Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

Nous remercions Sharlene Murdoch et les installations de l’Institut Babraham pour leur soutien. JLP a reçu l’appui du Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) et OC est appuyé par ERC 638426 et BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, le protocole Worm-to-CT s’est montré être une méthode rapide et efficace pour extraire l’ARN de vers simples ou d’un petit bassin de vers. Le débit élevé offert par le système nanofluidique le rend idéal pour la quantification des mesures inter-individuelles de variabilité. En outre, la sensibilité élevée de cette méthode permet la détection des gènes exprimés à de faibles niveaux qui tombent en dessous de la détection lors de l’utilisation de l’ARN-seq technologies à unseul ver 9.
Lors de l’examen du choix de la méthode pour préparer l’ADND à partir de vers simples. Ly et coll.29 ont optimisé un protocole qui repose sur la proteinase K pour la digestion des cuticules. La cuticule est un obstacle majeur pour l’isolement des molécules des vers et proteinase K fournit une méthode efficace pour la briser. Cependant, proteinase K doit être inactivé par la chaleur pour être en mesure d’utiliser des enzymes pour la transcription inverse. Bien que Ly et coll. aient utilisé une exposition de 10 min à 96 °C, cette étape a été évitée dans ce protocole parce que l’ARN est facilement dégradable. Au lieu d’utiliser la proteinase K, des cycles répétés de gel-dégel ont été utilisés pour briser la cuticule. Le gel-dégel est une méthode efficace pour briser la cuticule parce que plus d’ARN peut être isolé par ver. Ly et coll. rapportent que l’ARN total extrait par ver est de 35 ng à l’aide de proteinase K, alors que ce protocole obtient 51,75 ng ± 6,74 SEM d’ARN total par ver. L’évitement de l’exposition à la chaleur couplé à des étapes de préamplification élargit apparemment la gamme dynamique de détection de Worm-to-CT par rapport aux protocoles standard. Ly et coll. rapportent des valeurs ct absolues de 21,1 ± 0,15 pour hsp-16,2 et 22,8 ± 0,17 pour hsp-70 après le choc thermique. Utilisant les mêmes conditions de choc thermique (1 h à 30 °C), ce protocole obtient des valeurs ct absolues de 17,93 ± 0,57 pour hsp-16,2 et 21,13 ±0,33 pour hsp-70. Cela indique que la méthode de lyse gel-dégel offre des rendements plus élevés d’ARN et est plus appropriée pour les transcriptions faiblement exprimées.
Les systèmes nanofluidiques sont idéaux lorsqu’on étudie un ensemble donné de transcriptions cibles et l’utilisation d’échantillons plus petits (puces multi-réseaux) ou plus grands (puce à réseau unique) permettant une adaptation à l’échelle de l’expérience. Pour obtenir une image impartiale de toutes les transcriptions exprimées dans un seul ver, le choix évident est d’utiliser le séquençage de l’ARN. Si, toutefois, l’objectif de l’expérience est un ensemble plus petit mais encore relativement important de gènes cibles, il est plus rentable d’utiliser ce protocole, à condition que le chercheur ait accès à une machine PCR nanofluidique. Le coût des réaugmentés du système nanofluidique et d’une puce à réseau unique est estimé à environ 13 £ par ver, alors que les coûts des réaugmentés pour le séquençage d’un seul ver seraient d’environ £60 par ver, sans compter les coûts de séquençage.
Lors de l’examen de la plate-forme PCR à utiliser, la méthode Worm-to-CT couplée à qPCR nanofluidique offre des avantages en ce qui concerne le temps et le débit. Il est possible d’obtenir 9 216 résultats RT-qPCR en environ 2 jours de travail, alors que l’amplification du même nombre de cibles à l’aide d’une plate-forme qPCR standard prendrait environ 5 semaines de travail à l’aide de 96 analyses de plaques de puits, exécutant quatre plaques par jour. Toutefois, si le nombre de cibles à tester est plus faible, il est plus rentable d’utiliser Worm-to-CT couplé à une machine qPCR standard. Les puces mono-réseau ne peuvent pas être rediffusées, de sorte que l’exploitation de puits vides diminue le rapport coût-efficacité.
Une limitation de la méthode est la formation potentielle de dimers d’amorce-amorce pendant l’étape de multiplexage, mais ceci se produit dans moins de 1% des cas. Bien que le protocole Ver-to-CT soit efficace et donne des résultats fiables lorsqu’il est appliqué aux vers simples, il y a un taux d’échec d’environ 5 %, ce qui correspond probablement aux cas où le ver reste emprisonné dans le bouchon ou le haut du tube pendant l’étape de récolte.
Ensemble, cette méthode polyvalente et fiable offre un débit et une sensibilité accrus par rapport à des techniques plus standard. Cette méthode peut être très utile pour la validation d’écrans à haut débit et est un excellent choix pour surveiller ou valider les niveaux d’expression du gène mono-ver. Cette méthode peut être appliquée à d’autres techniques difficiles, telles que la quantitation de l’expression des gènes à partir de tissus isolés. Par exemple, l’isolement des tissus entiers, comme l’intestin, les 90 ou les cellules isolées par les CFC, fournit suffisamment de matériel pour effectuer des expériences de séquençage de l’ARN. Toutefois, des quantités limitées de documents mènent souvent à des relevés dupliqués, ce qui empêche la quantitation de transcriptions rares. Dans ce scénario, l’utilisation d’une technologie basée sur la nanofluidique devrait fournir une sensibilité accrue aux expériences et augmenter la rentabilité si les chercheurs n’ont besoin de surveiller qu’un sous-ensemble de toutes les transcriptions dans ces tissus ou cellules.

L’optimisation du séquençage de l’ARN unicelliste et qPCR a révélé que les impulsions transcriptionnelles ou les éclats peuvent conduire à une variation massive du nombre de molécules d’ARN par cellule1. En outre, ces technologies ont découvert l’hétérogénéité cellulaire substantielle précédemment manquée par les mesures transcriptomiques en vrac standard. Selon le contexte, une certaine variabilité transcriptionnelle à cellules simples est causée par une composition cellulaire mixte des tissus. Cependant, même dans les populations de cellules isogéniques cultivées dans le même environnement, il existe une hétérogénéité transcriptionnellegénéralisée 2,3. Cette « variabilité biologique » est de plus en plus identifiée comme une propriété omniprésente des réseaux cellulaires, des bactéries à l’homme. Dans certains cas, il peut avoir des conséquences phénotypiques dans le développement, la progression du cancer, la latence du VIH et laréponse à la chimiothérapie 4,5.
Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle unique avec des caractéristiques idéales pour étudier les causes et les conséquences de la variabilité biologique entre les individus. Ces nématodes sont un organisme modèle simple composé de 959 cellules, et leur cuticule transparente les rend agréables pour les études d’imagerie in vivo6. C. elegans est une espèce hermaphroditique qui se reproduit principalement par auto fertilisation; il en est résulté des souches isogéniques en laboratoire. Malgré l’isogénicité et les conditions de culture contrôlées, de nombreux phénotypes et transcriptions sont variables d’un individus à l’autre, ce qui suggère que les différences stochastiques ou microenvironnementales contribuent à l’hétérogénéitéchez les individus 7,8. Une telle variabilité dans l’expression des gènes a de multiples conséquences de forme physique, y compris la variabilité dans la pénétration des mutations, la survie, le moment du développement, et lafécondité 7,8,9. En raison de ces caractéristiques, les études sur les vers uniques offrent l’occasion sans précédent d’étudier la variabilité biologique dans tout un organisme.
Il y a un besoin fondamental sur le terrain de développer et d’optimiser des technologies pour la détection précise des transcriptions à un niveau d’un seul ver. Les nouvelles technologies, telles que le séquençage de l’ARN à un ver10,le séquençage de l’ARN à partir de tissusisolés 11,et le séquençage à cellulessimples 12 sont maintenant disponibles pour C. elegans. Cependant, un défi majeur demeure : lors de la surveillance de l’interindividualité, les gènes faiblement exprimés tombent souvent en dessous des niveauxdétectables 13. Ceci est particulièrement pertinent pour les transcriptions rares isolées de petites quantités de matériel de départ, car il existe une relation bien établie et inverse entre l’expression moyenne et la variance technique, ce qui fait souvent tomber de rares transcriptions en dessous des seuilsstatistiques 13. L’optimisation des technologies qPCR multiplexées à haut débit s’est avérée utile pour les études sur les mammifères unicell cellules, en particulier lors de l’étude de l’expression de transcriptionsrares 14,15. Cette technologie peut également être utilisée à des fins d’analyse comparative et de validation d’autres technologies à vers unique.
Worm-to-CT est une méthode rapide et robuste adaptée d’un kit utilisé dans les études de biologie cellulaire, pour la préparation de l’ADN à un seul ver. cDNA obtenu par cette méthode couplée à la technologie qPCR nanofluidique multiplexée a été choisi parce qu’il fournit un débit expérimental plus élevé, une gamme dynamique plus large de détection et a été validé à des fins unicelliques14,15. La préparation de l’ADND décrite est également applicable aux technologies PCR standard. Le débit est augmenté de deux façons : premièrement, la préparation de l’ADN est plus rapide et plus fiable que l’extraction traditionnelle de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium, parce que les vers sont directement ajoutés au tampon de lyse, en sautant l’isolement direct de l’ARN facilement dégradable. Deuxièmement, l’utilisation de technologies nanofluidiques augmente considérablement le nombre d’échantillons et de cibles qui peuvent être exécutés simultanément. Dans ce document, deux puces sont comparées : une puce à un seul tableau et une puce multi-tableaux. Une puce à réseau unique peut exécuter 96 vers simples et 96 ensembles d’amorce, ce qui entraîne 9 216 réactions par expérience. Pour obtenir un débit similaire à l’aide des technologies qPCR standard, il faudrait 96 expériences qPCR distinctes, utilisant 96 plaques de puits. La puce multi-tableaux plus petite et plus flexible se compose de six tableaux de 12 x 12, ce qui entraîne 864 réactions. La fiabilité et la sensibilité supérieures de la méthode sont renforcées par la technologie nanofluidique et par l’introduction d’une étape de préamplification. La méthode présentée dans cet article est destinée à être utilisée avec un algorithme statistique de pointe pour extraire la variance biologique. Cet article présente le protocole pour la préparation rapide de cDNA et le qPCR à haut débit pour les échantillons de ver simple et de ver de lot ; l’algorithme sera publié ailleurs. Pour ce protocole, l’organisation de chaque puce doit être préparée avant l’expérience. Les tableaux 1 et 2 montrent des exemples de ces plans pour une puce multi-tableaux et à un seul tableau, respectivement. Il y a également des aperçus du protocole Worm-to-CT détaillés à la figure 1 et exécutant les puces multi-tableaux et mono-tableaux de la figure 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

Cet article présente un essai quantitatif de transcription inverse à haut débit PCR (RT-qPCR) pour Caenorhabditis elegans qui est rapide, robuste, et très sensible. Ce protocole obtient des mesures précises de l’expression des gènes à partir de vers simples ou d’échantillons en vrac. Le protocole présenté ici fournit une nouvelle adaptation des méthodes existantes pour la préparation complémentaire de l’ADN (CDNA) couplée à une plate-forme nanofluidique RT-qPCR. La première partie de ce protocole, appelée « Ver-to-CT », permet la production d’ADNd directement à partir de nématodes sans avoir besoin d’isolement antérieur de l’ARNm. Il augmente le débit expérimental en permettant la préparation de l’ADND à partir de 96 vers en 3,5 h. La deuxième partie du protocole utilise la technologie nanofluidique existante pour exécuter rt-qPCR à haut débit sur l’ADND. Cet article évalue deux puces nanofluidiques différentes : la première exécute 96 échantillons et 96 cibles, ce qui entraîne 9 216 réactions en environ 1,5 jour de travail sur le banc. Le deuxième type de puce se compose de six tableaux de 12 x 12, ce qui entraîne 864 réactions. Ici, la méthode ver-to-CT est démontrée en quantifiant les niveaux d’ARNm des gènes codant les protéines de choc thermique à partir de vers simples et d’échantillons en vrac. Une longue liste d’amorces conçues pour amplifier l’ARN traité pour la majorité des gènes codants dans le génome de C. elegans est fournie.

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High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Dans cet article, un protocole à haut débit pour une détermination rapide et fiable des niveaux d’expression des gènes dans des échantillons de C. elegans en vrac ou en vrac est décrit. Ce protocole n’exige pas l’isolement d’ARN et produit l’ADND directement à partir d’échantillons. Il peut être utilisé avec des plates-formes qPCR nanofluidiques multiplexées à haut débit.

Rt-PCR quantitatif à haut débit dans les échantillons de C. elegans en vrac et en vrac à l’aide de la technologie nanofluidique

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

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