Name: isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts
Uploaded: 2020-05-16T13:30:00
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Alessandra d'Azzo è titolare della Cattedra di Genetica e Terapia Genica di Jewelers for Children (JFC). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIH R01GM104981, RO1DK095169 e CA021764, dalla Fondazione Assisi di Memphis e dall'American Lebanese Syrian Associated Charities.

Tutte le procedure nei topi sono state eseguite secondo i protocolli sugli animali approvati dal St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee e dalle linee guida del National Institutes of Health.
1. Preparazione delle soluzioni e dei terreni
<ol><li>Preparare la soluzione di digestione mescolando 15,4 mL di PBS con 2,5 mL di 20 mg/mL di collagenasi P (concentrazione finale di 5 mg/mL), 2 mL di dispasi II 11 U/mL (concentrazione finale di 1,2 U/mL) e 100 ...

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

Un passo fondamentale per il successo dell'isolamento degli esosomi dai terreni di coltura, come delineato in questo protocollo, è la corretta costituzione e mantenimento di colture primarie di fibroblasti di topo dal muscolo scheletrico adulto. Queste colture devono essere mantenute a un basso livello di ossigeno per garantire condizioni simili a quelle fisiologiche (il livello di O2 nel muscolo scheletrico è ~2,5%)15. I fibroblasti primari cambiano caratteristiche se passati in colt...

Gli esosomi sono vescicole extracellulari eterogenee di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm. Sono attori chiave affermati nei processi fisiologici e patologici, data la loro distribuzione ubiquitaria nei tessuti e negli organi 1,2. Gli esosomi trasportano un carico complesso di proteine, lipidi, tipi di DNA e tipi di RNA, che variano a seconda del tipo di cellule da cui derivano 1,2,3. Gli esosomi sono arricchiti in proteine che hanno funzioni diverse (ad esempio, le tetraspanine, tra cui CD9 e CD63) sono responsabili degli eventi di fusione. Ad esempio, le proteine da shock termico HSP70 e HSP90 sono coinvolte nel legame e nella presentazione dell'antigene. Inoltre, Alix, Tsg101 e flotillina partecipano alla biogenesi e al rilascio degli esosomi e sono ampiamente utilizzati come marcatori di queste nanovescicole 2,3,4.
Gli esosomi contengono anche una varietà di RNA (cioè microRNA, RNA lunghi non codificanti, RNA ribosomiali) che possono essere trasferiti alle cellule riceventi, dove influenzano la segnalazione a valle3. Essendo racchiusi da una singola unità di membrana, la bioattività degli esosomi dipende non solo dal carico di proteine e acidi nucleici, ma anche dai componenti lipidici della membrana limitante1. Le membrane esosomiali sono arricchite in fosfatidilserina, acido fosfatidico, colesterolo, sfingomielina, acido arachidonico e altri acidi grassi, che possono influenzare la stabilità degli esosomi e la topologia della membrana 2,3. Come risultato della disposizione del carico e dei lipidi, gli esosomi avviano vie di segnalazione nelle cellule riceventi e partecipano al mantenimento della normale fisiologia tissutale 1,2,4,5. In alcune condizioni patologiche (ad esempio, neurodegenerazione, fibrosi e cancro), è stato dimostrato che innescano e propagano stimoli patologici 4,6,7,8,9,10,11.
Grazie alla loro capacità di propagare i segnali a siti vicini o lontani, gli esosomi sono diventati preziosi biomarcatori per la diagnosi o la prognosi delle condizioni patologiche. Inoltre, gli esosomi sono stati utilizzati sperimentalmente come veicoli dei composti terapeutici 2,12. La potenziale applicazione di queste nanovescicole in clinica rende il metodo di isolamento sempre più importante per ottenere la massima resa, purezza e riproducibilità. Sono state sviluppate e implementate diverse tecniche per l'isolamento degli esosomi. Generalmente, gli esosomi possono essere isolati da terreni di coltura cellulare condizionati o fluidi corporei mediante centrifugazione differenziale, cromatografia ad esclusione dimensionale e cattura immunitaria (utilizzando kit disponibili in commercio). Ogni approccio presenta vantaggi e svantaggi unici che sono stati discussi in precedenza 1,2,13,14.
Il protocollo delineato si concentra su 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi rilasciati nel terreno di coltura da queste cellule. Attualmente manca un protocollo consolidato per l'isolamento degli esosomi dai fibroblasti primari per gli studi funzionali. I fibroblasti primari non secernono grandi quantità di esosomi, rendendo difficile il processo di isolamento e purificazione. Questo protocollo descrive la purificazione di grandi quantità di esosomi puri da grandi volumi di coltura, mantenendone l'integrità morfologica e l'attività funzionale. Gli esosomi purificati ottenuti da un terreno condizionato sono stati utilizzati con successo in esperimenti di captazione in vitro per indurre specifiche vie di segnalazione nelle cellule riceventi. Sono stati utilizzati anche per analisi proteomiche comparative di carichi esosomiali da più campioni biologici4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari rilasciate praticamente da tutte le cellule e secrete in tutti i fluidi biologici. Sono stati sviluppati molti metodi per l'isolamento di queste vescicole, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Tuttavia, non tutti sono adatti per la purificazione e la caratterizzazione di esosomi su larga scala. Qui è delineato un protocollo per stabilire colture di fibroblasti primari isolati da muscoli scheletrici di topo adulto, seguito dalla purificazione e caratterizzazione degli esosomi dai terreni di coltura di queste cellule. Il metodo si basa sull'uso di fasi di centrifugazione sequenziale seguite da gradienti di densità del saccarosio. La purezza dei preparati esosomiali viene quindi convalidata mediante analisi western blot utilizzando una batteria di marcatori canonici (ad esempio, Alix, CD9 e CD81). Il protocollo descrive come isolare e concentrare gli esosomi bioattivi per la microscopia elettronica, la spettrometria di massa e gli esperimenti di uptake per studi funzionali. Può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso e adattato per l'isolamento degli esosomi da diversi tipi di cellule, tessuti e fluidi biologici.

Questo protocollo è adatto per la purificazione di esosomi da grandi volumi di terreno condizionato in modo economico. La procedura è altamente riproducibile e coerente. La Figura 1 mostra l'immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) degli esosomi purificati dal terreno di coltura dei fibroblasti primari di topo. La Figura 2 mostra il pattern di espressione proteica dei marcatori esosomiali canonici e l'assenza di contaminanti proteici citosolici...

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Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

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Research

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Biology

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Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

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