Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

אנו מודים לשרלין מרדוק ולמתקני מכון אייברהם על תמיכתם. JLP נתמך על ידי קרן Wellcome (093970/Z/10/Z) ו- OC נתמך על ידי ERC 638426 ו- BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במאמר זה, פרוטוקול Worm-to-CT מוצג כשיטה מהירה ויעילה לחילוץ RNA מתולעים בודדות או ממאגר קטן של תולעים. התפוקה הגבוהה שמציעה המערכת הננופלואידית הופכת אותו לאידיאלי לכימות מדידות שונות בין-אינדיבידואליות. יתר על כן, הרגישות הגבוהה של שיטה זו מאפשרת זיהוי של גנים לידי ביטוי ברמות נמוכות הנופלות מתחת לגילוי בעת שימוש בטכנולוגיות RNA-seq תולעת אחת9.
כאשר בוחנים את הבחירה של שיטה להכין cDNA מתולעים בודדות. Ly et al.29 אופטימיזציה פרוטוקול המסתמך על פרוטאיניאז K לעיכול קוטיקל. הקוטיקל הוא משוכה מרכזית לבידוד מולקולות מתולעים וחלבונים K מספק שיטה יעילה לשבור אותו. עם זאת, proteinase K צריך להיות מומת בחום כדי להיות מסוגל להשתמש באנזימים עבור שעתוק הפוך. בעוד Ly et al. השתמשו בחשיפה של 10 דקות ל-96 מעלות צלזיוס, שלב זה נמנע בפרוטוקול זה מכיוון ש-RNA ניתן להשפלה בקלות. במקום להשתמש בחלבון K, מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים שימשו כדי לשבור את הקוטיקל. הפשרת ההקפאה היא שיטה יעילה לשבור את הקוטיקל מכיוון שניתן לבודד יותר RNA לכל תולעת. Ly et al. מדווחים כי RNA הכולל המופק לכל תולעת הוא 35 ng באמצעות פרוטאינאז K, ואילו פרוטוקול זה מקבל 51.75 ng ± 6.74 SEM של RNA הכולל לכל תולעת. הימנעות מחשיפה לחום בשילוב עם צעדי קדם-מדידה ככל הנראה מרחיבה את טווח הזיהוי הדינמי של Worm-to-CT בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים. Ly et al. דווח על ערכי Ct מוחלטים של 21.1 ± 0.15 עבור hsp-16.2 ו 22.8 ± 0.17 עבור hsp-70 לאחר הלם חום. באמצעות אותם תנאי הלם חום (1 שעות ב 30 °C (60 °F), פרוטוקול זה מקבל ערכי Ct מוחלטים של 17.93 ± 0.57 עבור hsp-16.2 ו 21.13 ±0.33 עבור hsp-70. הדבר מצביע על כך ששיטת התזה להפשרת הקפאה מספקת תשואות גבוהות יותר של RNA ומתאימה יותר לתעתיקים מבוטאים נמוכים.
מערכות Nanofluidic הן אידיאליות כאשר חוקרים קבוצה נתונה של תעתיקי יעד ושימוש במספר קטן יותר (שבב מרובה מערך) או גדול יותר (שבב במערך יחיד) של דגימות המאפשרות התאמה לקנה המידה של הניסוי. כדי להשיג תמונה לא משוחדת של כל התמלילים המובעים בתולעת אחת, הבחירה הברורה היא להשתמש ברצף RNA. אם, לעומת זאת, המוקד של הניסוי הוא קבוצה קטנה יותר אך עדיין גדולה יחסית של גנים היעד, זה יותר חסכוני לנצל את הפרוטוקול הזה, בתנאי החוקר יש גישה למכונת PCR nanofluidics. העלות של ריאגנטים מערכת nanofluidic ושבב מערך יחיד מוערך כ £ 13 לכל תולעת, ואילו העלויות של ריאגנטים עבור רצף תולעת אחת יהיה כ £ 60 לכל תולעת, לא כולל עלויות רצף.
כאשר בוחנים באיזו פלטפורמת PCR להשתמש, שיטת Worm-to-CT בשילוב עם qPCR ננופלואידי מציעה יתרונות לגבי זמן ותפוקה. ניתן להשיג 9,216 תוצאות RT-qPCR בערך 2 ימים של עבודה, ואילו הגברה של אותו מספר של מטרות באמצעות פלטפורמת qPCR סטנדרטי ייקח בערך 5 שבועות עבודה באמצעות 96 גם לוח בדיקות, פועל ארבע צלחות ביום. עם זאת, אם מספר היעדים להיבדק הוא קטן יותר, אז זה יותר חסכוני להשתמש תולעת ל-CT בשילוב עם מכונת qPCR סטנדרטית. לא ניתן להפעיל מחדש את שבבי המערך הבודד, כך שהפעלת בארות ריקות מקטינה את עלות-היעילות.
מגבלה אחת של השיטה היא היווצרות פוטנציאלית של dimers פריימר-פריימר במהלך שלב multiplexing, אבל זה קורה בפחות מ 1% מהמקרים. למרות שפרוטוקול Worm-to-CT יעיל ומספק תוצאות אמינות כאשר הוא מוחל על תולעים בודדות, יש שיעור כשל של כ -5%, אשר ככל הנראה מתאים למקרים שבהם התולעת נשארת לכודה בכובע או בחלק העליון של הצינור במהלך שלב הקציר.
יחד, שיטה רב-תכליתית ואמינה זו מציעה תפוקה ורגישות מוגברות בהשוואה לטכניקות סטנדרטיות יותר. שיטה זו יכולה להיות שימושית מאוד לאימות מסכי תפוקה גבוהה והיא בחירה מצוינת לנטר או לאמת רמות ביטוי גנים של תולעת אחת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על טכניקות מאתגרות אחרות, כגון כמות של ביטוי גנים מרקמות מבודדות. לדוגמה, בידוד של רקמות מלאות, כגון המעי, גונדות או תאים המבודדים על ידי FACs, מספק מספיק חומר לביצוע ניסויי רצף RNA. עם זאת, כמויות מוגבלות של חומר מובילות לעתים קרובות לקריאות כפולות, אשר מונעות כמויות של תעתיקים נדירים. בתרחיש זה, באמצעות טכנולוגיה מבוססת nanofluidics צריך לספק רגישות נוספת לניסויים ולהגדיל את עלות היעילות אם החוקרים צריכים לפקח רק על תת קבוצה של כל התמלילים ברקמות או בתאים אלה.

אופטימיזציה של רצף RNA חד-תאי ו qPCR גילה כי פולסים שעתוק או התפרצויות יכול להוביל וריאציה מסיבית במספר מולקולות RNA לכל תא1. יתר על כן, טכנולוגיות אלה חשפו הטרוגניות תאית משמעותית שהוחמצה בעבר על ידי מדידות תמלוליות סטנדרטיות בתפזורת. בהתאם להקשר, כמה שונות שעתוק תא יחיד נגרמת על ידי הרכב תאי מעורב של רקמות. עם זאת, אפילו באוכלוסיות תאים isogenic גדל תחת אותה סביבה יש הטרוגניות שעתוק נפוצה2,3. "שונות ביולוגית" זו מזוהה יותר ויותר כמאפיין בכל מקום של רשתות סלולריות, מחיידקים לאדם. במקרים מסוימים, זה יכול להיות השלכות פנוטיפיות בפיתוח, התקדמות סרטן, השהיה HIV, ותגובה כימותרפיה4,5.
האלגנים nematode Caenorhabditis הוא אורגניזם מודל ייחודי עם מאפיינים אידיאליים לחקר הסיבות וההשלכות של שונות ביולוגית בין אנשים. nematodes אלה הם אורגניזם מודל פשוט המורכב 959 תאים, ואת קוטיקל שקוף שלהם עושה אותם נוח עבור מחקרי הדמיה vivo6. ג. אלגנס הוא מין הרמפרודיטי המתרבה בעיקר באמצעות הפריה עצמית; זה הביא זנים מעבדה isogenic. למרות איזוגניות ותנאי תרבות מבוקרים, פנוטיפים ותעתיקים רבים משתנים בין אנשים, דבר המצביע על כך שהבדלים סטוכסטיים או מיקרו-ויראליים תורמים להטרוגניות בין אנשים7,8. שונות כזו בביטוי גנים יש השלכות כושר מרובות, כולל שונות בחדירה של מוטציות, הישרדות, תזמון התפתחותי, פוריות7,8,9. בשל תכונות אלה, מחקרים חד-תולעיים מספקים הזדמנות חסרת תקדים לחקור שונות ביולוגית באורגניזם שלם.
יש צורך בסיסי בתחום לפתח ולייעל טכנולוגיות לגילוי מדויק של תעתיקים ברמת תולעת אחת. טכנולוגיות חדשות, כגון רצף RNA תולעת אחת10, רצף RNA מרקמות מבודדות11, רצף תא יחיד12 זמינים כעת עבור C. elegans. עם זאת, האתגר העיקרי נשאר: בעת ניטור interindividuality, גנים מבוטא חלש לעתים קרובות ליפול מתחת לרמות לגילוי13. זה רלוונטי במיוחד עבור תעתיקים נדירים מבודדים מכמויות קטנות של חומר התחלתי, שכן יש קשר מבוסס היטב, הפוך בין ביטוי ממוצע השונות הטכנית, לעתיםקרובות גורםתעתיקים נדירים ליפול מתחת לניתוקים סטטיסטיים 13 . אופטימיזציה של טכנולוגיות qPCR מרובות תפוקה גבוהה הוכיחה שימושית עבור מחקרים חד-תאיים יונקים, במיוחד כאשר לומדים את הביטוי של תעתיקים נדירים14,15. טכנולוגיה זו יכולה לשמש גם למטרות ביצועים ואימות של טכנולוגיות תולעת אחת אחרות.
תולעת ל-CT היא שיטה מהירה וחזקה המותאמת לערכה המשמשת במחקרים לביולוגיה של התא, להכנת cDNA חד-תולעתי. cDNA שהושג בשיטה זו יחד עם טכנולוגיית qPCR ננופלואידית מולטיפלקסים נבחרה מכיוון שהיא מספקת תפוקה ניסיונית גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר של זיהוי ונומתה למטרות תא יחיד14,15. הכנת cDNA המתוארת ישימה גם לשימוש עם טכנולוגיות PCR סטנדרטיות. התפוקה מוגברת בשתי דרכים: ראשית, הכנת cDNA היא מהירה ואמינה יותר מאשר מיצוי guanidium thiocyanate-phenol-chloroform המסורתי, כי תולעים מתווספות ישירות למאגר התמוגה, תוך דילוג על בידוד ישיר של RNA מתכלה בקלות. שנית, שימוש בטכנולוגיות ננופלואידיות מגדיל באופן משמעותי את מספר הדגימות והיעדים שניתן להפעיל בו זמנית. במאמר זה מושווים שני שבבים: שבב במערך יחיד ושבב רב-מערךי. שבב במערך יחיד יכול להריץ 96 תולעים בודדות ו-96 סטים של פריימרים, מה שמביא ל-9,216 תגובות בכל ניסוי. כדי להשיג תפוקה דומה באמצעות טכנולוגיות qPCR סטנדרטיות ידרוש 96 ניסויים נפרדים qPCR, באמצעות 96 לוחות באר. השבב הרב-מערךי הקטן והגמיש יותר מורכב משישה מערכי 12 x 12 וכתוצאה מכך 864 תגובות. האמינות והרגישות המעולות של השיטה מוגברות על ידי טכנולוגיה ננופלואידית ועל ידי הקדמה של שלב preamplification. השיטה המוצגת במאמר זה נועדה לשמש יחד עם אלגוריתם סטטיסטי עדכני לחילוץ שונות ביולוגית. מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת cDNA מהירה qPCR תפוקה גבוהה עבור תולעת אחת והן דגימות תולעת אצווה; האלגוריתם יפורסם במקום אחר. עבור פרוטוקול זה, הארגון של כל שבב צריך להיות מוכן לפני הניסוי. טבלה 1 וטבלה 2 מציגות דוגמאות לתוכניות אלה עבור שבב מרובה מערכים ושבב במערך יחיד, בהתאמה. באיור 1 מפורטות גם סקירות של פרוטוקול Worm-to-CT והפעלת השבבים מרובי המערך והמערך הבודד באיור 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

נייר זה מציג תפוקה גבוהה הפוך שעתוק כמותי PCR (RT-qPCR) בדיקה עבור אלגנים Caenorhabditis כי הוא מהיר, חזק, ורגיש מאוד. פרוטוקול זה מקבל מדידות מדויקות של ביטוי גנים מתולעים בודדות או מדגימות בתפזורת. הפרוטוקול המוצג כאן מספק עיבוד חדשני של שיטות קיימות להכנת DNA משלים (cDNA) יחד עם פלטפורמת RT-qPCR ננופלואידית. החלק הראשון של פרוטוקול זה, בשם 'תולעת ל- CT', מאפשר ייצור cDNA ישירות מנמדודים ללא צורך בבידוד mRNA קודם. זה מגביר את התפוקה הניסיונית על ידי מתן הכנת cDNA מ 96 תולעים ב 3.5 שעות. החלק השני של הפרוטוקול משתמש בטכנולוגיה ננופלואידית קיימת כדי להפעיל RT-qPCR בעל תפוקה גבוהה ב- cDNA. נייר זה מעריך שני שבבים ננו-פלואידיים שונים: הראשון מפעיל 96 דגימות ו -96 מטרות, וכתוצאה מכך 9,216 תגובות בכ 1.5 ימים של עבודת ספסל. סוג השבב השני מורכב משישה מערכי 12 x 12, וכתוצאה מכך 864 תגובות. כאן, שיטת התולעת ל-CT מודגמת על ידי כימות רמות mRNA של גנים המקודדיים חלבוני הלם חום מתולעים בודדות ומדגימות בתפזורת. בתנאי היא רשימה נרחבת של פריימרים שנועדו להגביר RNA מעובד עבור רוב הגנים קידוד בתוך הגנום C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

במאמר זה פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור קביעה מהירה ואמינה של רמות ביטוי גנים בדגימות C. elegans יחיד או בתפזורת מתואר. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד RNA ומייצר cDNA ישירות מדגימות. ניתן להשתמש בו יחד עם פלטפורמות qPCR ננופלואידיות מרובות תפוקה גבוהה בזמן אמת.

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...