Name: induction of complete transection-type spinal cord injury in mice
Uploaded: 2020-05-06T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por un estipendio de estudiante internacional (PhD) de la Universidad Griffith a RR, una beca de la Fundación Perry Cross a JE y JSJ, una beca de la Fundación Clem Jones a JSJ y JE, y una subvención de la Comisión de Seguros de Accidentes de Motor de Queensland a JSJ y JE.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de ética animal de la Universidad Griffith (ESK/04/16 AEC y MSC/04/18 AEC) bajo las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia.
1. Procedimiento de instalación animal para la cirugía
<ol><li>Anestesar y estabilizar al animal.<ol>
<li>Utilice ratones C57BL/6 hembras de 8 a 10 semanas de edad. Utilice 5% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno para la inducción de la anestesia. Para...

<ol>
	<li>Sharif-Alhoseini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury:+a+systematic+review.">Animal models of spinal cord injury: a systematic review.</a> Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).</li><li>Lee, D. H., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+axon+regeneration+after+spinal+cord+injury.">Animal models of axon regeneration after spinal cord injury.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 436-444 (2013).</li><li>Sharif-Alhoseini, M., Rahimi-Movaghar, V., Dionyssiotis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topics in Paraplegia. , (2014).</li><li>Talac, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+spinal+cord+injury+for+evaluation+of+tissue+engineering+treatment+strategies.">Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies.</a> Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).</li><li>Nakae, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+model+of+spinal+cord+injury+as+an+experimental+pain+model.">The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 939023 (2011).</li><li>Kwon, B., Oxland, T., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+used+in+spinal+cord+regeneration+research.">Animal models used in spinal cord regeneration research.</a> Spine. 27, 1504-1510 (2002).</li><li>Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+current+mammalian+models.">Spinal cord injury: current mammalian models.</a> American Journal of Neuroscience. (4), 1-12 (2013).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+spinal+cord+injury+in+five+common+mouse+strains.">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li><li>Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+spinal+cord+injury:+a+new+transection+model+in+the+C57Bl/6+mouse.">Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse.</a> Journal of Neuroscience Research. 67 (3), 337-345 (2002).</li></ol>

Este método induce una lesión completa del tipo de transección a nivel vertebral T10 en ratones, lo que resulta en una paraplejia completa del animal, por debajo del nivel de lesión. En general, este método resulta en un sangrado mínimo, daños colaterales insignificantes y una lesión estable y reproducible. En comparación con los métodos de transección publicados anteriormente sin laminectomía10,este método ofrece los beneficios en términos de visualización directa sin manipular la ...

La lesión de la médula espinal (SCI) es un problema médico complejo que resulta en cambios drásticos en la salud y el estilo de vida. No existe una cura para la SCI, y la fisiopatología de sci no se entiende a fondo. Los modelos animal SCI, en particular los modelos de roedores, ofrecen una herramienta invaluable para probar nuevos tratamientos, y se han utilizado para explorar SCI durante décadas. Hasta la fecha, más del 72% de los estudios preclínicos de SCI han empleado modelos de ratas, en comparación con sólo un 16% que han utilizado ratones1. Aunque las ratas, debido a su mayor tamaño y tendencia a formar caries similares a los ICA humanos, han sido tradicionalmente los animales modelo preferidos para el estudio de nuevos enfoques terapéuticos, los ratones (incluyendo muchos modelos de ratón transgénicos) ahora se utilizan con más frecuencia para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del SCI2. El modelo de ratón ofrece beneficios adicionales en términos de manejo más fácil, tasas de reproducción más rápidas y costos más bajos que las ratas; los ratones también presentan un alto grado de similitud genómica con los seres humanos1,2,3. La principal desventaja del modelo de ratón se ha identificado como el tamaño significativamente más pequeño que crea desafíos para las intervenciones quirúrgicas para la creación y el tratamiento de lesiones de la médula espinal4,5.
Hay una brecha en la literatura existente que pone de relieve la necesidad de un protocolo quirúrgico robusto y reproducible para inducir SCI estable en el modelo de ratón. Por lo tanto, proporcionamos un enfoque quirúrgico novedoso y preciso en este protocolo para superar estas limitaciones. Este protocolo proporciona directrices en profundidad para inducir una lesión de tipo transección en ratones, ya que este tipo de lesión ha sido reconocido como el más adecuado para estudiar los cambios regenerativos y degenerativos después de una lesión6,así como la neuroplasticidad, los circuitos neuronales y los enfoques de ingeniería tisular7. Hemos optado por inducir la lesión en la región torácica inferior, ya que el SCI de nivel torácico se utiliza más comúnmente en la literatura1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1036">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BAYT I</td>
			<td style="width:184px;">Post-operative care drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Betadine 500 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">BETA AS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Castroviejo needle holder, locking</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T149C</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TXD101A-X</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Cotton swabs (5pcs)</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">21-893</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dremel Micro</td>
			<td style="width:243px;">DREMEL</td>
			<td style="width:161px;">8050-N/18</td>
			<td>Cordless rotary tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:449px;">Dressing forceps fine</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">06-306</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Drill bits</td>
			<td style="width:243px;">Kemmer Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:161px;">SM 32 M 0550 070</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont #7b forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">11270-20</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumont tweezers, style 5</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T05-822</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Fur trimmer</td>
			<td style="width:243px;">WAHL</td>
			<td style="width:161px;">WA9884-312</td>
			<td>Zero Overlap Hair Trimmer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">TY-3032</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Isoflurane isothesia NXT 250</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">ISOF 00 HS</td>
			<td>Anaesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Colibri Retractor - 4cm</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17000-04</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:243px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:161px;">T133</td>
			<td>Reusable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Signature latex surgical gloves size 7.5</td>
			<td style="width:243px;">Medline</td>
			<td style="width:161px;">MSG5475</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sodium Chloride 0.9%</td>
			<td style="width:243px;">STS</td>
			<td>PHA19042005</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Dressing Pack</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">08-709</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm</td>
			<td style="width:243px;">Multigate</td>
			<td style="width:161px;">29-220</td>
			<td>Single use disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Surgical spirit 100 mL</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;"># SURG SP</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">682G</td>
			<td>Silk Suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2</td>
			<td style="width:243px;">Johnson &#38; Johnson Medical</td>
			<td style="width:161px;">VCP421H</td>
			<td>Vicryl Suture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:449px;">Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)</td>
			<td style="width:243px;">Provet</td>
			<td style="width:161px;">TEMG I</td>
			<td>Post-operative care drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of complete transection-type spinal cord injury in mice

La lesión de la médula espinal (SCI) conduce en gran medida a la pérdida irreversible y permanente de la función, más comúnmente como resultado de un trauma. Se están investigando varias opciones de tratamiento, como los métodos de trasplante celular, para superar las discapacidades debilitantes derivadas del SCI. La mayoría de los ensayos preclínicos en animales se llevan a cabo en modelos de roedores de SCI. Mientras que los modelos de ratas de SCI han sido ampliamente utilizados, los modelos de ratón han recibido menos atención, a pesar de que los modelos de ratón pueden tener ventajas significativas sobre los modelos de ratas. El pequeño tamaño de los ratones equivale a reducir los costos de mantenimiento animal que para las ratas, y la disponibilidad de numerosos modelos de ratón transgénicos es ventajosa para muchos tipos de estudios. Inducir lesiones repetibles y precisas en los animales es el principal desafío para la investigación de SCI, que en pequeños roedores requiere cirugía de alta precisión. El modelo de lesión de tipo transección ha sido un modelo de lesión de uso común durante la última década para la investigación terapéutica basada en trasplantes, sin embargo, no existe un método estandarizado para inducir una lesión completa de tipo de transección en ratones. Hemos desarrollado un protocolo quirúrgico para inducir una lesión de tipo de transección completa en ratones C57BL/6 a nivel vertebral torácico 10 (T10). El procedimiento utiliza un pequeño taladro de punta en lugar de rongeurs para eliminar con precisión la lámina, después de lo cual se utiliza una hoja delgada con filo de corte redondeado para inducir la transección de la médula espinal. Este método conduce a lesiones reproducibles de tipo transección en pequeños roedores con un daño muscular y óseo colateral mínimo y, por lo tanto, minimiza los factores de confusión, específicamente cuando se analizan los resultados funcionales conductuales.

El método resultante, tal como se muestra en la Figura 1,implica una estabilización adecuada del ratón (Figura 1A) y una buena visualización de la columna vertebral y el tejido paraspinos (Figura 1B). El proceso espinoso y las láminas se pueden visualizar claramente con una mínima disección muscular y pérdida de sangre(Figura 1C,zona resaltada). La perforación de punta fina se realiza como se m...

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Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Este protocolo proporciona una lesión precisa y controlada quirúrgicamente para inducir una transección completa de la médula espinal en ratones con una alta reproducibilidad y tasas de supervivencia muy altas. El uso de un taladro fino para la lesión ósea minimiza el daño al tejido circundante, permitiendo que las respuestas de la lesión y el tratamiento se modelen con mayor precisión. Para realizar una laminectomía, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en una hembra anestesada de ocho a 10 semanas de edad C57 negro 6 ratón, afeitar la piel de la espalda para exponer el área quirúrgica sobre la columna dorsal y esterilizar la zona afeitada con hisopos de algodón estéril empapados en povidona yodo antiséptico líquido y espíritu quirúrgico.Usando un bisturí, haz una incisión vertical de línea media a nivel vertebral T10 y usa fórceps rectos para levantar la piel de la fascia subyacente para facilitar la colocación del retractor. Para exponer las espinas de las vértebras T9 a T11, utilice el borde romo del bisturí para hacer una pequeña incisión de línea media en el tejido subcutáneo y fascia subyacente y utilice fórceps no afilados de punta fina para difundirse y reflejar la fascia. Para exponer las láminas, utilice la punta contundente del bisturí para dividir el tronco dorsal y los músculos paraspinos a lo largo de las espinas del T9 a través de las vértebras T11 y utilice los fórceps finos contundentes para diseccionar los músculos de las capas para exponer las láminas de las vértebras.Utilice los mismos fórceps para hacer pequeños bolsillos alrededor de los procesos transversales de la vértebra T10 y enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo los procesos transversales dentro de los bolsillos creados para estabilizar el cuerpo vertebral T10. Enjuague bien las láminas T10 con solución salina tibia y use hisopos de algodón para limpiar suavemente la superficie ósea, teniendo cuidado de que no queden accesorios musculares o ligamentos a lo largo de la superficie bilateral. Para romper las láminas bilateralmente, utilice una punta de broca de siete milímetros de diámetro y siete milímetros de longitud para trazar un camino vertical desde el espacio intervertebral T9/T10 hasta el espacio intervertebral T10/T11 a lo largo de ambos laminados T10 con el taladro apagado.Cuando el camino haya sido trazado, encienda el taladro y haga lentamente y cuidadosamente una zanja vertical en la lámina derecha de la vértebra T10, utilizando los fórceps curvos para mantener la vértebra estable. Después de repetir el proceso en el lado izquierdo de la lámina, irrigar el tejido con solución salina tibia para lavar los fragmentos óseos restantes. Mantener un buen agarre en la columna vertebral con una mano es esencial para este paso.También es importante sentirse cómodo y seguro con el uso del taladro. A continuación, utilice los fórceps de punta fina en ángulo para agarrar el proceso espinoso y eliminar todo el segmento dorsal de las láminas separados por la perforación bilateral. Luego, irrigar y hisopo según sea necesario para permitir una visualización clara de la médula espinal dentro de la ventana de laminectomía.Para inducir la lesión de la médula espinal dentro de la cuerda expuesta, utilice una cuchilla estrecha y redonda con filo para cortar la cuerda en el centro de la ventana de laminectomía, teniendo cuidado de barrer los huecos laterales de la columna vertebral para inducir una lesión de transección completa. Para confirmar la integridad de la lesión por transección, utilice los fórceps de punta fina contundentes para eliminar las conexiones restantes en el sitio de transección. Una vez que se ha logrado la hemostasia en el sitio de la transección, suelte el agarre del forcep curvo en la vértebra T10 y reúna los bordes de los músculos diseccionados a lo largo de la línea media para lograr una buena aposición.Usando 5/0 poliglactin 910 suturas absorbibles, suturar los músculos en capas, asegurándose de que la curvatura natural de la columna vertebral no causa ninguna tensión en la línea de sutura o abrir las suturas. Luego, utilice suturas de seda no absorbibles 5/0 para cerrar el tejido subcutáneo y la piel, teniendo cuidado de que no haya sangrado, coágulos o restos que queden debajo de la piel antes del cierre. Para evaluar si este método para inducir la lesión de la médula espinal de tipo transección en ratones es reproducible y consistente, la médula espinal lesionada se puede analizar mediante inmunohistoquímica y se pueden realizar pruebas conductuales en los ratones.El inmunoetiquedo contra el marcador de astrocitos, proteína ácida fibribrillaria glial, facilita la demarcación del límite de la médula espinal intacta. En esta sección longitudinal, el lugar de la lesión situado se puede visualizar entre los tocones del cordón como se esperaba. Un defecto de tamaño consistente se puede inducir en el sitio de transección con una distancia mínima media de 550,4, más o menos 17,3 micrómetros.Los datos conductuales que despliegan la escala de ratón Basso de una prueba de campo abierto muestran que los ratones lesionados no presentan ningún movimiento de las extremidades posteriores después de la lesión. Por lo tanto, el protocolo produce una lesión completa y fiable del tipo de transección que resulta en una pérdida completa de la función por debajo del nivel de lesión que no conduce a la reversión espontánea de la parálisis. Tenga cuidado de perforar en línea recta con una mano estable, ya que puede ser muy difícil reparar la ventana de laminectomía una vez que se ha perforado incorrectamente.Después de la inducción de la lesión de la médula espinal, se pueden aplicar varias opciones de tratamiento, como la administración de medicamentos y el trasplante celular para identificar posibles terapias que mejoren la recuperación de lesiones de la médula espinal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

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Investigación

Neurociencias

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

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Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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