Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

We danken Sharlene Murdoch en de Faciliteiten van het Babraham Institute voor hun steun. JLP werd ondersteund door de Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) en OC wordt ondersteund door ERC 638426 en BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel wordt aangetoond dat het Worm-to-CT-protocol een snelle en efficiënte methode is om RNA uit enkele wormen of een kleine pool van wormen te extraheren. De hoge doorvoer die het nanofluïdische systeem biedt, maakt het ideaal voor kwantificering van inter-individuele variabiliteitsmetingen. Bovendien maakt de hoge gevoeligheid van deze methode de detectie mogelijk van genen die worden uitgedrukt op lage niveaus die onder detectie vallen bij het gebruik van RNA-seq-technologieën met één worm9.
Bij het overwegen van de keuze van de methode om cDNA uit enkele wormen voor te bereiden. Ly et al.29 optimaliseert een protocol dat afhankelijk is van proteinase K voor de vertering van nagelriemen. De nagelriem is een belangrijke hindernis voor de isolatie van moleculen van wormen en proteinase K biedt een effectieve methode om het te breken. Proteinase K moet echter warmte-geïnactiveerd worden om enzymen te kunnen gebruiken voor reverse transcriptie. Terwijl Ly et al. een blootstelling van 10 minuten aan 96 °C gebruikten, werd deze stap in dit protocol vermeden omdat RNA gemakkelijk afbreekbaar is. In plaats van proteinase K te gebruiken, werden herhaalde vriesdooicycli gebruikt om de nagelriem te breken. De vriesdooi is een effectieve methode om de nagelriem te breken omdat per worm meer RNA kan worden geïsoleerd. Ly et al. melden dat het totale RNA dat per worm wordt geëxtraheerd 35 ng is met behulp van proteinase K, terwijl dit protocol 51,75 ng ± 6,74 SEM van het totale RNA per worm verkrijgt. Het vermijden van blootstelling aan hitte in combinatie met preamplificatiestappen verruimt blijkbaar worm-naar-CT's dynamische detectiebereik in vergelijking met standaardprotocollen. Ly et al. rapporteren absolute Ct-waarden van 21,1 ± 0,15 voor hsp-16,2 en 22,8 ± 0,17 voor hsp-70 na hitteschok. Met dezelfde hitteschokomstandigheden (1 uur bij 30 °C) verkrijgt dit protocol absolute Ct-waarden van 17,93 ± 0,57 voor hsp-16,2 en 21,13 ±0,33 voor hsp-70. Dit geeft aan dat de freeze-thaw lysis-methode hogere opbrengsten van RNA biedt en meer geschikt is voor laag uitgedrukte transcripties.
Nanofluïdische systemen zijn ideaal bij het onderzoeken van een bepaalde set doeltranscripties en het gebruik van een kleiner (multi-array chip) of een groter (single-array chip) aantal monsters dat aanpassing aan de schaal van het experiment mogelijk maakt. Om een onbevooroordeeld beeld te krijgen van alle transcripties uitgedrukt in een enkele worm, is de voor de hand liggende keuze om RNA-sequencing te gebruiken. Als de focus van het experiment echter een kleinere maar nog steeds relatief grote set doelgenen is, is het kosteneffectiever om dit protocol te gebruiken, op voorwaarde dat de onderzoeker toegang heeft tot een pcr-machine met nanofluïdica. De kosten van de nanofluïdische systeemreagentia en een single-array chip worden geschat op ongeveer £ 13 per worm, terwijl de kosten van de reagentia voor sequencing met één worm ongeveer £ 60 per worm zouden bedragen, exclusief de sequencingkosten.
Bij het overwegen van welk PCR-platform te gebruiken, biedt de Worm-to-CT-methode gekoppeld aan nanofluïdische qPCR voordelen met betrekking tot tijd en doorvoer. Het is mogelijk om 9.216 RT-qPCR-resultaten te verkrijgen in ongeveer 2 dagen werk, terwijl versterking van hetzelfde aantal doelen met behulp van een standaard qPCR-platform ongeveer 5 werkweken zou duren met behulp van 96 putplaattests, met vier platen per dag. Als het aantal te testen doelen echter kleiner is, is het kosteneffectiever om Worm-to-CT te gebruiken in combinatie met een standaard qPCR-machine. De single-array chips kunnen niet opnieuw worden uitgevoerd, dus het uitvoeren van lege putten vermindert de kostenefficiëntie.
Een beperking van de methode is de potentiële vorming van primerprimer dimers tijdens de multiplexing stap, maar dit gebeurt in minder dan 1% van de gevallen. Hoewel het Worm-to-CT-protocol efficiënt is en betrouwbare resultaten biedt wanneer het wordt toegepast op afzonderlijke wormen, is er een faalpercentage van ongeveer 5%, wat waarschijnlijk overeenkomt met gevallen waarin de worm tijdens de oogststap vast blijft zitten in de dop of de bovenkant van de buis.
Samen biedt deze veelzijdige en betrouwbare methode een verhoogde doorvoer en gevoeligheid in vergelijking met meer standaardtechnieken. Deze methode kan zeer nuttig zijn voor de validatie van schermen met een hoge doorvoer en is een uitstekende keuze om genexpressieniveaus met één worm te bewaken of te valideren. Deze methode kan worden toegepast op andere uitdagende technieken, zoals het kwantificeren van genexpressie uit geïsoleerde weefsels. Isolatie van volledige weefsels, zoals de darm, gonaden of cellen geïsoleerd door FACs, biedt bijvoorbeeld voldoende materiaal om RNA-sequencing-experimenten uit te voeren. Beperkte hoeveelheden materiaal leiden echter vaak tot gedupliceerde leesbewerkingen, wat kwantificering van zeldzame transcripties uitsluit. In dit scenario moet het gebruik van op nanofluidics gebaseerde technologie extra gevoeligheid voor de experimenten bieden en de kostenefficiëntie verhogen als de onderzoekers slechts een subset van alle transcripties in die weefsels of cellen hoeven te controleren.

De optimalisatie van eencellige RNA-sequencing en qPCR onthulde dat transcriptiepulsen of bursts kunnen leiden tot enorme variatie in het aantal RNA-moleculen per cel1. Verder ontdekten deze technologieën aanzienlijke cellulaire heterogeniteit die eerder werd gemist door standaard bulktranomic metingen. Afhankelijk van de context wordt enige eencellige transcriptionele variabiliteit veroorzaakt door gemengde cellulaire samenstelling van weefsels. Zelfs in isogene celpopulaties die onder dezelfde omgeving worden gekweekt, is er echter wijdverspreide transcriptie heterogeniteit2,3. Deze 'biologische variabiliteit' wordt steeds meer geïdentificeerd als een alomtegenwoordige eigenschap van cellulaire netwerken, van bacteriën tot de mens. In sommige gevallen kan het fenotypische gevolgen hebben in de ontwikkeling, kankerprogressie, HIV-latentie en respons op chemotherapie4,5.
De nematode Caenorhabditis elegans is een uniek modelorganisme met ideale kenmerken voor het bestuderen van de oorzaken en gevolgen van biologische variabiliteit tussen individuen. Deze nematoden zijn een eenvoudig modelorganisme dat bestaat uit 959 cellen, en hun transparante nagelriem maakt ze vatbaar voor in vivo beeldvormingsstudies6. C. elegans is een hermafrodietsoort die zich voornamelijk voortplant door zelfbevruchting; dit resulteerde in isogene laboratoriumstammen. Ondanks isogeniciteit en gecontroleerde kweekomstandigheden zijn veel fenotypen en transcripties variabel tussen individuen, wat suggereert dat stochastische of micromilieuverschillen bijdragen aan heterogeniteit bij individuen7,8. Een dergelijke variabiliteit in genexpressie heeft meerdere fitnessgevolgen, waaronder variabiliteit in de penetrantie van mutaties, overleving, ontwikkelingstiming en vruchtbaarheid7,8,9. Vanwege deze kenmerken bieden studies met één worm de ongekende mogelijkheid om biologische variabiliteit in een heel organisme te bestuderen.
Er is een fundamentele behoefte in het veld om technologieën te ontwikkelen en te optimaliseren voor nauwkeurige detectie van transcripties op één wormniveau. Nieuwe technologieën, zoals single-worm RNA sequencing10, RNA sequencing uit geïsoleerde weefsels11, en eencellige sequencing12 zijn nu beschikbaar voor C. elegans. Een belangrijke uitdaging blijft echter: bij het monitoren van interindividualiteit vallen zwak uitgedrukte genen vaak onder detecteerbare niveaus13. Dit is met name relevant voor zeldzame transcripties geïsoleerd van kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal, aangezien er een gevestigde, omgekeerde relatie is tussen gemiddelde expressie en technische variantie, waardoor zeldzame transcripties vaak onder statistische cutoffs13vallen . De optimalisatie van high-throughput multiplexed qPCR-technologieën is nuttig gebleken voor eencellige studies bij zoogdieren, met name bij het bestuderen van de expressie van zeldzame transcripties14,15. Deze technologie kan ook worden gebruikt voor benchmarking- en validatiedoeleinden van andere technologieën met één worm.
Worm-naar-CT is een snelle, robuuste methode aangepast aan een kit die wordt gebruikt in celbiologiestudies, voor cDNA-preparaat met één worm. cDNA verkregen door deze methode in combinatie met multiplexed nanofluidic qPCR-technologie werd gekozen omdat het een hogere experimentele doorvoer biedt, een breder dynamisch detectiebereik en is gevalideerd voor eencellige doeleinden14,15. Het beschreven cDNA-preparaat is ook toepasbaar voor gebruik met standaard PCR-technologieën. De doorvoer wordt op twee manieren verhoogd: ten eerste is cDNA-preparaat sneller en betrouwbaarder dan traditionele guanidium thiocyanaat-fenol-chloroformextractie, omdat wormen rechtstreeks aan de lysisbuffer worden toegevoegd, waardoor directe isolatie van gemakkelijk afbreekbaar RNA wordt overgeslagen. Ten tweede verhoogt het gebruik van nanofluïdische technologieën het aantal monsters en doelen dat tegelijkertijd kan worden uitgevoerd aanzienlijk. In dit artikel worden twee chips vergeleken: een single-array chip en een multi-array chip. Een single-array chip kan 96 single worms en 96 primer sets draaien, wat resulteert in 9.216 reacties per experiment. Om een vergelijkbare doorvoer te bereiken met behulp van standaard qPCR-technologieën zouden 96 afzonderlijke qPCR-experimenten nodig zijn, met behulp van 96 putplaten. De kleinere en flexibelere multi-array chip bestaat uit zes 12 x 12 arrays wat resulteert in 864 reacties. De superieure betrouwbaarheid en gevoeligheid van de methode worden versterkt door nanofluïdische technologie en door de introductie van een preamplificatiestap. De methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, is bedoeld om samen met een state-of-the-art statistisch algoritme te worden gebruikt om biologische variantie te extraheren. Dit artikel presenteert het protocol voor snelle cDNA-voorbereiding en qPCR met hoge doorvoer voor zowel single-worm- als batchwormmonsters; het algoritme zal elders worden gepubliceerd. Voor dit protocol moet de organisatie van elke chip voorafgaand aan het experiment worden voorbereid. Tabel 1 en tabel 2 geven voorbeelden van deze plannen voor respectievelijk een multi-array en single-array chip. Er zijn ook overzichten van het Worm-to-CT-protocol dat is beschreven in figuur 1 en waarop de multi-array- en single-arraychips in figuur 2 wordenuitgevoerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

Dit artikel presenteert een high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) test voor Caenorhabditis elegans die snel, robuust en zeer gevoelig is. Dit protocol verkrijgt nauwkeurige metingen van genexpressie uit enkele wormen of uit bulkmonsters. Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe aanpassing van bestaande methoden voor complementaire DNA (cDNA) voorbereiding gekoppeld aan een nanofluïdisch RT-qPCR platform. Het eerste deel van dit protocol, genaamd 'Worm-to-CT', maakt cDNA-productie rechtstreeks uit nematoden mogelijk zonder voorafgaande mRNA-isolatie. Het verhoogt de experimentele doorvoer door de bereiding van cDNA van 96 wormen in 3,5 uur toe te staan. Het tweede deel van het protocol maakt gebruik van bestaande nanofluïdische technologie om RT-qPCR met hoge doorvoer op de cDNA uit te voeren. Dit artikel evalueert twee verschillende nanofluïdische chips: de eerste voert 96 monsters en 96 doelen uit, wat resulteert in 9.216 reacties in ongeveer 1,5 dag benchwork. Het tweede chiptype bestaat uit zes arrays van 12 x 12, wat resulteert in 864 reacties. Hier wordt de Worm-to-CT-methode aangetoond door mRNA-niveaus van genen te kwantificeren die coderen voor hitteschokeiwitten uit enkele wormen en uit bulkmonsters. Provided is een uitgebreide lijst van primers die zijn ontworpen om verwerkt RNA te versterken voor de meerderheid van de codeergenen binnen het C. elegans-genoom.

Validatie van Worm-to-CT als cDNA-bereidingsmethode
Om te testen of het Worm-to-CT-protocol een geldige cDNA-extractiemethode is, werd het vergeleken met standaard guanidium thiocyanaat-fenol-chloroformextractiemethoden. De resultaten zijn weergegeven in figuur 3, waar cDNA werd bereid uit gemiddeld ~ 1.000 wormen met behulp van standaard guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractietechnieken22 en van 30 wormen met behulp van de Worm-to-CT-methode. De monsters werden gelijktijdig geschokt (30 min bij 34 °C). Wereldwijd waren hsp-70 mRNA expressieniveaus per 100 ng van het totale RNA vergelijkbaar met behulp van beide methoden. In het geval van de hoogste hsp-70-expressie (d.w.z. in N2 na hitteschok) waren de expressieniveaus echter hoger met de Worm-to-CT-methode, wat wijst op een verbeterde gevoeligheid.
Om te bepalen of een verwachte afname van hsp-expressie in hsf-1(sy441)23, een mutatie in de belangrijkste transcriptionele regulator van moleculaire chaperonnes23,24, kon worden gereproduceerd, werd transcriptionele chaperonne-inductie na een korte hitteschok vergeleken. Bij beide methoden werd een afname van hsp-70 inductie gedetecteerd bij hsf-1(sy441) dieren. Dit werd verwacht, omdat gemuteerde hsf-1(sy441) dieren een verminderd vermogen vertonen om chaperonnes op te wekken als gevolg van een afknijping in het transactiveringsdomein van HSF-1. Voor guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie hsp70 daalde met 82,7% in vergelijking met controles en 92,3% voor Worm-naar-CT in vergelijking met wilde dieren (Figuur 3). De resultaten waren vergelijkbaar tussen beide methoden en vergelijkbaar met eerdere verslagen23. Deze resultaten geven aan dat de Worm-to-CT-methode een geldig alternatief is voor standaard cDNA-synthesetechnieken.
Validatie van het pcr-platform voor nanofluïdica dat wordt gebruikt om mRNA-doelen te versterken
Om de consistentie van de resultaten te testen met behulp van nanofluïdische qPCR voor transcriptversterking, werden de PCR-resultaten verkregen uit de Worm-to-CT bulkmethode vergeleken op zowel een standaard qPCR-systeem(Tabel van materialen)als een nanofluïdisch qPCR-systeem met behulp van een multi-array chip. De vouwverandering in de expressie van drie verschillende genen, sma-3 (figuur 4A), sma-10 (figuur 4B) en dnj-26, werd gecontroleerd (figuur 4C) bij dieren met een null allel in dbl-1 (dbl-1(nk3))25 in vergelijking met tegenhangers van het wilde type. Dbl-1 codeert de enige ligand van de Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaleringsroute. sma-3 en sma-10 zijn genen die coderen voor SMAD-orthologues, belangrijke componenten van de BMP-signaleringscascade. Dnj-26 codeert een moleculaire chaperonne, een doelwit van BMP-signalering. Deze resultaten laten weinig tot geen verschil zien in de vouwverandering waarbij de resultaten van de twee methoden worden vergeleken, wat resulteert in niet significante P-waarden op respectievelijk 0,3113, 0,2635 en 0,3481 voor sma-3, sma-10en dnj-26. Al met al tonen deze resultaten aan dat de Worm-to-CT-methode die wordt toegepast op bulkmonsters een efficiënte en snelle manier is om RNA uit weinig wormen te extraheren en betrouwbare gegevens biedt in combinatie met standaard PCR-systemen of op hoge doorvoer gebaseerde qPCR-platforms.
Vergelijking tussen de expressieniveaus verkregen door bulkmonsters met gemiddelden verkregen uit enkele wormen
De relatieve expressieniveaus werden berekend aan de hand van cDNA verkregen uit bulkmonsters (25 wormen) of uit gemiddeld 36 enkele wormmonsters (figuur 5). Beide cDNAs werden verkregen met behulp van de Worm-to-CT-methode en versterkt met behulp van nanofluïdische PCR-technologie. Zoals waargenomen in figuur 5A–C, werden voor alle geteste chaperonnes (d.w.z. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70) vergelijkbare expressieniveaus gedetecteerd. Deze resultaten geven aan dat parameters verkregen uit enkele wormen betrouwbaar zijn.
Toepassing van worm-op-CT gekoppeld aan nanofluïdische technologie om single-worm genexpressieparameters te schatten
Omdat de single-array chip het mogelijk maakt om tot 96 doeltranscripties op 96 afzonderlijke monsters te bewaken, is het daarom zeer geschikt om individuele variabiliteit in transcriptexpressie tussen afzonderlijke wormen te bewaken. Figuur 6A geeft een representatief resultaat weer dat de gemiddelde expressie van meerdere hsp-transcripties van enkele wormen na een korte hitteschok laat zien. Zoals waargenomen in de figuur, verschilde de variabiliteit in de expressie van transcripties dramatisch tussen verschillende genen (figuur 6A). Om meer inzicht te krijgen, werd de variatiecoëfficiënt (CV) berekend door de standaardafwijking te delen door het gemiddelde van de expressieniveaus26 (figuur 6B). Drie genen waarvan de CV-waarden eerder door alternatieve methoden zijn geschat, werden gecontroleerd (niet-gepubliceerde gegevens). Twee stabiele transcripties (ife-1 en Y45F10D.4) en één variabele (nlp-2927) toonden hun verwachte variabiliteit. De grafiek geeft ook duidelijk de bekende omgekeerde relatie weer tussen variabiliteitswaarden en expressieniveaus26 (figuur 6B).
Technische replica's zijn van het grootste belang om reproduceerbaarheid bij het gebruik van bulkmonsters te garanderen. Dit is echter niet noodzakelijkerwijs het geval voor eencellige experimenten14,15,28. Om te bepalen of het gebruik van technische replica's nodig is voor parameterschatting bij het gebruik van monsters met één worm, werden 28 individuele wormen geoogst, na een korte hitteschok, en verwerkt met behulp van technische drievouden. De CV-waarden berekend op basis van gegevens met één worm verkregen in drievoud (blauwe stippen in figuur 7, technisch CV) versus die voor elk transcript verkregen van individuele wormen (rode stippen in figuur 7, biologische variabiliteit) werden vergeleken. Voor elk getest transcript waren de technische cv's lager dan de biologische cv's, wat aangeeft dat technische drievouden niet nodig waren voor parameterschatting. Het feit dat technische replica's niet nodig zijn, verhoogt de doorvoer van het experiment zonder de kwaliteit in gevaar te brengen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het Worm-to-CT Protocol. Deze figuur toont een kort overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn om wormen door het Worm-naar-CT-protocol uit te voeren. Er worden twee optionele methoden weergegeven voor de omgekeerde transcriptiestap; dit zijn verwisselbare methoden voor elk type chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> Figuur 2: Overzicht van de bereiding en werking van nanofluïdische qPCR. Deze figuur toont de voorbereidingen voor het uitvoeren van het nanofluïdische qPCR-systeem met behulp van een multi-array chip en een single-array chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> Figuur 3: Worm-naar-CT-protocol op bulkmonsters leverde betrouwbare resultaten op. Vergelijking van worm-op-CT-protocol met reguliere guanidiumthocyanaat-fenol-chloroformextractie22 op bulkmonsters. In overeenstemming met eerdere bevindingen daalden bij hsf-1(sy441)mutanten23de niveaus van hsp-transcripties als reactie op hitteschok. De bovenstaande histogrammen geven de inductie van hsp-70 weer bij afwezigheid van (-), of na (+) een korte hitteschok van 30 min bij 34 °C. De cDNA werd verkregen met behulp van guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie toegepast op 1.000 wormen (links) of met behulp van de Worm-to-CT-methode toegepast op 30 samengevoegde wormen (rechts). De expressieniveaus van hsp-70 per 100 ng van het totale RNA verkregen door elke methode werden vergeleken. Zoals verwacht daalde in hsf-1(sy441) de transcriptionele inductie van hsp-70 als reactie op hitteschok significant met 82,7% met behulp van guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform en met 92,3% met behulp van de Worm-to-CT-methode. De mRNA-spiegels van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. Elke stip vertegenwoordigt een biologische replicatie. Gegevens werden omgezet voor statistische analyse, omdat ze niet voldoen aan de conventies die nodig zijn voor parametrische analyse. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een RM-One-way ANOVA met behulp van Sidak's meervoudige vergelijkingstest. Wildtype = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Balken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> Figuur 4: Expressiepatronen waren consistent tussen standaard qPCR- en nanofluïdische qPCR-systemen. (A) Het expressieniveau van sma-3 (A), sma-10 (B) of dnj-26 (C) mRNA werd bepaald door regelmatige qPCR en nanofluïdische qPCR (multi-array chip) uit drie biologische replica's van cDNA gegenereerd door Worm-naar-CT van de wild type stam (N2) en de dbl-1(nk3) knockout stam25. Relatieve mRNA-expressieniveaus werden voor elke stam bepaald met behulp van de Delta-Ct-methode21. De vouwverandering werd vervolgens bepaald door de expressieniveaus verkregen in dbl-1(nk3) wormen te delen door de overeenkomstige mRNA-niveaus in de N2-stam. Zoals getoond in deelvenster A, waren de patronen consistent voor beide methoden in elke individuele biologische replicatie. (B) en (C) zijn hetzelfde als (A) voor respectievelijk sma-10 en dnj-26 mRNA-niveaus. Doel mRNA niveaus werden genormaliseerd tegen de huishoudgenen cdc-42 en pmp-3. Statistische analyse werd berekend voor elk gen met behulp van een gekoppelde t-test waarbij de resultaten van de drie biologische repliceren werden vergeleken die werden geproduceerd via standaard qPCR en die gegenereerd door nanofluïdische qPCR. De P-waarden van deze vergelijkingen waren respectievelijk 0,3113, 0,2635 en 0,3481 voor sma-3, sma-10en dnj-26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> Figuur 5: Het gebruik van worm-naar-CT-methode op bulkmonsters of op enkele wormen gaf vergelijkbare expressieniveaus wanneer genormaliseerd per worm. De expressieniveaus van (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 en (C) hsp-70 (C12C8.1) werden geanalyseerd bij jongvolwassen dieren bij afwezigheid van hitteschok, hetzij door Worm-to-CT uit te voeren op een bulk van 25 dieren, hetzij op 36 afzonderlijke personen. Toen de gegevens per worm werden genormaliseerd, was er geen significant verschil tussen de niveaus die per worm werden verkregen voor elk transcript met behulp van beide methoden. De mRNA-niveaus van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. Balken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Statistieken = gekoppelde t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> Figuur 6: Rt-qPCR met hoge doorvoer op enkele wormen met behulp van de Worm-to-CT-methode kan de interpersoonlijke variabiliteit in genexpressie monitoren. (A) De gemiddelde expressieniveaus voor 53 transcripties verkregen bij blootstelling aan een korte hitteschok (30 min bij 34 °C). Boxplots vertegenwoordigen de verdeling van de gemiddelde mRNA-expressie van individuele wormen (per individuele worm werden gemiddeld drie technische replica's gebruikt). De stippen vertegenwoordigen expressieniveaus in 28 afzonderlijke wormen. De mRNA-niveaus van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. (B) De coëfficiënt van variatie26 (CV) als functie van de gemiddelde mRNA-expressie voor 53 transcripties na blootstelling aan een korte hitteschok werd berekend op basis van 28 individuele dieren (ruwe gegevens in deelvenster B). De set transcripties omvat de variabele nlp-29 transcriptie 27 en twee stabiele transcripties (ife-1 en Y45F10D.4; ongepubliceerde gegevens). Het CV is de verhouding tussen de standaarddeviatie en het gemiddelde. Dit CV werd gebruikt om de inter-individuele variabiliteit in transcriptie-expressie tussen individuele wormen te schatten. Zoals verwacht, inter-individuele variabiliteit geschaald met verlaagde gemiddelde expressieniveaus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> Figuur 7: Technische repliceringen waren niet nodig bij het analyseren van inter-individuele variabiliteit in genexpressie met behulp van een nanofluïdische chip. De gegevens in deze grafiek werden verkregen in 28 individuele wormen na een korte hitteschok (30 min bij 34 °C). Elke rode stip vertegenwoordigt de variatiecoëfficiënt (CV) van gemiddelde transcriptieexpressieniveaus voor één transcriptie die tussen 28 individuele wormen (bio-CV) wordt getoetst. Elke blauwe stip vertegenwoordigt het CV van expressieniveaus tussen drie technische replica's verkregen uit één worm, per transcriptetest (technisch CV). Deze grafiek laat zien dat de technische variabiliteit (tussen technische replica's) veel lager was dan de biologische variabiliteit (tussen individuele wormen), wat suggereert dat het niet nodig is om technische repliceringen uit te voeren op een nanofluïdische genexpressiearray bij het testen van genexpressie in enkele wormen, vergelijkbaar met eencellige studies14,15,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Lay-out plannen voor een multi-array chip. De bovenstaande tabel toont een eenvoudige lay-out die kan worden gebruikt bij het plannen van een multi-array chiprun. Aan de linkerkant zijn de ruimten die moeten worden gevuld met de primerdoelen van belang en aan de rechterkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met de voorbeelden van belang. Elke test- en samplearray wordt nummergewijs via de chip gekoppeld. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Lay-out plannen voor een chip met één array. De bovenstaande tabel toont een eenvoudige lay-out die kan worden gebruikt bij het plannen van een chiprun met één array. Aan de linkerkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met primerdoelen van belang en aan de rechterkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met de voorbeelden van belang. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Lijst van RT-qPCR-primers die in deze studie worden gebruikt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Primers uit de database van RT-qPCR primers. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...