Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

Wir danken Sharlene Murdoch und dem Babraham Institute Facilities für ihre Unterstützung. JLP wurde vom Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) und OC wird von ERC 638426 und BBSRC [BBS/E/B000C0426] unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Beitrag wird gezeigt, dass das Worm-to-CT-Protokoll eine schnelle und effiziente Methode ist, um RNA aus einzelnen Würmern oder einem kleinen Pool von Würmern zu extrahieren. Der hohe Durchsatz des nanofluidischen Systems macht es ideal für die Quantifizierung von interindividuellen Variabilitätsmessungen. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Empfindlichkeit dieser Methode den Nachweis von Genen, die auf niedrigen Konzentrationen exprimiert werden, die unter den Nachweis fallen, wenn sie Single-Worm-RNA-seq-Technologien9verwenden.
Bei der Prüfung der Wahl der Methode zur Herstellung von cDNA aus einzelnen Würmern. Ly et al.29 optimierte ein Protokoll, das auf Proteinase K für die Nagelhautverdauung beruht. Die Nagelhaut ist eine große Hürde für die Isolierung von Molekülen von Würmern und Proteinase K bietet eine effektive Methode, um es zu brechen. Proteinase K muss jedoch wärmeinaktiviert werden, um Enzyme zur Umgekehrten Transkription verwenden zu können. Während Ly et al. eine 10 min Exposition bei 96 °C einsetzte, wurde dieser Schritt in diesem Protokoll vermieden, da RNA leicht abbaubar ist. Anstatt Proteinase K zu verwenden, wurden wiederholte Frost-Tau-Zyklen verwendet, um die Nagelhaut zu brechen. Das Frosttau ist eine effektive Methode, um die Nagelhaut zu brechen, da mehr RNA pro Wurm isoliert werden kann. Ly et al. berichten, dass die gesamte RNA pro Wurm 35 ng mit Proteinase K beträgt, während dieses Protokoll 51,75 ng ± 6,74 SEM der gesamten RNA pro Wurm erhält. Die Vermeidung von Wärmeexposition in Verbindung mit Vorverstärkungsschritten erweitert den Dynamikbereich von Worm-to-CT im Vergleich zu Standardprotokollen. Ly et al. melden absolute Ct-Werte von 21,1 ± 0,15 für hsp-16.2 und 22,8 ± 0,17 für hsp-70 nach Hitzeschock. Unter Verwendung der gleichen Hitzeschockbedingungen (1 h bei 30 °C) erhält dieses Protokoll absolute Ct-Werte von 17,93 ± 0,57 für hsp-16.2 und 21.13 ±0.33 für hsp-70. Dies deutet darauf hin, dass die Freeze-Tau-Lyse-Methode höhere RNA-Erträge liefert und für niedrig ausgedrückte Transkripte besser geeignet ist.
Nanofluidische Systeme sind ideal, wenn sie einen bestimmten Satz von Zieltranskripten und die Verwendung einer kleineren (Multi-Array-Chip) oder größeren (Single-Array-Chip) Anzahl von Samples untersuchen, die eine Anpassung an den Umfang des Experiments ermöglichen. Um ein unvoreingenommenes Bild aller Transkripte zu erhalten, die in einem einzigen Wurm ausgedrückt werden, besteht die offensichtliche Wahl darin, die RNA-Sequenzierung zu verwenden. Wenn jedoch der Fokus des Experiments auf einem kleineren, aber immer noch relativ großen Satz von Zielgenen liegt, ist es kostengünstiger, dieses Protokoll zu nutzen, vorausgesetzt, der Forscher hat Zugang zu einer Nanofluidik-PCR-Maschine. Die Kosten für die nanofluidischen Systemreagenzien und einen Single-Array-Chip werden auf etwa 13 USD pro Wurm geschätzt, während die Kosten der Reagenzien für die Sequenzierung von Einschnecken etwa 60 USD pro Wurm betragen würden, ohne die Sequenzierungskosten.
Bei der Betrachtung, welche PCR-Plattform verwendet werden soll, bietet die Mit-Wurm-zu-CT-Methode, die an nanofluidische qPCR gekoppelt ist, Vorteile in Bezug auf Zeit und Durchsatz. Es ist möglich, 9.216 RT-qPCR Ergebnisse in ca. 2 Tagen Arbeit zu erhalten, während die Verstärkung der gleichen Anzahl von Zielen mit einer Standard-qPCR-Plattform etwa 5 Arbeitswochen mit 96 Well-Platten-Assays in Anspruch nehmen würde, wobei vier Platten pro Tag laufen würden. Wenn jedoch die Anzahl der zu testenden Ziele kleiner ist, ist es kostengünstiger, Worm-to-CT in Verbindung mit einer Standard-qPCR-Maschine zu verwenden. Die Single-Array-Chips können nicht erneut ausgeführt werden, sodass leerstehende Brunnen die Kosteneffizienz verringern.
Eine Einschränkung der Methode ist die mögliche Bildung von Primer-Primer-Dimern während des Multiplexing-Schritts, aber dies tritt in weniger als 1% der Fälle auf. Obwohl das Worm-to-CT-Protokoll effizient ist und zuverlässige Ergebnisse liefert, wenn es auf einzelne Würmer angewendet wird, gibt es eine Ausfallrate von etwa 5%, was wahrscheinlich den Fällen entspricht, in denen der Wurm während des Ernteschritts in der Kappe oder der Oberseite des Rohres gefangen bleibt.
Zusammen bietet diese vielseitige und zuverlässige Methode einen höheren Durchsatz und eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Standardtechniken. Diese Methode kann sehr nützlich für die Validierung von Bildschirmen mit hohem Durchsatz sein und ist eine ausgezeichnete Wahl, um die Expressionsniveaus von Single-Worm-Genen zu überwachen oder zu validieren. Diese Methode kann auf andere anspruchsvolle Techniken angewendet werden, wie die Quantifizierung der Genexpression aus isolierten Geweben. Beispielsweise bietet die Isolierung von vollwertigem Gewebe, wie Darm, Gonaden oder zellen, die durch FACs isoliert wurden, genügend Material, um RNA-Sequenzierungsexperimente durchzuführen. Allerdings führen begrenzte Mengen an Material oft zu doppelten Lesevorgängen, was die Quantifizierung seltener Transkripte ausschließt. In diesem Szenario sollte die Verwendung von Nanofluidics-basierter Technologie eine zusätzliche Empfindlichkeit für die Experimente bieten und die Kosteneffizienz erhöhen, wenn die Forscher nur eine Teilmenge aller Transkripte in diesen Geweben oder Zellen überwachen müssen.

Die Optimierung der einzelligen RNA-Sequenzierung und qPCR ergab, dass Transkriptionsimpulse oder -bursts zu massiven Schwankungen in der Anzahl der RNA-Moleküle pro Zelle1führen können. Darüber hinaus deckten diese Technologien eine erhebliche zelluläre Heterogenität auf, die zuvor bei Standard-Massen-Transkriptomikmessungen übersehen wurde. Je nach Kontext wird eine gewisse singlezellige transkriptionelle Variabilität durch gemischte zelluläre Zusammensetzung von Geweben verursacht. Aber auch bei isogenen Zellpopulationen, die unter der gleichen Umgebung angebaut werden, gibt es eine weit verbreitete Transkriptionsheterogenität2,3. Diese "biologische Variabilität" wird zunehmend als allgegenwärtige Eigenschaft von Mobilfunknetzen identifiziert, von Bakterien bis zum Menschen. In einigen Fällen kann es phänotypische Folgen in der Entwicklung, Krebsprogression, HIV-Latenz und Reaktion auf Chemotherapie4,5haben.
Die Nematode Caenorhabditis elegans ist ein einzigartiger Modellorganismus mit idealen Eigenschaften für die Untersuchung der Ursachen und Folgen der biologischen Variabilität zwischen Individuen. Diese Nematoden sind ein einfacher Modellorganismus, der aus 959 Zellen besteht, und ihre transparente Nagelhaut macht sie für in vivo bildgebende Studien zugänglich6. C. elegans ist eine hermaphroditische Art, die sich überwiegend durch Selbstbefruchtung reproduziert; dies führte zu isogenen Laborstämmen. Trotz Isogenität und kontrollierten Kulturbedingungen sind viele Phänotypen und Transkripte individuell variabel, was darauf hindeutet, dass stochastische oder mikroökologische Unterschiede zur Heterogenität bei Individuen beitragen7,8. Eine solche Variabilität in der Genexpression hat mehrere Fitness-Folgen, einschließlich Variabilität in der Penetranz von Mutationen, Überleben, Entwicklungszeitpunkt, und Fecundity7,8,9. Aufgrund dieser Merkmale bieten Einzelwurmstudien die beispiellose Möglichkeit, biologische Variabilität in einem ganzen Organismus zu untersuchen.
Vor Ort besteht ein grundlegender Bedarf an der Entwicklung und Optimierung von Technologien zur genauen Erkennung von Transkripten auf einer Ebene mit einem einzigen Wurm. Neue Technologien wie die Sequenzierung von Einwurm-RNA10, die RNA-Sequenzierung aus isolierten Geweben11und die einzellige Sequenzierung12 sind jetzt für C. elegansverfügbar. Eine große Herausforderung bleibt jedoch: Bei der Überwachung der Interindividualität fallen schwach exprimierte Gene oft unter den nachweisbaren Niveau13. Dies ist besonders relevant für seltene Transkripte, die aus kleinen Mengen an Ausgangsmaterial isoliert sind, da es eine gut etablierte, umgekehrte Beziehung zwischen mittlerer Expression und technischer Varianz gibt, was häufig dazu führt, dass seltene Transkripte unter die statistischen Cutoffsfallen 13. Die Optimierung von multiplexed qPCR-Technologien mit hohem Durchsatz hat sich für einzelzellige Säugetierstudien als nützlich erwiesen, insbesondere bei der Untersuchung der Expression seltener Transkripte14,15. Diese Technologie kann auch für Benchmarking- und Validierungszwecke anderer Einzelschneckentechnologien verwendet werden.
Worm-to-CT ist eine schnelle, robuste Methode, die von einem Kit angepasst wird, das in zellbiologischen Studien zur Herstellung von CDNA-Präparationen mit einem Einzigen-Wurm verwendet wird. cDNA, die mit dieser Methode in Verbindung mit der multiplexierten nanofluidischen qPCR-Technologie gewonnen wurde, wurde ausgewählt, weil sie einen höheren experimentellen Durchsatz, einen breiteren dynamischen Erfassungsbereich bietet und für einzellige Zwecke14,15validiert wurde. Die beschriebene cDNA-Präparation ist auch für den Einsatz mit Standard-PCR-Technologien geeignet. Der Durchsatz wird auf zwei Arten erhöht: Erstens ist die cDNA-Präparation schneller und zuverlässiger als die herkömmliche Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, da Würmer direkt zum Lysepuffer hinzugefügt werden, wodurch die direkte Isolierung leicht abbaubarer RNA übersprungen wird. Zweitens erhöht die Verwendung nanofluidischer Technologien die Anzahl der Proben und Targets, die gleichzeitig ausgeführt werden können, erheblich. In diesem Papier werden zwei Chips verglichen: ein Single-Array-Chip und ein Multi-Array-Chip. Ein Single-Array-Chip kann 96 einzelne Würmer und 96 Primer-Sets ausführen, was zu 9.216 Reaktionen pro Experiment führt. Um einen ähnlichen Durchsatz mit Standard-qPCR-Technologien zu erreichen, wären 96 separate qPCR-Experimente mit 96 Well-Platten erforderlich. Der kleinere und flexiblere Multi-Array-Chip besteht aus sechs 12 x 12 Arrays, was zu 864 Reaktionen führt. Die überlegene Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit der Methode wird durch die nanofluidische Technologie und die Einführung eines Vorverstärkungsschritts verstärkt. Die in diesem Beitrag vorgestellte Methode soll zusammen mit einem hochmodernen statistischen Algorithmus zur Extraktion biologischer Varianz verwendet werden. Dieser Artikel stellt das Protokoll für die schnelle cDNA-Vorbereitung und qPCR mit hohem Durchsatz für Einzel-Wurm- und Batch-Wurmproben vor. der Algorithmus wird an anderer Stelle veröffentlicht. Für dieses Protokoll sollte die Organisation der einzelnen Chips vor dem Experiment vorbereitet werden. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen Beispiele für diese Pläne für einen Multi-Array- bzw. Single-Array-Chip. Es gibt auch Übersichten über das Worm-to-CT-Protokoll, das in Abbildung 1 beschrieben ist und die Multi-Array- und Single-Array-Chips in Abbildung 2ausführt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

Dieses Papier stellt einen quantitativen PCR-Assay (RT-qPCR) mit hohem Durchsatz für Caenorhabditis elegans vor, der schnell, robust und hochsensibel ist. Dieses Protokoll erhält präzise Messungen der Genexpression von einzelnen Würmern oder massenhaften Proben. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine neuartige Anpassung bestehender Methoden zur komplementären DNA-Vorbereitung (cDNA) gekoppelt an eine nanofluidische RT-qPCR-Plattform. Der erste Teil dieses Protokolls mit dem Namen "Worm-to-CT" ermöglicht die cDNA-Produktion direkt aus Nematoden, ohne dass eine vorherige mRNA-Isolierung erforderlich ist. Es erhöht den experimentellen Durchsatz, indem es die Herstellung von cDNA aus 96 Würmern in 3,5 h ermöglicht. Der zweite Teil des Protokolls verwendet vorhandene nanofluidische Technologie, um RT-qPCR mit hohem Durchsatz auf der cDNA auszuführen. Dieses Papier bewertet zwei verschiedene nanofluidische Chips: die erste läuft 96 Proben und 96 Targets, was zu 9.216 Reaktionen in etwa 1,5 Tagen Bankarbeit führt. Der zweite Chiptyp besteht aus sechs 12 x 12 Arrays, was zu 864 Reaktionen führt. Hier wird die Worm-to-CT-Methode durch Quantifizierung des mRNA-Spiegels von Genen demonstriert, die Wärmeschockproteine aus einzelnen Würmern und massenhaften Proben kodieren. Zur Verfügung gestellt ist eine umfangreiche Liste von Primern, die entwickelt wurden, um verarbeitete RNA für die Mehrheit der kodierenden Gene innerhalb des C. elegans Genoms zu verstärken.

Validierung von Worm-to-CT als cDNA-Vorbereitungsmethode
Um zu testen, ob das Worm-to-CT-Protokoll eine gültige cDNA-Extraktionsmethode ist, wurde es mit Standard-Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethoden verglichen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt, in der cDNA aus durchschnittlich 1.000 Würmern mit Standard-Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionstechniken22 und von 30 Würmern mit der Worm-to-CT-Methode hergestellt wurde. Die Proben wurden gleichzeitig hitzegeschockt (30 min bei 34 °C). Weltweit waren hsp-70 mRNA-Expressionsniveaus pro 100 ng der gesamten RNA mit beiden Methoden vergleichbar. Bei der höchsten hsp-70-Expression (d. h. in N2 nach Hitzeschock) waren die Expressionswerte jedoch mit der Worm-to-CT-Methode höher, was auf eine verbesserte Empfindlichkeit hindeutet.
Um festzustellen, ob eine erwartete Abnahme der hsp-Expression in hsf-1(sy441)23, eine Mutation im Haupttranskriptionsregulator der molekularen Chaperone23,24, reproduziert werden konnte, wurde transkriptionelle Chaperoninduktion nach einem kurzen Hitzeschock verglichen. Mit beiden Methoden wurde bei hsf-1(sy441) Tieren eine Abnahme der hsp-70-Induktion festgestellt. Dies wurde erwartet, da mutierte hsf-1(sy441) Tiere eine verminderte Fähigkeit aufweisen, Chaperones aufgrund einer Kürzung in der Transaktivierungsdomäne von HSF-1 zu induzieren. Bei Guanidium Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion verringerte sich hsp70 im Vergleich zu Kontrollen um 82,7 % und bei Wurm-zu-CT um 92,3 % im Vergleich zu Wildtieren(Abbildung 3). Die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen beiden Methoden und vergleichbar mit früheren Berichten23. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Worm-to-CT-Methode eine gültige Alternative zu Standard-cDNA-Synthesetechniken ist.
Validierung der Nanofluidics PCR-Plattform zur Verstärkung von mRNA-Zielen
Um die Konsistenz der Ergebnisse mit nanofluidischer qPCR für die Transkriptverstärkung zu testen, wurden die PCR-Ergebnisse aus der Worm-to-CT-Massenmethode sowohl auf einem Standard-qPCR-System(Materialtabelle)als auch auf einem nanofluidischen qPCR-System mit einem Multi-Array-Chip verglichen. Die Faltenveränderung in der Expression von drei verschiedenen Genen, sma-3 (Abbildung 4A), sma-10 (Abbildung 4B) und dnj-26, wurde bei Tieren, die ein Nullallel in dbl-1 (dbl-1(nk3))25 im Vergleich zu wilden Typ-Gegenstücken tragen, überwacht (Abbildung 4C). Dbl-1 kodiert den alleinigen Liganden des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalwegs. sma-3 und sma-10 sind Gene, die SMAD-Orthologe kodieren, Schlüsselkomponenten der BMP-Signalkaskade. Dnj-26 kodiert ein molekulares Chaperon, ein Ziel der BMP-Signalisierung. Diese Ergebnisse zeigen wenig bis keinen Unterschied in der Faltänderung, die die Ergebnisse der beiden Methoden vergleicht, was zu nicht signifikanten P-Werten bei 0,3113, 0,2635 und 0,3481 für sma-3, sma-10bzw. dnj-26führt. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Auf bulk-to-CT-Methode angewendete Worm-to-CT-Methode eine effiziente und schnelle Möglichkeit ist, RNA aus wenigen Würmern zu extrahieren, und liefert zuverlässige Daten, wenn sie entweder mit Standard-PCR-Systemen oder nanofluidischen Hochdurchsatz-Plattformen auf Basis von Nanofluidik gekoppelt sind.
Vergleich der Expressionswerte, die durch Massenproben ermittelt werden, mit Durchschnittswerten aus einzelnen Würmern
Die relativen Expressionswerte wurden entweder anhand von cDNA berechnet, die aus Massenproben (25 Würmer) gewonnen wurde, oder anhand eines Durchschnitts von 36 Einzelschneckenproben (Abbildung 5). Beide cDNAs wurden mit der Worm-to-CT-Methode erhalten und mit der Nanofluidics PCR-Technologie verstärkt. Wie in Abbildung 5A-Cbeobachtet, wurden bei allen getesteten Chaperones (d. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70) vergleichbare Expressionsniveaus festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Parameter, die von einzelnen Würmern erhalten werden, zuverlässig sind.
Anwendung von Worm-to-CT gekoppelt an Nanofluidics-Technologie zur Schätzung von Parametern für die Genexpression von Einschneckengenen
Da der Single-Array-Chip die Überwachung von bis zu 96 Zieltranskripten auf 96 Einzelproben ermöglicht, ist er daher gut geeignet, um die individuelle Variabilität der Transkriptexpression zwischen einzelnen Würmern zu überwachen. Abbildung 6A zeigt ein repräsentatives Ergebnis, das den mittleren Ausdruck mehrerer hsp-Transkripte von einzelnen Würmern nach einem kurzen Hitzeschock zeigt. Wie in der Abbildung beobachtet, unterschied sich die Variabilität in der Expression von Transkripten dramatisch zwischen den verschiedenen Genen(Abbildung 6A). Um weitere Erkenntnisse zu gewinnen, wurde der Variationskoeffizient (CV) berechnet, indem die Standardabweichung durch den Mittelwert der Expressionsstufen26 dividiert wurde (Abbildung 6B). Drei Gene, deren CV-Werte zuvor mit alternativen Methoden geschätzt wurden, wurden überwacht (unveröffentlichte Daten). Zwei stabile Transkripte (ife-1 und Y45F10D.4) und eine Variable (nlp-2927) zeigten ihre erwartete Variabilität. Das Diagramm zeigt auch deutlich die bekannte umgekehrte Beziehung zwischen Variabilitätswerten und Expressionsstufen26 (Abbildung 6B).
Technische Replikationen sind von größter Bedeutung, um die Reproduzierbarkeit bei der Verwendung von Massenproben zu gewährleisten. Dies gilt jedoch nicht unbedingt für einzellige Experimente14,15,28. Um festzustellen, ob die Verwendung technischer Replikationen für die Parameterabschätzung bei verwendung von Einzelschneckenproben erforderlich ist, wurden 28 einzelne Würmer nach einem kurzen Hitzeschock geerntet und mit technischen Triplicaten verarbeitet. Die CV-Werte, die aus Dreiwurmdaten berechnet wurden ( blaue Punkte in Abbildung 7, technischer Lebenslauf) im Vergleich zu den Werten für jedes Transkript, das aus einzelnen Würmern gewonnen wurde (rote Punkte in Abbildung 7, biologische Variabilität), wurden verglichen. Für jedes getestete Transkript waren die technischen Lebensläufe niedriger als die biologischen Lebensläufe, was darauf hindeutet, dass technische Triplizen für die Parameterabschätzung nicht erforderlich waren. Die Tatsache, dass technische Repliken nicht erforderlich sind, erhöht den Durchsatz des Experiments, ohne die Qualität zu beeinträchtigen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über das Worm-to-CT-Protokoll. Diese Abbildung zeigt einen kurzen Überblick über die verschiedenen Schritte, die zum Ausführen von Würmern durch das Worm-to-CT-Protokoll erforderlich sind. Für den Umgekehrten Transkriptionsschritt werden zwei optionale Methoden angezeigt. Dies sind austauschbare Methoden für beide Chiptypen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> Abbildung 2: Überblick über die Vorbereitung und den Betrieb von nanofluidischem qPCR. Diese Abbildung zeigt Vorbereitungen für den Betrieb des nanofluidischen qPCR-Systems mit einem Multi-Array-Chip und einem Single-Array-Chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> Abbildung 3: Das Worm-to-CT-Protokoll auf Massenproben lieferte zuverlässige Ergebnisse. Vergleich des Worm-to-CT-Protokolls mit der regulären Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion22 auf Massenproben. In Übereinstimmung mit früheren Befunden verringerten sich bei hsf-1(sy441) Mutanten23die Konzentrationen von hsp-Transkripten als Reaktion auf Hitzeschock. Die obigen Histogramme zeigen die Induktion von hsp-70 in Abwesenheit von (-) oder nach (+) einem kurzen Hitzeschock von 30 min bei 34 °C. Die cDNA wurde mit Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion auf 1.000 Würmer (links) oder mit der Worm-to-CT-Methode auf 30 gepoolte Würmer (rechts) angewendet. Die Expressionswerte von hsp-70 pro 100 ng der gesamten RNA, die mit jeder Methode erhalten wurden, wurden verglichen. Wie erwartet, ging bei hsf-1(sy441) die transkriptionelle Induktion von hsp-70 als Reaktion auf Hitzeschock signifikant um 82,7 % mit Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform und um 92,3 % mit der Worm-to-CT-Methode zurück. Die mRNA-Spiegel von Zielgenen wurden gegen den Durchschnitt der drei Haushaltsgene cdc-42, pmp-3und ire-1normalisiert. Jeder Punkt stellt eine biologische Replikation dar. Die Daten wurden für statistische Analysen protokolliert, da sie nicht den für die parametrische Analyse erforderlichen Konventionen entsprachen. Die statistische Analyse wurde mit einer RM-One-way ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Wildtyp = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Balken bezeichnen den Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> Abbildung 4: Die Expressionsmuster waren zwischen Standard-qPCR- und nanofluidischen qPCR-Systemen konsistent. (A) Der Expressionsgrad von sma-3 (A), sma-10 (B) oder dnj-26 (C) mRNA wurde durch regelmäßige qPCR und nanofluidische qPCR (Multi-Array-Chip) aus drei biologischen Replikationen von cDNA bestimmt, die durch Wurm-zu-CT aus dem Wildtypstamm (N2) und dem dbl-1(nk3) Knockout-Stamm25erzeugt wurden. Relative mRNA-Expressionsniveaus wurden für jeden Stamm mit der Delta-Ct-Methode21bestimmt. Die Faltenveränderung wurde dann bestimmt, indem die in dbl-1(nk3)-Würmern erhaltenen Expressionsniveaus durch die entsprechenden mRNA-Werte im N2-Stamm dividiert wurden. Wie in Panel Agezeigt, waren die Muster für beide Methoden in jeder einzelnen biologischen Replikation konsistent. (B) und (C) sind die gleichen wie (A) für sma-10 bzw. dnj-26 mRNA-Ebenen. Die Ziel-mRNA-Werte wurden gegen die Haushaltsgene cdc-42 und pmp-3normalisiert. Die statistische Analyse wurde für jedes Gen anhand eines gepaarten t-Tests berechnet, in dem die Ergebnisse der drei biologischen Replikationen, die durch Standard-qPCR erzeugt wurden, und der ergebnisse, die durch nanofluidische qPCR erzeugt wurden, verglichen wurden. Die P-Werte dieser Vergleiche waren 0,3113, 0,2635 bzw. 0,3481 für sma-3, sma-10und dnj-26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Die Verwendung der Worm-to-CT-Methode auf Massenproben oder bei einzelnen Würmern bot ähnliche Ausdrucksebenen, wenn sie pro Wurm normalisiert wurden. Die Expressionswerte von (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 und (C) hsp-70 (C12C8.1) wurden bei jungen erwachsenen Tieren ohne Hitzeschock entweder durch Die Durchführung von Worm-to-CT an einem Großteil von 25 Tieren oder bei 36 Einzelpersonen analysiert. Wenn die Daten pro Wurm normalisiert wurden, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Pro-Wurm-Werten für jedes Transkript mit beiden Methoden. Die mRNA-Spiegel von Zielgenen wurden gegen den Durchschnitt der drei Haushaltsgene cdc-42, pmp-3und ire-1normalisiert. Balken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Statistik = gekoppelter t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> Abbildung 6: Rt-qPCR mit hohem Durchsatz bei einzelnen Würmern mit der Worm-to-CT-Methode könnte die interindividuelle Variabilität der Genexpression überwachen. (A) Die mittleren Expressionswerte für 53 Transkripte, die bei Exposition gegenüber einem kurzen Hitzeschock (30 min bei 34 °C) erhalten werden. Boxplots stellen die Verteilung der mittleren mRNA-Expression von einzelnen Würmern dar (pro einzelnen Wurm wurden durchschnittlich drei technische Repliken verwendet). Die Punkte stellen Ausdrucksebenen in 28 einzelnen Würmern dar. Die mRNA-Spiegel von Zielgenen wurden gegen den Durchschnitt der drei Haushaltsgene cdc-42, pmp-3und ire-1normalisiert. (B) Der Variationskoeffizient26 (CV) in Abhängigkeit von der mittleren mRNA-Expression für 53 Transkripte nach der Exposition gegenüber einem kurzen Hitzeschock wurde von 28 Einzeltieren berechnet (Rohdaten in Tafel B). Der Satz von Transkripten enthält die Variable nlp-29 Transkript27 und zwei stabile Transkripte(ife-1 und Y45F10D.4; unveröffentlichte Daten). Der CV ist das Verhältnis der Standardabweichung zum Mittelwert. Dieser Lebenslauf wurde verwendet, um die interindividuelle Variabilität im Transkriptexpression zwischen einzelnen Würmern zu schätzen. Wie erwartet, skalierte die interindividuelle Variabilität mit verringerten mittleren Expressionswerten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> Abbildung 7: Technische Replikationen waren bei der Analyse der interindividuellen Variabilität der Genexpression mit einem nanofluidischen Chip nicht erforderlich. Die in dieser Grafik dargestellten Daten wurden in 28 einzelnen Würmern nach einem kurzen Hitzeschock (30 min bei 34 °C) ermittelt. Jeder rote Punkt stellt den Variationskoeffizienten (CV) der mittleren Transkriptexpressionsebenen für eine Transkription dar, die zwischen 28 einzelnen Würmern (Bio CV) gemessen wird. Jeder blaue Punkt stellt den Lebenslauf der Expressionsstufen zwischen drei technischen Replikationen dar, die aus einem einzelnen Wurm pro Transkript sproduziert wurden (technischer CV). Diese Grafik zeigt, dass die technische Variabilität (zwischen technischen Replikationen) viel geringer war als die biologische Variabilität (zwischen einzelnen Würmern), was darauf hindeutet, dass es unnötig ist, technische Replikationen auf einem nanofluidischen Genexpressionsarray durchzuführen, wenn die Genexpression in einzelnen Würmern untersucht wird, ähnlich wie bei einzelzelligen Studien14,15,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Planlayout für einen Multi-Array-Chip. Die obige Tabelle zeigt ein einfaches Layout, das bei der Planung eines Multi-Array-Chiplaufs verwendet werden kann. Auf der linken Seite befinden sich die Räume, die mit den Primer-Zielen von Interesse gefüllt werden sollten, und auf der rechten Seite sind Räume, die mit den Mustern von Interesse gefüllt werden sollten. Jedes Assay- und Sample-Array wird zahlenmäßig durch den Chip gepaart. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Planlayout für einen Single-Array-Chip. Die obige Tabelle zeigt ein einfaches Layout, das bei der Planung eines Chiplaufs mit einem Array verwendet werden kann. Auf der linken Seite befinden sich Räume, die mit Primerzielen von Interesse gefüllt werden sollten, und auf der rechten Seite sind Räume, die mit den Mustern von Interesse gefüllt werden sollten. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Liste der in dieser Studie verwendeten RT-qPCR-Primer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Primer aus der Datenbank der RT-qPCR Primer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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