Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

نشكر شارلين مردوخ ومرافق معهد بابراهام على دعمها. وقد تم دعم JLP من قبل صندوق ويلكوم (093970/Z/10/Z) و OC مدعوم من قبل ERC 638426 و BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

في هذه الورقة، يظهر بروتوكول Worm-to-CT على أنه طريقة سريعة وفعالة لاستخراج الحمض النووي الريبي من الديدان المفردة أو مجموعة صغيرة من الديدان. إن الإنتاجية العالية التي يوفرها نظام النانولوريدك تجعله مثالياً للقياس الكمي لقياسات التباين بين الأفراد. وعلاوة على ذلك، فإن الحساسية العالية لهذه الطريقة تسمح بالكشف عن الجينات التي يتم التعبير عنها بمستويات منخفضة تقل عن الكشف عند استخدام تقنيات RNA-seq أحادية الدودة9.
عند النظر في اختيار طريقة لإعداد cDNA من الديدان واحدة. Ly وآخرون29 الأمثل بروتوكول الذي يعتمد على البروتينات K للهضم بشرة. بشرة هو عقبة رئيسية لعزل الجزيئات من الديدان والبروتينات K يوفر طريقة فعالة لكسره. ومع ذلك، البروتينات K يجب أن تكون غير تنشيط الحرارة لتكون قادرة على استخدام الإنزيمات للنسخ العكسي. في حين أن Ly et al. استخدم التعرض 10 دقائق إلى 96 درجة مئوية ، تم تجنب هذه الخطوة في هذا البروتوكول لأن الحمض النووي الريبي قابل للتحلل بسهولة. بدلا من استخدام البروتينات K، واستخدمت دورات تجميد ذوبان المتكرر لكسر بشرة. التجميد ذوبان هو وسيلة فعالة لكسر بشرة لأنه يمكن عزل أكثر RNA لكل دودة. Ly وآخرون أن مجموع RNA المستخرج لكل دودة هو 35 نانوغرام باستخدام البروتينات K، في حين أن هذا البروتوكول يحصل على 51.75 نانوغرام ± 6.74 SEM من مجموع RNA لكل دودة. تجنب التعرض للحرارة إلى جانب خطوات التضخيم على ما يبدو يوسع نطاق دودة إلى CT الديناميكية للكشف مقارنة مع البروتوكولات القياسية. تقرير Ly et al. قيم Ct المطلقة من 21.1 ± 0.15 لhsp-16.2 و 22.8 ± 0.17 لhsp-70 بعد الصدمة الحرارية. باستخدام نفس ظروف الصدمة الحرارية (1 ساعة عند 30 درجة مئوية)، يحصل هذا البروتوكول على قيم Ct مطلقة من 17.93 ± 0.57 لhsp-16.2 و 21.13 ±0.33 لhsp-70. وهذا يشير إلى أن طريقة التجميد- ذوبان الجليد توفر غلة أعلى من الحمض النووي الريبي وأكثر ملاءمة للنصوص التعبيرية بشكل منخفض.
نظم Nanofluidic مثالية عند التحقيق في مجموعة معينة من النصوص الهدف واستخدام إما أصغر (رقاقة متعددة الصفائف) أو أكبر (شريحة واحدة صفائف) عدد من العينات السماح التكيف مع حجم التجربة. للحصول على صورة غير متحيزة لجميع النصوص التي تم التعبير عنها في دودة واحدة ، فإن الخيار الواضح هو استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تركيز التجربة هو مجموعة أصغر ولكن لا تزال كبيرة نسبيا من الجينات المستهدفة، فمن الأكثر فعالية من حيث التكلفة لاستخدام هذا البروتوكول، شريطة أن يكون الباحث لديه إمكانية الوصول إلى آلة PCR نانوفلوريدس. وتقدر تكلفة الكواشف النظام النانوي والشريحة ذات الصفيف الواحد بنحو 13 جنيها استرلينيا لكل دودة، في حين أن تكاليف الكواشف لتسلسل الدودة الواحدة ستكون حوالي 60 جنيها استرلينيا لكل دودة، ولا تشمل تكاليف التسلسل.
عند النظر في ما PCR منصة لاستخدام, الدودة إلى CT طريقة مقرونة إلى qPCR nanofluidic يوفر مزايا فيما يتعلق بالوقت والإنتاجية. من الممكن الحصول على 9,216 نتائج RT-qPCR في ما يقرب من يومين من العمل، في حين أن تضخيم نفس العدد من الأهداف باستخدام منصة QPCR القياسية سيستغرق حوالي 5 أسابيع عمل باستخدام 96 طبق جيدا المقايسات، تشغيل أربع لوحات في اليوم. ومع ذلك، إذا كان عدد الأهداف التي سيتم اختبارها أصغر، فمن الأكثر فعالية من حيث التكلفة استخدام Worm-to-CT إلى جهاز qPCR قياسي. لا يمكن إعادة تشغيل رقائق الصفيف المفرد، لذلك يقلل تشغيل الآبار الفارغة من كفاءة التكلفة.
أحد قيود الأسلوب هو التشكيل المحتمل للتممير التمهيدي أثناء الخطوة متعددة، ولكن يحدث هذا في أقل من 1٪ من الحالات. على الرغم من أن بروتوكول Worm-to-CT فعال ويوفر نتائج موثوقة عند تطبيقها على الديدان المفردة، إلا أن هناك معدل فشل يبلغ حوالي 5٪، والذي من المرجح أن يتوافق مع الحالات التي تظل فيها الدودة محاصرة في الغطاء أو الجزء العلوي من الأنبوب أثناء خطوة الحصاد.
معا، وهذا الأسلوب تنوعا وموثوق بها يوفر زيادة الإنتاجية والحساسية مقارنة مع تقنيات أكثر القياسية. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة جدا للتحقق من الشاشات عالية الإنتاجية، وهي خيار ممتاز إما لرصد أو التحقق من صحة مستويات التعبير الجيني دودة واحدة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على تقنيات أخرى صعبة، مثل كمية التعبير الجيني من الأنسجة المعزولة. على سبيل المثال، إن عزل الأنسجة الكاملة، مثل الأمعاء أو الدناد أو الخلايا المعزولة بواسطة FACs، يوفر ما يكفي من المواد لإجراء تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. غير أن كميات محدودة من المواد كثيرا ما تؤدي إلى تكرار القراءة، مما يحول دون كمية النصوص النادرة. في هذا السيناريو، استخدام تكنولوجيا نانوفليديس القائمة يجب أن توفر حساسية إضافية للتجارب وزيادة كفاءة التكلفة إذا كان الباحثون بحاجة إلى رصد مجموعة فرعية فقط من جميع النصوص في تلك الأنسجة أو الخلايا.

وكشف الأمثل من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وqPCR أن النبضات النسخي أو رشقات نارية يمكن أن يؤدي إلى تباين هائل في عدد جزيئات الحمض النووي الريبي لكل خلية1. وعلاوة على ذلك، كشفت هذه التكنولوجيات عن عدم تجانس خلوي كبير لم يسبق أن فاتته القياسات القياسية لتكون الكميات الكبيرة. اعتمادا على السياق، بعض الخلية المفردة يحدث تقلب النسخ عن تكوين مختلط الخلوية الأنسجة. ومع ذلك، حتى في مجموعات الخلايا الأيزوجينية التي تزرع في ظل نفس البيئة هناك عدم التجانس النسخي واسع الانتشار2،3. يتم تحديد هذا "التغير البيولوجي" بشكل متزايد كخاصية في كل مكان من الشبكات الخلوية ، من البكتيريا إلى الإنسان. في بعض الحالات، يمكن أن يكون لها عواقب فينونتيبيك في التنمية، وتطور السرطان، الكمون فيروس نقص المناعة البشرية، والاستجابة للعلاج الكيميائي4،5.
الخيطية Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذج فريد مع خصائص مثالية لدراسة أسباب وعواقب التقلبات البيولوجية بين الأفراد. هذه الديدان الخيطية هي كائن حي نموذج بسيط يتكون من 959 خلية ، و بشرة شفافة تجعلها قابلة للتصوير في دراسات التصوير في الجسم الحي6. C. elegans هو نوع من الهرمفروديتيك الذي يتكاثر في الغالب من خلال الإخصاب الذاتي; وأدى ذلك إلى سلالات مختبرية ايزوجينية. على الرغم من الأيزوجينية وظروف الثقافة الخاضعة للرقابة ، فإن العديد من الأنماط الظاهرية والنصوص متغيرة عبر الأفراد ، مما يشير إلى أن الاختلافات العشوائية أو البيئة الدقيقة تساهم في عدم التغايرية عبر الأفراد7،8. مثل هذا التباين في التعبير الجيني له عواقب اللياقة البدنية متعددة، بما في ذلك التباين في البراعة من الطفرات، والبقاء على قيد الحياة، وتوقيت النمو، والتقيّد7،8،9. وبسبب هذه السمات، توفر دراسات الدودة الواحدة فرصة غير مسبوقة لدراسة التقلبات البيولوجية في كائن حي كامل.
هناك حاجة أساسية في هذا المجال لتطوير وتحسين التكنولوجيات للكشف الدقيق عن النصوص على مستوى دودة واحدة. تقنيات جديدة، مثل دودة واحدة RNA تسلسل10، الجيش الملكي النيبالي تسلسل من الأنسجة المعزولة11، وتسلسل وحيد الخلية12 متاحة الآن لC. elegans. ومع ذلك ، يبقى التحدي الرئيسي: عند رصد بينية ، الجينات التي أعرب عنها بشكل ضعيف غالبا ما تقع دون مستويات يمكن اكتشافها13. وهذا أمر ذو صلة خاصة بالنسبة للنصوص النادرة المعزولة عن كميات صغيرة من مواد البداية، حيث توجد علاقة راسخة ومعكوسة بين التعبير المتوسط والتباين التقني، مما يتسبب في كثير من الأحيان في انخفاض النسخ النادرة إلى ما دون القطع الإحصائي13. وقد ثبت أن الأمثل من التكنولوجيات ذات القدرة الإنتاجية عالية متعددة qPCR مفيدة للثدييات دراسات الخلية الواحدة، ولا سيما عند دراسة التعبير عن النصوص النادرة14،15. ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا أيضا لأغراض القياس والتحقق من التكنولوجيات الأخرى ذات الديدان الواحدة.
Worm-to-CT هو طريقة سريعة وقوية مقتبسة من مجموعة تستخدم في دراسات بيولوجية الخلية، لإعداد cDNA أحادي الدودة. تم اختيار cDNA التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة إلى جانب تقنية qPCR النانوية المتعددة لأنها توفر إنتاجية تجريبية أعلى ، وهي مجموعة ديناميكية أوسع من الكشف وتم التحقق من صحة أغراض الخلية الواحدة14،15. كما أن إعداد نظام CDNA الموصوف ينطبق أيضاً على الاستخدام مع التكنولوجيات القياسية ل PCR. يتم زيادة الإنتاجية بطريقتين: أولاً ، إعداد cDNA أسرع وأكثر موثوقية من استخراج الـ guanidium thiocyanate-phenol-chloroform التقليدي ، لأن الديدان تضاف مباشرة إلى حاجز التحلل ، مما يتخطى العزل المباشر للرنا القابل للتحلل بسهولة. وثانيا، يؤدي استخدام تكنولوجيات النانو فلوريد إلى زيادة كبيرة في عدد العينات والأهداف التي يمكن تشغيلها في وقت واحد. في هذه الورقة، يتم مقارنة ورقتين: شريحة صفيف واحد ورقاقة متعددة الصفيف. يمكن لشريحة صفيف واحد تشغيل 96 ديدان واحدة و 96 مجموعة التمهيدي، مما أدى إلى 9216 ردود فعل لكل تجربة. ولتحقيق إنتاجية مماثلة باستخدام تقنيات qPCR القياسية سيتطلب 96 تجربة QPCR منفصلة، وذلك باستخدام 96 لوحة بئر. أصغر وأكثر مرونة رقاقة متعددة الصفيف يتكون من ستة 12 × 12 صفائف مما أدى إلى 864 ردود فعل. يتم تعزيز موثوقية الأسلوب الفائق وحساسية بواسطة تكنولوجيا النانو فلوريد والبدء في خطوة قبل التضخيم. ومن المفترض أن تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة مع خوارزمية إحصائية حديثة لاستخراج التباين البيولوجي. يقدم هذا المقال بروتوكول إعداد cDNA السريعة و qPCR عالي الإنتاجية لكل من دودة مفردة و مجموعة من عينات الفيروس المتنقل; سيتم نشر الخوارزمية في مكان آخر. لهذا البروتوكول، ينبغي إعداد تنظيم كل رقاقة قبل التجربة. يعرض الجدول 1 والجدول 2 أمثلة من هذه الخطط لرقاقة صفيف متعدد و صفائف مفردة، على التوالي. وهناك أيضاً نظرات عامة عن بروتوكول Worm-to-CT المفصل في الشكل 1 وتشغيل الرقاقات متعددة الصفيف والصفيف الواحد في الشكل 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

تقدم هذه الورقة نسخة معدلة كمية عالية الإنتاجية من PCR (RT-qPCR) لمقايسة Caenorhabditis elegans سريعة وقوية وحساسة للغاية. يحصل هذا البروتوكول على قياسات دقيقة للتعبير الجيني من الديدان المفردة أو من عينات كبيرة. البروتوكول المعروض هنا يوفر حداثة التكيف من الأساليب القائمة لإعداد الحمض النووي التكميلي (cDNA) مقرونة لمنصة نانوفلوريميك RT-qPCR. الجزء الأول من هذا البروتوكول، المسمى "Worm-to-CT"، يسمح بإنتاج الحمض النووي المباشر من الديدان الخيطية دون الحاجة إلى عزل الحمض النووي الريبي (MRNA) مسبقًا. يزيد من الإنتاجية التجريبية من خلال السماح بإعداد cDNA من 96 ديدان في 3.5 ساعة. ويستخدم الجزء الثاني من البروتوكول التكنولوجيا النانوية الحالية لتشغيل الـ RT-qPCR عالي الإنتاجية على نظام cDNA. هذه الورقة تقيم اثنين من رقائق نانولويديك مختلفة: الأول يدير 96 عينة و 96 هدفا، مما أدى إلى 9216 ردود فعل في ما يقرب من 1.5 أيام من benchwork. يتكون نوع الشريحة الثانية من ستة صفائف 12 × 12 ، مما أدى إلى 864 رد فعل. هنا، يتم إثبات طريقة الدودة إلى المقطعية من خلال قياس مستويات مرنا من الجينات ترميز البروتينات صدمة الحرارة من الديدان واحدة ومن عينات السائبة. المقدمة هي قائمة واسعة من التمهيديات المصممة لتضخيم الحمض النووي الريبي المجهزة لغالبية جينات الترميز داخل جينوم C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

في هذه المقالة يتم وصف بروتوكول عالي الإنتاجية لتحديد سريع وموثوق به لمستويات التعبير الجيني في عينات C. elegans. لا يتطلب هذا البروتوكول عزل RNA وينتج cDNA مباشرة من العينات. ويمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع منصات متعددة متعددة nanofluidic في الوقت الحقيقي عالية الإنتاجية.

عالية الإنتاجية الكمية RT-PCR في عينات C. c.

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

التحديد الكمي "المعلومات المشفرة" واسطة الجينات التعبير مستويات خلال عمر التحوير تحت نطاق واسع "الغذائية التقييد" في C. ايليجانس

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...