-profilering i mushjärtat är genuttrycket Npr3, Hapln1och Cdh11 unikt för EBC; medan Fabp4, Mglloch Cd36 genuttryck är unik för CECs. qPCR-data visade berikat uttryck för dessa karakteristiska markörer i sina respektive prover, som anger framgångsrik EEG- och CEC-isolering, samt underhåll av cellfenotyp, vilket möjliggör ytterligare cellspecifik funktionell analys.

Processen för EEG- och CEC-isolering beskrivs i figur 2. Den framgångsrika isoleringen av EECs och CECs fastställdes genom att bedöma förekomsten av pan-enottel cell markörer, liksom de som skiljer sig från de två subtyp populationer. Som förutspått visade qPCR att eECs i förhållande tillβ-aktinuttryckte högre nivåer av endokardiella markörer Npr3, Hapln1 och Cdh11 jämfört med CECs (figur 3A). β På samma sätt uttryckte central- och östeuropeiska länder högre nivåer av koronarmarkörer Fabp4, Mglloch Cd36 jämfört med EECs (figur 3B). Dessutom uttryckte både EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder den pan-EG-markörgenen Cdh5, med något högre nivåer i CEC (figur 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Figur 1: Diagram över hjärtats dissekering. (A) Första snittet görs för att separera den högra ventrikeln fri vägg från septum. (B) Andra snittet görs för att befria den högra ventrikeln helt. (C) Första snittet görs för att separera den vänstra ventrikeln fri vägg från septum. (D) Andra snittet görs för att befria den vänstra ventrikeln helt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Figur 2: Diagram över rötningsuppsättningen av central- och östeuropeiska länder och följande arrangemang för cellsortering. (A)Innersta fria ventrikulära väggen och(B)yttersta ventrikulära fri vägg var(C)nedsänkt i matsmältningsbuffert eller (D) smält i matsmältningsbuffert respektive. E)Insamling och filtrering av celllösningar följt av(F)röda blodkroppar (RBC) lys och (G) magnetiskaktiverad cellsortering (MACS) med hjälp av CD31-antikroppen. h)Renade ECs bearbetades för genuttryckskontroll med qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Figur 3: qPCR-data som verifierar isolering av central- och östeuropeiska länder. a)Genuttrycksnivåerna för EEG-markörer npr3, cdh11och Hapln1 i EECs och Central- och östeuropeiska länder kvantifierades genom pcr i realtid. (B)Genuttryck nivåer av CEC markörer Mgll, Fabp4och Cd36 i EECs och CENTRAL- och östeuropeiska utvärderades av realtid PCR. C)Pan-EC-markören Cdh5 kvantifierades i EECs och Central- och östeuropeiska länder med PCR i realtid. (n = 3 i varje grupp). Staplar representerar medelvärdet ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 jämfört med EEG, oparat t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabell 1. Buffert för matsmältning (1,5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Lager Con.</td>
			<td>Sista Con.</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (AVSPES)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (ANDRA)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Recept på rötningsbufferten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tabell 2. Primer Sekvenser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gennamn</td>
			<td>Framåt</td>
			<td>Omvänd</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3 (en)</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11 (på andra sätt)</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1 (på)</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCAGCTTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll (på andra sätt)</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4 (på andra sätt)</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36 (på skiva)</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5 (2000))</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-aktin</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primer Sekvenser

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart at JoVE.com

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Vi presenterar ett protokoll för isolering av endokardiella och födans endotel celler från råtta hjärtan genom sekventiell vävnad matsmältningen i en matsmältningen buffert, cell insamling från återkommande centrifug cykler och cell rening med anti-råtta CD31 microbeads.

Isolering av endokardiella och koronar endotelceller från Ventrikulärt Fria väggen i Råtthjärtat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att isolera endocardial cell och koronar endotelceller separat från hjärtat för att hjälpa människor att förstå celltypspecifika genuttryck och funktion. De främsta fördelarna med denna metod är hög renhet och livskraft hos de isolerade EEC- och CEC-länderna och att cellerna bibehåller sina fysiologiska egenskaper vid isolering. CEC och EECs skiljer sig åt i många aspekter, så förmågan att självständigt undersöka dessa cellpopulationer möjliggör utforskning av celltypspecifika mekanismer i olika hjärtsjukdomar.Denna metod skulle kunna underlätta studiet av transkriptonomic och epigenetiska faktorer som ansvarar för ett flertal hjärtsjukdomar i en cell typ-specifika sätt. De svåraste delarna av denna metod är att bestämma de olika hjärtportionerna och timing matsmältningen korrekt för att undvika celltyp kontaminering. Demonstrerar proceduren blir Yifei Miao, en forskare från mitt labb.Efter skörd hjärtan från sex 50 till 100 gram Sprague Dawley råttor, tvätta organ med 50 milliliter av kallt HBSS tre gånger för att ta bort överflödigt blod och placera ett hjärta under en dissekera mikroskop. Placera hjärtat på dess plattare bakre ansikte för att identifiera vänster och höger sida av vävnaden och lokalisera lungartären. Använd sax för att skära igenom lungartären ner till höger ventrikulära kammaren och skär längs septum tills spetsen är nådd.Fortsätt skära från apex upp den bakre sidan av hjärtat längs septum tills korsningen av lungartären och den högra ventrikulära kammaren nås. Med utgångspunkt från denna punkt, skär både främre och bakre sidor av hjärtat vinkelrätt mot föregående dissektion punkt och bort från septum tills den högra ventrikulära fria väggen befrias från resten av hjärtat. Sedan placera rätt Ventrikulärt fri vägg i en fem milliliter rör dmem och lokalisera aorta igen för att underlätta insamling av den vänstra Ventrikulärt fri vägg på samma sätt som bara visat.När alla ventrikulära fria väggar har samlats in, överföra vävnadsprover till en 60 centimeter kultur skålen med sina inre ytor liggande nedåt i skålen. Lägg med en en milliliterpipett till 0,5 till en milliliter matsmältningsbuffert till skålen direkt under vävnadsbitarna tills endast vävnadernas inre ytor är nedsänkta. För att undvika oönskad cellkontaminering är det viktigt att endast den inre ytan av ventrikeln är nedsänkt i matsmältningsbufferten och den är smält i exakt fem minuter.Efter fem minuter i cellodlingsinkubatorn, stoppa matsmältningen med fem gånger volymen av endotelcellsmedium. Använd sedan en en milliliterpipett för att spola den inre ytan av varje kammare med färskt medium som överför avrinningen genom en 40 mikrometersil till ett 50 milliliter uppsamlingsrör på is. För koronar endothelial cell matsmältning, skär längs den yttre ytan av den vänstra ventrikeln utan kontaminering från det inre lagret och placera varje rörfragment i en separat fem milliliter rör som innehåller en milliliter av matsmältningsbuffert.För att undvika kontaminering från EECs är det viktigt att bara skära från den yttre ytan av ventrikeln. Med hjälp av dissekering sax, hacka ventrikulära väggen i små en kubik millimeter bitar och placera rören i en 37 graders Celsius vattenbad i 15 till 20 minuter med virvlande varannan till var tredje minut. När de malda bitarna är små men synliga, tillsätt fyra milliliter endotelcellsmedium till röret och använd en fem milliliter serologisk pipet för att överföra hela volymen av lösningen genom en 40 mikrometersil till ett 50 milliliter uppsamlingsrör på is.Att isolera de CD31 realitetcellbefolkningarna efter deras digestion, pellet cellerna vid centrifugation och aspirate supernatantsna. Om några pellets är röda, resuspend cellerna i en till två milliliter av röda blodkroppar lys buffert per rör för en fem minuters inkubation i en 37 graders Celsius vattenbad. Vid slutet av inkubationen, stoppa lysen med 10 milliliter PBS och samla in cellerna med en andra centrifugeringen.Därefter lägger du till 90 mikroliter av sorteringsbuffert och 10 mikroliter av anti-CD31 PE-antikropp till varje rör av celler. Efter virvelning, inkubera cellerna i 10 minuter vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tillsätt 10 milliliter sorteringsbuffert till rören med grundlig blandning och samla in cellerna genom centrifugeringen.Resuspend pellets i 80 mikroliter sortering buffert per rör, följt av tillägg av 20 mikroliter av anti-PE mikropärlor. Efter virvlande, placera rören på fyra grader Celsius i 15 minuter, följt av tvätt i 10 milliliter sortering buffert av centrifugeringen som just visat. Resuspend pellets i 500 mikroliter av sortering buffert på is och placera en kolumn som innehåller super paramagnetiska sfärer i en magnetisk separator.Skölj kolonnen med tre milliliter sorteringsbuffert. När kolonnen har tömts, tillsätt 500 mikroliter av endocardial endotelcellsupphängning till kolonnen, följt av fyra tvättar med tre milliliter sorteringsbuffert per tvätt. Efter den sista tvätten, överför kolonnen till ett nytt 15 milliliter uppsamlingsrör och använd kolonnkolven och fem milliliter färskt endotelcellsmedium för att spola ut CD31-positiva celler ur kolonnen i uppsamlingsröret.Samla sedan in pärlan isolerade endotelceller genom centrifugeringen. Som förutspått, kvantitativa PCR avslöjar att i förhållande till beta aktin, endocardial endoarktiva endotelceller uttryckt högre nivåer av de endocardial markörerna Npr3, Hapln1 och Cdn11 jämfört med koronar endotelceller. På samma sätt uttryckte koronar endothelial celler högre nivåer av koronar markörer Fabp4, Mgll, och Cd36 jämfört med endocardial endotelceller.Dessutom uttryckte båda typerna av celler pan-endothelial cell markör genen Cdh5 med något högre nivåer observeras i koronar endotelceller. Vi kan ytterligare rena cellerna med hjälp av FACS och antikroppar som är specifika för cellpopulationerna. Till exempel kan vi använda anti-Npr3 för att sortera EECs och anti-Cd36 för att sortera CECs.Denna teknik banade väg för forskare att utforska den roll som EEG och CEC i hjärtutveckling och sjukdom på ett celltypspecifikt sätt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Derivering av näthinnans pigmentepitel celler från stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Isolering och Kryokonservering av neonatala råttkardiomyocyter

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av neurala stamceller / progenitorceller från periventrikulär regionen vuxen råtta och humant ryggmärgs

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolering och karakterisering av satellitceller från råtta Head Branchiomeric Muskler

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolering och Expansion av mesenkymala stam / stromaceller celler från Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolering av Endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering och karakterisering av primära råtta ventil interstitiella celler: en ny modell att studera aortaklaffen förkalkning

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...