Name: isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts
Uploaded: 2020-05-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

אלסנדרה ד'אזו מחזיקה בקתדרה לתכשיטנים לילדים (JFC) בגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH R01GM104981, RO1DK095169 ו-CA021764, קרן אסיזי מממפיס וארגוני הצדקה האמריקניים הלבנוניים הסוריים.

כל ההליכים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.
1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>הכן את תמיסת העיכול על-ידי ערבוב של 15.4 מ"ל PBS עם 2.5 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל קולגנאז...

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

צעד קריטי לבידוד מוצלח של אקסוזומים מאמצעי התרבות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, הוא הקמה ותחזוקה נכונה של תרביות פיברובלסטים ראשוניים של עכברים משרירי שלד בוגרים. תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O2 בשרירי השלד היא ~2.5%)15. פיברובלסטים...

אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות הטרוגניות שגודלן נע בין 30-150 ננומטר. הם שחקני מפתח מבוססים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בהתחשב בתפוצה שלהם בכל מקום ברקמות ואיברים 1,2. אקסוזומים נושאים מטען מורכב של חלבונים, ליפידים, סוגי דנ"א וסוגי רנ"א, המשתנים בהתאם לסוג התאים שמהם הם נגזרים 1,2,3. אקסוזומים מועשרים בחלבונים בעלי תפקידים שונים (כלומר, טטרספאנינים, כולל CD9 ו- CD63) אחראים לאירועי היתוך. לדוגמה, חלבוני הלם חום HSP70 ו- HSP90 מעורבים בקשירת אנטיגן והצגתו. בנוסף, Alix, Tsg101 ושייטת משתתפים בביוגנזה ושחרור אקסוזומים, ונמצאים בשימוש נרחב כסמנים של ננו-שלפוחיות אלה 2,3,4.
אקסוזומים מכילים גם מגוון של רנ"א (כלומר, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א ריבוזומלי) שניתן להעביר לתאים מקבלים, שם הם משפיעים על איתות במורד הזרם3. בהיותה מוקפת בקרום יחידה אחת, פעילות ביולוגית אקסוזום תלויה לא רק במטען של חלבונים וחומצות גרעין, אלא גם ברכיבי שומנים של הממברנה המגבילה1. ממברנות אקסוזומליות מועשרות בפוספטידיל-סרין, חומצה פוספטידית, כולסטרול, ספינגומיילין, חומצה ארכידונית וחומצות שומן אחרות, שכולם יכולים להשפיע על יציבות האקזוזום ועל טופולוגיית הממברנה 2,3. כתוצאה מסידור המטען והשומנים, אקסוזומים יוזמים מסלולי איתות בתאים קולטים ומשתתפים בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של רקמות 1,2,4,5. בתנאים פתולוגיים מסוימים (כלומר, ניוון עצבי, פיברוזיס וסרטן), הם הוכחו כמעוררים ומפיצים גירויים פתולוגיים 4,6,7,8,9,10,11.
בשל יכולתם להפיץ אותות לאתרים שכנים או מרוחקים, אקסוזומים הפכו לסמנים ביולוגיים יקרי ערך לאבחון או פרוגנוזה של מצבי מחלה. בנוסף, אקסוזומים שימשו באופן ניסיוני ככלי רכב של תרכובות טיפוליות 2,12. היישום הפוטנציאלי של ננו-שלפוחיות אלה במרפאה הופך את שיטת הבידוד לחשובה יותר ויותר על מנת להשיג תפוקה מרבית, טוהר ויכולת שחזור. טכניקות שונות לבידוד אקסוזומים פותחו ויושמו. באופן כללי, ניתן לבודד אקסוזומים ממדיה מותנית של תרביות תאים או נוזלי גוף על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ולכידת מערכת החיסון (באמצעות ערכות מסחריות). לכל גישה יתרונות וחסרונות ייחודיים שנדונו בעבר 1,2,13,14.
הפרוטוקול המתואר מתמקד ב 1) בידוד ותרבית של פיברובלסטים ראשוניים משריר גסטרוקנמיוס עכבר בוגר 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים המשתחררים למדיום התרבית על ידי תאים אלה. פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים למחקרים פונקציונליים חסר כיום. פיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים כמויות גדולות של אקסוזומים, מה שהופך את תהליך הבידוד והטיהור למאתגר. פרוטוקול זה מתאר טיהור של כמויות גדולות של אקסוזומים טהורים מנפחי תרבית גדולים תוך שמירה על שלמותם המורפולוגית ופעילותם התפקודית. אקסוזומים מטוהרים המתקבלים מתווך מותנה שימשו בהצלחה בניסויי קליטה חוץ גופית כדי לגרום למסלולי איתות ספציפיים בתאים המקבלים. הם שימשו גם לניתוח פרוטאומי השוואתי של מטענים אקסוזומליים מדגימות ביולוגיות מרובות4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות כמעט על ידי כל התאים ומופרשות בכל הנוזלים הביולוגיים. שיטות רבות פותחו לבידוד שלפוחיות אלה, כולל אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. עם זאת, לא כולם מתאימים לטיהור ואפיון אקסוזום בקנה מידה גדול. להלן פרוטוקול לביסוס תרביות של פיברובלסטים ראשוניים שבודדו משרירי השלד של עכברים בוגרים, ולאחר מכן טיהור ואפיון של אקסוזומים מתרבית של תאים אלה. השיטה מבוססת על שימוש בשלבי צנטריפוגה רציפים ולאחריהם שיפועי צפיפות סוכרוז. טוהר התכשירים האקסוזומליים מאומת לאחר מכן על ידי ניתוחי כתמים מערביים באמצעות סוללה של סמנים קנוניים (כלומר, Alix, CD9 ו- CD81). הפרוטוקול מתאר כיצד לבודד ולרכז אקסוזומים ביו-אקטיביים עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרומטריית מסות וניסויי ספיגה עבור מחקרים פונקציונליים. ניתן בקלות להגדיל או להקטין אותו ולהתאים אותו לבידוד אקסוזום מסוגי תאים, רקמות ונוזלים ביולוגיים שונים.

פרוטוקול זה מתאים לטיהור אקסוזומים מכמויות גדולות של מדיום מותנה בצורה חסכונית. ההליך הוא מאוד לשחזור ועקבי. איור 1 מראה תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של אקסוזומים שטוהרו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים בעכברים. איור 2 מראה את תבנית ביטוי ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...