Name: induction of complete transection-type spinal cord injury in mice
Uploaded: 2020-05-06T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da uno stipendio per studenti internazionali (PhD) della Griffith University a RR, una borsa di studio della Perry Cross Foundation a JE e JSJ, una sovvenzione della Fondazione Clem Jones a JSJ e JE e una sovvenzione della Motor Accident Insurance Commission of Queensland a JSJ e JE.

Tutte le procedure sono state eseguite con l'approvazione del Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC e MSC/04/18 AEC) sotto le linee guida del National Health and Medical Research Council of Australia.
1. Procedura di set-up animale per l'intervento chirurgico
<ol><li>Anestetizza e stabilizza l'animale.<ol>
<li>Utilizzare topi C57BL/6 femmina di 8-10 settimane. Utilizzare il 5% di isoflurane in 1 L/min di ossigeno per l'induzione dell'anestesia. Per il mantenimento dell'a...

<ol>
	<li>Sharif-Alhoseini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury:+a+systematic+review.">Animal models of spinal cord injury: a systematic review.</a> Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).</li><li>Lee, D. H., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+axon+regeneration+after+spinal+cord+injury.">Animal models of axon regeneration after spinal cord injury.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 436-444 (2013).</li><li>Sharif-Alhoseini, M., Rahimi-Movaghar, V., Dionyssiotis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topics in Paraplegia. , (2014).</li><li>Talac, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury+for+evaluation+of+tissue+engineering+treatment+strategies.">Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies.</a> Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).</li><li>Nakae, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+model+of+spinal+cord+injury+as+an+experimental+pain+model.">The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 939023 (2011).</li><li>Kwon, B., Oxland, T., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+used+in+spinal+cord+regeneration+research.">Animal models used in spinal cord regeneration research.</a> Spine. 27, 1504-1510 (2002).</li><li>Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+current+mammalian+models.">Spinal cord injury: current mammalian models.</a> American Journal of Neuroscience. (4), 1-12 (2013).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+spinal+cord+injury+in+five+common+mouse+strains.">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li><li>Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+spinal+cord+injury:+a+new+transection+model+in+the+C57Bl/6+mouse.">Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse.</a> Journal of Neuroscience Research. 67 (3), 337-345 (2002).</li></ol>

Questo metodo induce una lesione completa del tipo di trasezione a livello vertebrale T10 nei topi, che si traduce in una paraplegia completa dell'animale, al di sotto del livello di lesione. Nel complesso, questo metodo si traduce in sanguinamento minimo, danni collaterali trascurabili e una lesione stabile e riproducibile. Rispetto ai metodi di trasezione precedentemente pubblicati senza laminectomia10, questo metodo offre i vantaggi in termini di visualizzazione diretta senza manipolare la curv...

La lesione del midollo spinale (SCI) è un problema medico complesso che si traduce in drastici cambiamenti nella salute e nello stile di vita. Non esiste una cura per SCI e la fisiopatologia di SCI non è compresa a fondo. I modelli Animal SCI, in particolare i modelli di roditori, offrono uno strumento inestimabile per la sperimentazione di nuovi trattamenti e sono stati utilizzati per esplorare SCI per decenni. Ad oggi, oltre il 72% degli studi SCI preclitici ha utilizzato modelli di ratto, rispetto a un solo 16% che ha utilizzato topi1. Sebbene i ratti, a causa delle loro maggiori dimensioni e della tendenza a formare cavità simili alle SIC umane, siano stati tradizionalmente gli animali modello preferiti per lo studio di nuovi approcci terapeutici, i topi (compresi molti modelli di topi transgenici) sono ora utilizzati più frequentemente per studiare i meccanismi cellulari e molecolari dello SCI2. Il modello di topo offre ulteriori vantaggi in termini di una manipolazione più semplice, tassi riproduttivi più rapidi e costi inferiori rispetto ai ratti; i topi mostrano anche un alto grado di somiglianza genomica conl'uomo 1,2,3. Il principale svantaggio del modello di topo è stato identificato come la dimensione significativamente più piccola che crea sfide per gli interventi chirurgici per la creazione e il trattamento delle lesioni del midollospinale 4,5.
C'è una lacuna nella letteratura esistente che evidenzia la necessità di un protocollo chirurgico robusto e riproducibile per indurre SCI stabile nel modello di mouse. Pertanto, forniamo un approccio chirurgico nuovo e preciso in questo protocollo per superare questi limiti. Questo protocollo fornisce linee guida approfondite per indurre una lesione di tipo transezione nei topi, poiché questo tipo di lesione è stato riconosciuto come il più appropriato per studiare i cambiamenti rigenerativi e degenerativi a seguito di unalesione 6,nonché la neuroplasticità, i circuiti neurali e l'ingegneria tissutalesi avvicinano a 7. Abbiamo scelto di indurre la lesione nella regione toracica inferiore, poiché il livello toracico SCI è usato più comunemente nella letteratura1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1036">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BAYT I</td>
			<td style="width:184px;">Post-operative care drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Betadine 500 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BETA AS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Castroviejo needle holder, locking</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T149C</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TXD101A-X</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Cotton swabs (5pcs)</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">21-893</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dremel Micro</td>
			<td style="width:243px;">DREMEL</td>
			<td style="width:161px;">8050-N/18</td>
			<td>Cordless rotary tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Dressing forceps fine</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">06-306</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Drill bits</td>
			<td style="width:243px;">Kemmer Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:161px;">SM 32 M 0550 070</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont #7b forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11270-20</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont tweezers, style 5</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T05-822</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Fur trimmer</td>
			<td style="width:243px;">WAHL</td>
			<td style="width:161px;">WA9884-312</td>
			<td>Zero Overlap Hair Trimmer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TY-3032</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Isoflurane isothesia NXT 250</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">ISOF 00 HS</td>
			<td>Anaesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Colibri Retractor - 4cm</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17000-04</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T133</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Signature latex surgical gloves size 7.5</td>
			<td style="width:243px;">Medline</td>
			<td style="width:161px;">MSG5475</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sodium Chloride 0.9%</td>
			<td style="width:243px;">STS</td>
			<td>PHA19042005</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Dressing Pack</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">08-709</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">29-220</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Surgical spirit 100 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;"># SURG SP</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">682G</td>
			<td>Silk Suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">VCP421H</td>
			<td>Vicryl Suture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:449px;">Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">TEMG I</td>
			<td>Post-operative care drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of complete transection-type spinal cord injury in mice

La lesione del midollo spinale (SCI) porta in gran parte a una perdita irreversibile e permanente della funzione, più comunemente a causa di un trauma. Diverse opzioni di trattamento, come i metodi di trapianto di cellule, sono in fase di ricerca per superare le disabilità debilitanti derivanti dallo SCI. La maggior parte degli studi precli clinici sugli animali sono condotti in modelli di roditori di SCI. Mentre i modelli di ratti SCI sono stati ampiamente utilizzati, i modelli di topi hanno ricevuto meno attenzione, anche se i modelli di topi possono avere vantaggi significativi rispetto ai modelli di ratti. Le piccole dimensioni dei topi equivalgono a costi di manutenzione degli animali inferiori a quelli dei ratti e la disponibilità di numerosi modelli di topi transgenici è vantaggiosa per molti tipi di studi. Indurre lesioni ripetibili e precise negli animali è la sfida principale per la ricerca SCI, che nei piccoli roditori richiede un intervento chirurgico ad alta precisione. Il modello di lesione di tipo trasezione è stato un modello di lesione comunemente usato nell'ultimo decennio per la ricerca terapeutica basata sui trapianti, tuttavia non esiste un metodo standardizzato per indurre una lesione completa del tipo di transezione nei topi. Abbiamo sviluppato un protocollo chirurgico per indurre una lesione completa del tipo di trasezione nei topi C57BL/6 a livello vertebrale toracico 10 (T10). La procedura utilizza un piccolo trapano a punta al posto dei rongeurs per rimuovere con precisione la lamina, dopo di che viene utilizzata una lama sottile con tagliente arrotondato per indurre la transezione del midollo spinale. Questo metodo porta a lesioni riproducibili di tipo trasezione nei piccoli roditori con danni muscolari e ossei collaterali minimi e quindi riduce al minimo i fattori confondenti, in particolare dove vengono analizzati i risultati funzionali comportamentali.

Il metodo risultante, illustrato nella figura 1, comporta un'adeguata stabilizzazione del topo (Figura 1A) e una buona visualizzazione della colonna vertebrale e del tessuto paraspinoso (Figura 1B). Il processo spinoso e le laminae possono essere chiaramente visualizzati con una dissezione muscolare minima e perdita di sangue(Figura 1C,zona evidenziata). La foratura della punta fine viene eseguita come ...

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Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Questo protocollo descrive come creare una laminectomia precisa per l'induzione di lesioni stabili del midollo spinale di tipo transezione nel modello del topo, con danni collaterali minimi per la ricerca sulle lesioni del midollo spinale.

Induzione della lesione completa del midollo spinale di tipo transezione nei topi

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Questo protocollo fornisce una lesione precisa e controllata chirurgicamente per indurre una traspirazione completa del midollo spinale nei topi con un'elevata riproducibilità e tassi di sopravvivenza molto elevati. L'uso di un trapano fine per la lesione ossea riduce al minimo il danno al tessuto circostante, consentendo di modellare le risposte alle lesioni e al trattamento con maggiore precisione. Per eseguire una laminectomia, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo femmina C57 nero 6 di otto-10 settimane anestetizzato, radere la pelliccia posteriore per esporre l'area chirurgica sulla colonna vertebrale dorsale e sterilizzare l'area rasata con tamponi di cotone sterili imbevuti di liquido antisettico di povidone iodio e spirito chirurgico.Utilizzando un bisturi, effettuare un'incisione verticale della linea mediana a livello vertebrale T10 e utilizzare forcep dritte per sollevare la pelle dalla fascia sottostante per facilitare il posizionamento del riavvolgitore. Per esporre le spine delle vertebre T9-T11, utilizzare il bordo smussato del bisturi per fare una piccola incisione della linea mediana nel tessuto sottocutaneo e nella fascia sottostante e utilizzare forcelle sottili non affilate per smussare la dissezione e riflettere la fascia. Per esporre le lamina, utilizzare la punta smussata del bisturi per dividere il tronco dorsale e i muscoli paraspinosi lungo le spine delle vertebre T9-T11 e utilizzare le forcep smussate della punta fine per smussare i muscoli a strati per esporre le laminae delle vertebre.Usa le stesse pinze per creare piccole tasche intorno ai processi trasversali della vertebra T10 e agganciare le sporgenze delle pinze curve sotto i processi trasversali all'interno delle tasche create per stabilizzare il corpo vertebrale T10. Risciacquare accuratamente le lamina T10 con salina calda e utilizzare tamponi di cotone per pulire delicatamente la superficie ossea, facendo attenzione che non rimangano attacchi muscolari o legamenti lungo la superficie bilaterale. Per rompere le lamina bilateralmente, utilizzare un diametro di 0,55 millimetri, punta della punta del trapano di sette millimetri per tracciare un percorso verticale dallo spazio intervertebrale T9/T10 allo spazio intervertebrale T10/T11 lungo entrambe le lamina T10 con il trapano spento.Una volta tracciato il percorso, accendere il trapano e fare lentamente e con attenzione una trincea verticale sulla lamina destra della vertebra T10, utilizzando le forcette curve per mantenere stabile la vertebra. Dopo aver ripetuto il processo sul lato sinistro della lamina, irrigare il tessuto con soluzione salina calda per lavare via eventuali frammenti ossei rimanenti. Mantenere una buona presa sulla colonna vertebrale con una mano è essenziale per questo passaggio.È anche importante diventare comodi e sicuri con l'utilizzo del trapano. Successivamente, utilizzare le pinze angolate a punta fine per afferrare il processo spinoso e rimuovere l'intero segmento dorsale delle lamina separate dalla perforazione bilaterale. Quindi, irrigare e tamponare se necessario per consentire una chiara visualizzazione del midollo spinale all'interno della finestra della laminectomia.Per indurre la lesione del midollo spinale all'interno del cordone esposto, utilizzare una lama stretta e rotonda tagliente per tagliare il cordone al centro della finestra della laminectomia, facendo attenzione a spazzare i recessi laterale della colonna vertebrale per indurre una lesione completa della transezione. Per confermare la completezza della lesione di trasezione, utilizzare le forcep a punta fine smussata per rimuovere eventuali connessioni rimanenti nel sito di trasezione. Una volta raggiunta l'emostasi nel sito di trasezione, rilasciare la presa del forcep curvo sulla vertebra T10 e riunire i bordi dei muscoli sezionati lungo la linea mediana per ottenere una buona apposizione.Utilizzando suture assorbibili 5/0 poliglactina 910, suturare i muscoli a strati, assicurandosi che la curvatura naturale della colonna vertebrale non causi alcuna tensione alla linea di sutura o apra le suture. Quindi, utilizzare 5/0 suture di seta non assorbibili per chiudere il tessuto sottocutaneo e la pelle, facendo attenzione che non rimangano sanguinamenti, coaguli o detriti sotto la pelle prima della chiusura. Per valutare se questo metodo per indurre lesioni del midollo spinale di tipo trasezionale nei topi sia riproducibile e coerente, il midollo spinale ferito può essere analizzato mediante immunoistochimica e possono essere eseguiti test comportamentali sui topi.L'immuno-etichettatura contro il marcatore di astrociti, proteina acida fibrillare gliale, facilita la demarcazione del confine del midollo spinale intatto. In questa sezione longitudinale, il sito di lesione situato può essere visualizzato tra i ceppi del cavo come previsto. Un difetto di dimensione costante può essere indotto nel sito di trasezione con una distanza minima media di 550,4, più o meno 17,3 micrometri.I dati comportamentali che distribuiscono la scala del topo basso di un test a campo aperto mostrano che i topi feriti non mostrano alcun movimento degli arti posteriori dopo la lesione. Pertanto, il protocollo produce una lesione completa e affidabile del tipo di trasezione che si traduce in una completa perdita di funzione al di sotto del livello di lesione che non porta all'inversione spontanea della paralisi. Fai attenzione a praticare in linea retta con una mano stabile, perché può essere molto difficile riparare la finestra della laminectomia una volta che è stata forata in modo errato.Dopo l'induzione della lesione del midollo spinale, possono essere applicate varie opzioni di trattamento, tra cui la somministrazione di farmaci e il trapianto di cellule per identificare potenziali terapie che migliorano il recupero delle lesioni del midollo spinale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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