Name: induction of complete transection-type spinal cord injury in mice
Uploaded: 2020-05-06T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par une allocation d’étudiant international (PhD) de l’Université Griffith à RR, une subvention de la Perry Cross Foundation à JE et JSJ, une subvention de la Fondation Clem Jones à JSJ et JE, et une subvention de la Motor Accident Insurance Commission of Queensland à JSJ et JE.

Toutes les procédures ont été effectuées avec l’approbation du Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC et MSC/04/18 AEC) selon les lignes directrices du National Health and Medical Research Council of Australia.
1. Procédure de mise en place d’animaux pour la chirurgie
<ol><li>Anesthésier et stabiliser l’animal.<ol>
<li>Utilisez des souris C57BL/6 femelles âgées de 8 à 10 semaines. Utilisez 5% d’isoflurane dans 1 L/min d’oxygène pour l’induction de l?...

<ol>
	<li>Sharif-Alhoseini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury:+a+systematic+review.">Animal models of spinal cord injury: a systematic review.</a> Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).</li><li>Lee, D. H., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+axon+regeneration+after+spinal+cord+injury.">Animal models of axon regeneration after spinal cord injury.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 436-444 (2013).</li><li>Sharif-Alhoseini, M., Rahimi-Movaghar, V., Dionyssiotis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topics in Paraplegia. , (2014).</li><li>Talac, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury+for+evaluation+of+tissue+engineering+treatment+strategies.">Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies.</a> Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).</li><li>Nakae, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+model+of+spinal+cord+injury+as+an+experimental+pain+model.">The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 939023 (2011).</li><li>Kwon, B., Oxland, T., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+used+in+spinal+cord+regeneration+research.">Animal models used in spinal cord regeneration research.</a> Spine. 27, 1504-1510 (2002).</li><li>Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+current+mammalian+models.">Spinal cord injury: current mammalian models.</a> American Journal of Neuroscience. (4), 1-12 (2013).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+spinal+cord+injury+in+five+common+mouse+strains.">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li><li>Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+spinal+cord+injury:+a+new+transection+model+in+the+C57Bl/6+mouse.">Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse.</a> Journal of Neuroscience Research. 67 (3), 337-345 (2002).</li></ol>

Cette méthode induit une lésion complète de type transection au niveau vertébral T10 chez la souris, ce qui entraîne une paraplégie complète de l’animal, en dessous du niveau de blessure. Dans l’ensemble, cette méthode entraîne un saignement minimal, des dommages collatéraux négligeables et une blessure stable et reproductible. Par rapport aux méthodes précédemment publiées de transection sans laminectomie10, cette méthode offre les avantages en termes de visualisation directe ...

Les lésions médullaires (SCI) sont un problème médical complexe qui entraîne des changements radicaux dans la santé et le mode de vie. Il n’y a aucun remède pour SCI, et la pathophysiologie de SCI n’est pas complètement comprise. Les modèles SCI animaux, en particulier les modèles de rongeurs, offrent un outil précieux pour l’essai de nouveaux traitements, et ont été utilisés pour explorer sci depuis des décennies. À ce jour, plus de 72 % des études précliniques de sci ont employé des modèles de rats, comparativement à seulement 16 % qui ont utilisé des souris1. Bien que les rats, en raison de leur taille plus grande et de leur tendance à former des cavités semblables aux ISC humaines, aient toujours été les animaux modèles préférés pour étudier de nouvelles approches thérapeutiques, les souris (y compris de nombreux modèles transgéniques de souris) sont maintenant utilisées plus fréquemment pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la SCI2. Le modèle de souris offre des avantages supplémentaires en termes de manipulation plus facile, des taux de reproduction plus rapides et des coûts inférieurs à ceux des rats; souris présentent également un degré élevé de similitude génomique avec leshumains 1,2,3. L’inconvénient majeur du modèle de souris a été identifié comme étant la taille significativement plus petite qui crée des défis pour les interventions chirurgicales pour la création et le traitement des lésionsmédullaires 4,5.
Il y a une lacune dans la littérature existante qui accentue la nécessité d’un protocole chirurgical robuste et reproductible pour induire la SCI stable dans le modèle de souris. Par conséquent, nous fournissons une approche chirurgicale nouvelle et précise dans ce protocole pour surmonter ces limitations. Ce protocole fournit des lignes directrices approfondies pour induire une blessure de type transection chez la souris, car ce type de blessure a été reconnu comme étant le plus approprié pour étudier les changements régénératifs et dégénératifs à la suite d’uneblessure 6, ainsi que la neuroplasticité, les circuits neuronaux et l’ingénierie tissulaireapproche 7. Nous avons choisi d’induire la blessure dans la région thoracique inférieure, puisque le niveau thoracique SCI est employé le plus généralement dans la littérature1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1036">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BAYT I</td>
			<td style="width:184px;">Post-operative care drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Betadine 500 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BETA AS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Castroviejo needle holder, locking</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T149C</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TXD101A-X</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Cotton swabs (5pcs)</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">21-893</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dremel Micro</td>
			<td style="width:243px;">DREMEL</td>
			<td style="width:161px;">8050-N/18</td>
			<td>Cordless rotary tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Dressing forceps fine</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">06-306</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Drill bits</td>
			<td style="width:243px;">Kemmer Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:161px;">SM 32 M 0550 070</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont #7b forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11270-20</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont tweezers, style 5</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T05-822</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Fur trimmer</td>
			<td style="width:243px;">WAHL</td>
			<td style="width:161px;">WA9884-312</td>
			<td>Zero Overlap Hair Trimmer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TY-3032</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Isoflurane isothesia NXT 250</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">ISOF 00 HS</td>
			<td>Anaesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Colibri Retractor - 4cm</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17000-04</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T133</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Signature latex surgical gloves size 7.5</td>
			<td style="width:243px;">Medline</td>
			<td style="width:161px;">MSG5475</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sodium Chloride 0.9%</td>
			<td style="width:243px;">STS</td>
			<td>PHA19042005</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Dressing Pack</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">08-709</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">29-220</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Surgical spirit 100 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;"># SURG SP</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">682G</td>
			<td>Silk Suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">VCP421H</td>
			<td>Vicryl Suture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:449px;">Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">TEMG I</td>
			<td>Post-operative care drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of complete transection-type spinal cord injury in mice

Les lésions médullaires (SCI) entraînent en grande partie une perte irréversible et permanente de la fonction, le plus souvent à la suite d’un traumatisme. Plusieurs options de traitement, telles que les méthodes de transplantation cellulaire, font l’objet de recherches pour surmonter les incapacités débilitantes découlant de la SCI. La plupart des essais précliniques sur les animaux sont menés dans des modèles de rongeurs de SCI. Tandis que les modèles de rat de SCI ont été largement utilisés, les modèles de souris ont reçu moins d’attention, même si les modèles de souris peuvent avoir des avantages significatifs au-dessus des modèles de rat. La petite taille des souris équivaut à des coûts d’entretien des animaux inférieurs à ceux des rats, et la disponibilité de nombreux modèles de souris transgéniques est avantageuse pour de nombreux types d’études. Induire des blessures reproductibles et précises chez les animaux est le principal défi pour la recherche sci, qui chez les petits rongeurs nécessite une chirurgie de haute précision. Le modèle de blessure de type transection a été un modèle de blessure couramment utilisé au cours de la dernière décennie pour la recherche thérapeutique basée sur la transplantation, mais une méthode normalisée pour induire une lésion complète de type transection chez la souris n’existe pas. Nous avons développé un protocole chirurgical pour induire une blessure complète de type transection chez les souris C57BL/6 au niveau vertébral thoracique 10 (T10). La procédure utilise une petite perceuse à pointe au lieu de rongeurs pour enlever avec précision le lamina, après quoi une fine lame avec bord de coupe arrondi est utilisé pour induire la transection de la moelle épinière. Cette méthode conduit à des blessures reproductibles de type transection chez les petits rongeurs avec un minimum de dommages collatéraux musculaires et osseux et minimise donc les facteurs confusionnels, en particulier lorsque les résultats fonctionnels comportementaux sont analysés.

La méthode qui en résulte, comme le montre la figure 1,implique une stabilisation adéquate de la souris (figure 1A) et une bonne visualisation de la colonne vertébrale et du tissu paraspinous (Figure 1B). Le processus épineux et la laminae peuvent être clairement visualisés avec la dissection musculaire minimale et la perte de sang (figure 1C,zone mise en évidence). Le perçage à pointe fine es...

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Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Ce protocole décrit comment créer une laminectomie précise pour l’induction de lésions stables de la moelle épinière de type transection dans le modèle de souris, avec des dommages collatéraux minimes pour la recherche sur les lésions médullaires.

Induction d’une lésion complète de la moelle épinière de type transection chez la souris

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Ce protocole fournit une blessure précise et chirurgicalement contrôlée pour induire une transection complète de moelle épinière chez les souris avec une reproductibilité élevée et des taux de survie très élevés. L’utilisation d’une perceuse fine pour les lésions osseuses minimise les dommages aux tissus environnants, ce qui permet de modéliser les blessures et les réponses au traitement avec plus de précision. Pour effectuer une laminectomie, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale dans une souris femelle C57 noire 6 de huit à dix semaines anesthésiée, rasez la fourrure arrière pour exposer la zone chirurgicale au-dessus de la colonne vertébrale dorsale et stérilisez la zone rasée avec des cotons-tiges stériles trempés dans du liquide antiseptique à l’iode povidone et un esprit chirurgical.À l’aide d’un scalpel, faire une incision verticale à mi-ligne au niveau vertébral T10 et utiliser des forceps droits pour soulever la peau du fascia sous-jacent pour faciliter le placement du rétracteur. Pour exposer les épines du T9 à travers les vertèbres T11, utilisez le bord contondant du scalpel pour faire une petite incision médiane dans le tissu sous-cutané et le fascia sous-jacent et utiliser des forceps fins non tranchants pour émousser la dissect et refléter le fascia. Pour exposer la laminée, utilisez la pointe émoussée du scalpel pour fendre le tronc dorsal et les muscles paraspinous le long des épines du T9 à travers les vertèbres T11 et utilisez les forceps émoussés fine pointe pour émousser disséquer les muscles en couches pour exposer la laminée des vertèbres.Utilisez les mêmes forceps pour faire de petites poches autour des processus transversaux de la vertèbre T10 et accrocher les dents des forceps incurvés sous les processus transversaux dans les poches créées pour stabiliser le corps vertébral T10. Rincez soigneusement la laminae T10 avec de la solution saline chaude et utilisez des cotons-tiges pour essuyer doucement la surface osseuse propre, en prenant soin qu’aucun attachement musculaire ou ligamentaire ne reste le long de la surface bilatérale. Pour briser le laminae bilatéralement, utilisez un diamètre de 0,55 millimètre, sept millimètres de longueur de perceuse bit pointe pour tracer une trajectoire verticale de l’espace intervertébral T9/T10 à l’espace intervertébral T10/T11 le long des deux laminae T10 avec la foreuse au large.Lorsque le chemin a été tracé, allumez la foreuse et faites lentement et soigneusement une tranchée verticale sur le lamina droit de la vertèbre T10, en utilisant les forceps incurvés pour maintenir la vertèbre stable. Après avoir répété le processus sur le côté gauche du lamina, irriguer le tissu avec salin chaud pour laver tous les fragments d’os restants. Maintenir une bonne adhérence sur la colonne vertébrale d’une main est essentiel pour cette étape.Il est également important de devenir à l’aise et confiant avec l’utilisation de la perceuse. Ensuite, utilisez les forceps à pointe fine inclinée pour saisir le processus épineux et enlever tout le segment dorsal de la laminée séparée par le forage bilatéral. Ensuite, irriguer et écouvillonner au besoin pour permettre une visualisation claire de la moelle épinière dans la fenêtre laminectomie.Pour induire les lésions de la moelle épinière dans la moelle épinière exposée, utilisez une lame étroite et ronde tranchante pour trancher la corde au centre de la fenêtre de laminectomie, en prenant soin de balayer les cavités latérales de la colonne vertébrale pour induire une lésion complète de transection. Pour confirmer l’exhaustivité de la blessure par transection, utilisez les forceps d’extrémité fine émoussés pour enlever les connexions restantes au site de transection. Une fois que l’hémostase a été atteinte au site de transection, relâchez l’adhérence du forcep incurvé sur la vertèbre T10 et rassemblez les bords des muscles disséqués le long de la ligne médiane pour obtenir une bonne apposition.En utilisant 5/0 polyglactine 910 sutures absorbables, suture des muscles en couches, en s’assurant que la courbure naturelle de la colonne vertébrale ne provoque aucune tension à la ligne de suture ou d’ouvrir les sutures. Ensuite, utilisez 5/0 sutures de soie non absorbables pour fermer le tissu sous-cutané et la peau, en prenant soin qu’il n’y a pas de saignement, caillots, ou des débris restant sous la peau avant la fermeture. Pour évaluer si cette méthode pour induire des lésions de la moelle épinière de type transection chez la souris est reproductible et cohérente, la moelle épinière blessée peut être analysée par immunohistochimie et des tests comportementaux peuvent être effectués sur les souris.L’immuno-étiquetage contre le marqueur d’astrocyte, protéine acide fibrillaire gliale, facilite la démarcation de la limite de la moelle épinière intacte. Dans cette section longitudinale, le site de blessure situé peut être visualisé entre les souches du cordon comme prévu. Un défaut de taille uniforme peut être induit au site de transection avec une distance minimale moyenne de 550,4, plus ou moins 17,3 micromètres.Les données comportementales déployant l’échelle de souris Basso d’un essai en plein champ montrent que les souris blessées ne présentent aucun mouvement de membre postérieur après la blessure. Ainsi, le protocole produit une blessure complète et fiable de type transection qui se traduit par une perte complète de la fonction en dessous du niveau de blessure qui ne conduit pas à l’inversion spontanée de la paralysie. Prenez soin de percer en ligne droite avec une main stable, car il peut être très difficile de réparer la fenêtre laminectomie une fois qu’elle a été forée de façon incorrecte.Après l’induction des lésions médullaires, diverses options de traitement peuvent être appliquées, y compris l’administration de médicaments et la transplantation cellulaire pour identifier les thérapies potentielles qui améliorent le rétablissement des lésions médullaires.

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