Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

Ringraziamo Sharlene Murdoch e le strutture del Babraham Institute per il loro sostegno. JLP è stato supportato dal Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) e OC è supportato da ERC 638426 e BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, il protocollo Worm-to-CT si dimostra essere un metodo rapido ed efficiente per estrarre l'RNA da singoli worm o da un piccolo pool di worm. L'elevata produttività offerta dal sistema nanofluidico lo rende ideale per la quantificazione delle misurazioni della variabilità inter-individuale. Inoltre, l'elevata sensibilità di questo metodo consente il rilevamento di geni espressi a bassi livelli che cadono al di sotto del rilevamento quando si utilizzano tecnologie RNA-seq a vermesingolo 9.
Quando si considera la scelta del metodo per preparare il cDNA da singoli worm. Ly et al.29 ottimizzato un protocollo che si basa sulla proteinasi K per la digestione delle cuticola. La cuticola è un grosso ostacolo per l'isolamento delle molecole dai vermi e la proteinasi K fornisce un metodo efficace per romperla. Tuttavia, la proteinasi K deve essere inattivata termicamente per poter usare enzimi per la trascrizione inversa. Mentre Ly et al. Invece di usare la proteinasi K, sono stati usati ripetuti cicli di congelamento-disgelo per rompere la cuticola. Il congelamento-disgelo è un metodo efficace per rompere la cuticola perché più RNA può essere isolato per verme. riferiscono che l'RNA totale estratto per verme è di 35 ng utilizzando proteinasi K, mentre questo protocollo ottiene 51,75 ng ± 6,74 SEM di RNA totale per verme. Evitare l'esposizione al calore abbinata a fasi di preamplificazione apparentemente allarga la gamma dinamica di rilevamento di Worm-to-CT rispetto ai protocolli standard. Riportano valori Ct assoluti di 21,1 ± 0,15 per hsp-16,2 e 22,8 ± 0,17 per hsp-70 dopo shock termico. Utilizzando le stesse condizioni di shock termico (1 h a 30 °C), questo protocollo ottiene valori Ct assoluti di 17,93 ± 0,57 per hsp-16.2 e 21.13 ±0.33 per hsp-70. Ciò indica che il metodo di lisi congelamento-disgelo fornisce rese più elevate di RNA ed è più appropriato per trascrizioni a bassa espressa.
I sistemi nanofluidici sono ideali quando si studia un dato insieme di trascrizioni bersaglio e l'uso di un numero di campioni più piccolo (chip multi-array) o più grande (chip a matrice singola) che consente l'adattamento alla scala dell'esperimento. Per ottenere un'immagine imparziale di tutte le trascrizioni espresse in un singolo worm, la scelta ovvia è usare il sequenziamento dell'RNA. Se, tuttavia, il focus dell'esperimento è un insieme più piccolo ma ancora relativamente grande di geni bersaglio, è più conveniente utilizzare questo protocollo, a condizione che il ricercatore abbia accesso a una macchina PCR nanofluidica. Il costo dei reagenti del sistema nanofluidico e di un chip a matrice singola è stimato in circa £ 13 per worm, mentre i costi dei reagenti per il sequenziamento a singolo verme sarebbero di circa £ 60 per worm, senza includere i costi di sequenziamento.
Quando si considera quale piattaforma PCR utilizzare, il metodo Worm-to-CT accoppiato al qPCR nanofluidico offre vantaggi per quanto riguarda il tempo e la velocità effettiva. È possibile ottenere 9.216 risultati RT-qPCR in circa 2 giorni di lavoro, mentre l'amplificazione dello stesso numero di bersagli utilizzando una piattaforma qPCR standard richiederebbe circa 5 settimane lavorative utilizzando 96 test di piastra di pozzo, eseguendo quattro piastre al giorno. Tuttavia, se il numero di destinazioni da testare è più piccolo, è più conveniente utilizzare Worm-to-CT accoppiato con una macchina qPCR standard. I chip a matrice singola non possono essere rieseguiti, quindi l'esecuzione di pozzi vuoti riduce l'efficienza in termini di costi.
Una limitazione del metodo è la formazione potenziale di dimeri primer-primer durante la fase di multiplexing, ma ciò si verifica in meno dell'1% dei casi. Sebbene il protocollo Worm-to-CT sia efficiente e fornisca risultati affidabili se applicato a singoli worm, c'è un tasso di guasto di circa il 5%, che probabilmente corrisponde ai casi in cui il verme rimane intrappolato nel tappo o nella parte superiore del tubo durante la fase di raccolta.
Insieme, questo metodo versatile e affidabile offre una maggiore produttività e sensibilità rispetto alle tecniche più standard. Questo metodo può essere molto utile per la convalida di schermi ad alta velocità effettiva ed è una scelta eccellente per monitorare o convalidare i livelli di espressione genica a worm singolo. Questo metodo può essere applicato ad altre tecniche impegnative, come la quantificazione dell'espressione genica da tessuti isolati. Ad esempio, l'isolamento di tessuti completi, come l'intestino, le gonadi o le cellule isolate dalle FAC, fornisce materiale sufficiente per eseguire esperimenti di sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, quantità limitate di materiale spesso portano a letture duplicate, che impediscono la quantificazione di trascrizioni rare. In questo scenario, l'utilizzo della tecnologia basata sulla nanofluidica dovrebbe fornire una maggiore sensibilità agli esperimenti e aumentare l'efficienza in termini di costi se i ricercatori devono monitorare solo un sottoinsieme di tutte le trascrizioni in quei tessuti o cellule.

L'ottimizzazione del sequenziamento dell'RNA a singola cellula e del qPCR ha rivelato che impulsi o esplosioni trascrittivi possono portare a variazioni massicce nel numero di molecole di RNA per cella1. Inoltre, queste tecnologie hanno scoperto una sostanziale eterogeneità cellulare precedentemente persa da misurazioni trascrittomiche di massa standard. A seconda del contesto, alcune variabilità trascrizionale a singola cellula sono causate dalla composizione cellulare mista dei tessuti. Tuttavia, anche nelle popolazioni di cellule isogeniche coltivate nello stesso ambiente c'è un'eterogeneità trascrizionalediffusa 2,3. Questa "variabilità biologica" è sempre più identificata come una proprietà onnipresente delle reti cellulari, dai batteri all'uomo. In alcuni casi, può avere conseguenze fenotipiche nello sviluppo, nella progressione del cancro, nella latenza dell'HIV e nella risposta alla chemioterapia4,5.
Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello unico con caratteristiche ideali per lo studio delle cause e delle conseguenze della variabilità biologica tra gli individui. Questi nematodi sono un semplice organismo modello composto da 959 cellule e la loro cuticola trasparente li rende disponibili per studi di imaging in vivo6. C. elegans è una specie ermafrodita che si riproduce prevalentemente attraverso l'autofertilizzazione; ciò ha portato a ceppi di laboratorio isogenici. Nonostante l'isogenicità e le condizioni di coltura controllata, molti fenotipi e trascrizioni sono variabili tra gli individui, suggerendo che le differenze stocastiche o microambientali contribuiscono all'eterogeneitàtra gli individui 7,8. Tale variabilità nell'espressione genica ha molteplici conseguenze di forma fisica, tra cui variabilità nella penetranza di mutazioni, sopravvivenza, tempi di sviluppo e fecondità7,8,9. A causa di queste caratteristiche, gli studi a verme singolo offrono l'opportunità senza precedenti di studiare la variabilità biologica in un intero organismo.
C'è una necessità fondamentale sul campo di sviluppare e ottimizzare le tecnologie per il rilevamento accurato delle trascrizioni a livello di worm singolo. Nuove tecnologie, come il sequenziamento dell'RNA a vermesingolo 10,il sequenziamento dell'RNA dai tessutiisolati 11e il sequenziamento asingola cellula 12 sono ora disponibili per C. elegans. Tuttavia, rimane una sfida principale: quando si monitora l'interindividualità, i geni debolmente espressi spesso diminuiscono al di sotto dei livellirilevabili 13. Ciò è particolarmente rilevante per le trascrizioni rare isolate da piccole quantità di materiale di partenza, in quanto esiste una relazione consolidata e inversa tra espressione media e varianza tecnica, che spesso fa scendere trascrizioni rare al di sotto dei tagli statistici13. L'ottimizzazione delle tecnologie qPCR multiplexate ad alta produttività si è dimostrata utile per gli studi a cella singola dei mammiferi, in particolare quando si studia l'espressione di trascrizioni rare14,15. Questa tecnologia può essere utilizzata anche per scopi di benchmarking e convalida di altre tecnologie single-worm.
Worm-to-CT è un metodo veloce e robusto adattato da un kit utilizzato negli studi di biologia cellulare, per la preparazione di cDNA a verme singolo. cDNA ottenuto con questo metodo accoppiato con la tecnologia qPCR nanofluidico multiplexato è stato scelto perché fornisce una maggiore produttività sperimentale, una gamma dinamica più ampia di rilevamento ed è stato convalidato per scopi asingola cella 14,15. La preparazione cDNA descritta è applicabile anche per l'uso con tecnologie PCR standard. La produttività è aumentata in due modi: in primo luogo, la preparazione del cDNA è più veloce e affidabile della tradizionale estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio guanidium, perché i vermi vengono aggiunti direttamente al tampone di lysis, saltando l'isolamento diretto dell'RNA facilmente degradabile. In secondo luogo, l'utilizzo di tecnologie nanofluidiche aumenta significativamente il numero di campioni e obiettivi che possono essere eseguiti contemporaneamente. In questa carta vengono confrontati due chip: un chip a matrice singola e un chip multi-array. Un chip a matrice singola può eseguire 96 singoli worm e 96 set di primer, con il risultato di 9.216 reazioni per esperimento. Per ottenere una velocità effettiva simile utilizzando le tecnologie qPCR standard sarebbero necessari 96 esperimenti qPCR separati, utilizzando 96 piastre di pozzo. Il chip multi-array più piccolo e flessibile è costituito da sei array 12 x 12 con conseguente reazioni 864. L'affidabilità e la sensibilità superiori del metodo sono potenziate dalla tecnologia nanofluidica e dall'introduzione di una fase di preamplificazione. Il metodo presentato in questo documento è pensato per essere utilizzato insieme a un algoritmo statistico all'avanguardia per estrarre la varianza biologica. In questo articolo viene presente il protocollo per la preparazione rapida di cDNA e qPCR ad alta velocità effettiva sia per i campioni di worm singolo che batch; l'algoritmo sarà pubblicato altrove. Per questo protocollo, l'organizzazione di ogni chip deve essere preparata prima dell'esperimento. La tabella 1 e la tabella 2 mostrano esempi di questi piani per un chip multi-array e single-array, rispettivamente. Nella figura 1 sono inoltre disponibili panoramiche del protocollo Worm-to-CT che eseguono i chip multi-array e single array nella figura 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

Questo documento presenta un saggio quantitativo di trascrizione quantitativa PCR (RT-qPCR) ad alta produttività per gli elegans caenorhabditis che è veloce, robusto e altamente sensibile. Questo protocollo ottiene misurazioni precise dell'espressione genica da singoli worm o da campioni di massa. Il protocollo qui presentato fornisce un nuovo adattamento dei metodi esistenti per la preparazione del DNA complementare (cDNA) accoppiato a una piattaforma rt-qPCR nanofluidico. La prima parte di questo protocollo, chiamata "Worm-to-CT", consente la produzione di cDNA direttamente dai nematodi senza la necessità di un precedente isolamento dell'mRNA. Aumenta la produttività sperimentale consentendo la preparazione del cDNA da 96 vermi in 3,5 ore. La seconda parte del protocollo utilizza la tecnologia nanofluidica esistente per eseguire RT-qPCR ad alta produttività sul cDNA. Questo documento valuta due diversi chip nanofluidici: il primo esegue 96 campioni e 96 obiettivi, con il risultato di 9.216 reazioni in circa 1,5 giorni di panchina. Il secondo tipo di chip è costituito da sei array 12 x 12, con il risultato di 864 reazioni. Qui, il metodo Worm-to-CT è dimostrato quantificando i livelli di mRNA dei geni che codificano proteine di shock termico da singoli worm e da campioni di massa. Fornito è un ampio elenco di primer progettati per amplificare l'RNA elaborato per la maggior parte dei geni codificanti all'interno del genoma C. elegans.

Convalida di Worm-to-CT come metodo di preparazione cDNA
Per verificare se il protocollo Worm-to-CT è un metodo di estrazione cDNA valido, è stato confrontato con i metodi standard di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio. I risultati sono riportati nella figura 3, dove il cDNA è stato preparato a partire da una media di ~1.000 vermi utilizzando tecniche standard di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio standard22 e da 30 vermi utilizzando il metodo Worm-to-CT. I campioni sono rimasti scioccati dal calore contemporaneamente (30 minuti a 34 °C). A livello globale, i livelli di espressione di hsp-70 mRNA per 100 ng di RNA totale erano paragonabili usando entrambi i metodi. Tuttavia, nel caso dell'espressione hsp-70 più alta (cioè in N2 a seguito di shock termico) i livelli di espressione erano più alti con il metodo Worm-to-CT, indicando una migliore sensibilità.
Per determinare se è possibile riprodurre una diminuzione prevista dell'espressione hsp in hsf-1(sy441)23, una mutazione nel principale regolatore trascrizionale degli accompagnatorimolecolari 23,24, è stata confrontata l'induzione di chaperone trascrizionale a seguito di un breve shock termico. Con entrambi i metodi è stata rilevata una diminuzione dell'induzione di hsp-70 negli animali hsf-1(sy441). Questo era previsto, perché gli animali mutanti hsf-1(sy441) mostrano una ridotta capacità di indurre chaperoni a causa di un troncamento nel dominio di trasattivazione di HSF-1. Per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio il guanidio hsp70 è diminuito dell'82,7% rispetto ai controlli e del 92,3% per il verme-TC rispetto agli animali di tipo selvatico(figura 3). I risultati sono stati comparabili tra i due metodi e comparabili alle precedenti relazioni23. Questi risultati indicano che il metodo Worm-to-CT è una valida alternativa alle tecniche standard di sintesi cDNA.
Convalida della piattaforma PCR nanofluidica utilizzata per amplificare gli obiettivi dell'mRNA
Per testare la coerenza dei risultati usando qPCR nanofluidico per l'amplificazione della trascrizione, i risultati PCR ottenuti dal metodo bulk Worm-to-CT sono stati confrontati sia su un sistema qPCR standard (Table of Materials) che su un sistema qPCR nanofluidico utilizzando un chip multi-array. Il cambiamento di piegatura nell'espressione di tre diversi geni, sma-3 (Figura 4A), sma-10 (Figura 4B) e dnj-26, è stato monitorato (Figura 4C) negli animali che trasportano un allele nullo in dbl-1 (dbl-1(nk3)) 25 rispetto alle controparti di tipo selvatico. Dbl-1 codifica l'unico ligando della via di segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP). sma-3 e sma-10 sono geni che codificano ortologhi SMAD, componenti chiave della cascata di segnalazione BMP. Dnj-26 codifica un chaperone molecolare, un bersaglio della segnalazione BMP. Questi risultati mostrano poca o nessuna differenza nella variazione di piegatura confrontando i risultati dei due metodi, risultando in valori P non significativi rispettivamente a 0,3113, 0,2635 e 0,3481 per sma-3, sma-10 e dnj-26. Complessivamente, questi risultati mostrano che il metodo Worm-to-CT applicato ai campioni di massa è un modo efficiente e rapido per estrarre l'RNA da pochi worm e fornisce dati affidabili se accoppiati con sistemi PCR standard o piattaforme qPCR basate su nanofluidici ad alta produttività.
Confronto tra i livelli di espressione ottenuti da campioni di massa con medie ottenute da singoli worm
I livelli di espressione relativi sono stati calcolati utilizzando cDNA ottenuto da campioni di massa (25 worm) o da una media di 36 campioni di worm singoli (Figura 5). Entrambi i cDNA sono stati ottenuti utilizzando il metodo Worm-to-CT e amplificati utilizzando la tecnologia PCR nanofluidica. Come osservato nella figura 5A-C, per tutti gli accompagnatori testati (ad esempio, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70), i metodi hanno rilevato livelli di espressione comparabili. Questi risultati indicano che i parametri ottenuti da singoli worm sono affidabili.
Applicazione di Worm-to-CT accoppiata alla tecnologia nanofluidica per stimare i parametri di espressione genica a verme singolo
Poiché il chip a matrice singola consente il monitoraggio di un massimo di 96 trascrizioni di destinazione su 96 singoli campioni, è quindi adatto per monitorare la variabilità individuale nell'espressione di trascrizione tra singoli worm. La figura 6A presenta un risultato rappresentativo che mostra l'espressione media di più trascrizioni hsp da singoli worm a seguito di un breve shock termico. Come osservato nella figura, la variabilità nell'espressione delle trascrizioni differiva notevolmente tra i diversi geni (Figura 6A). Per ottenere ulteriori informazioni, il coefficiente di variazione (CV) è stato calcolato dividendo la deviazione standard per la media dei livelli diespressione 26 (Figura 6B). Sono stati monitorati tre geni i cui valori CV sono stati precedentemente stimati con metodi alternativi (dati inediti). Due trascrizioni stabili (ife-1 e Y45F10D.4) e una variabile (nlp-2927) hanno mostrato la loro variabilità prevista. Il grafico descrive inoltre chiaramente la ben nota relazione inversa tra i valori di variabilità e i livelli diespressione 26 (Figura 6B).
Le repliche tecniche sono di fondamentale importanza per garantire la riproducibilità quando si utilizzano campioni di massa. Tuttavia, questo non è necessariamente il caso degli esperimenti a cellasingola 14,15,28. Per determinare se l'uso di repliche tecniche è necessario per la stima dei parametri quando si utilizzano campioni a worm singolo, sono stati raccolti 28 singoli worm, a seguito di un breve shock termico, e lavorati utilizzando triplicati tecnici. Sono stati confrontati i valori CV calcolati dai dati a worm singolo ottenuti in triplice copia (punti blu nella figura 7, CV tecnico) rispetto a quelli di ogni trascrizione ottenuta da singoli worm (punti rossi nella figura 7, variabilità biologica). Per ogni trascrizione testata, i CV tecnici erano inferiori ai CV biologici, il che indica che i triplicati tecnici non erano necessari per la stima dei parametri. Il fatto che non siano necessarie repliche tecniche aumenta la produttività dell'esperimento senza compromettere la qualità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo Worm-to-CT. In questa figura viene illustrata una breve panoramica dei diversi passaggi necessari per eseguire worm tramite il protocollo Worm-to-CT. Per il passaggio di trascrizione inversa vengono visualizzati due metodi facoltativi; questi sono metodi intercambiabili per entrambi i tipi di chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica della preparazione e dell'esecuzione del qPCR nanofluidico. Questa figura descrive i preparativi per l'esecuzione del sistema qPCR nanofluidico usando un chip multi-array e un chip a matrice singola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo worm-to-CT su campioni di massa ha fornito risultati affidabili. Confronto tra il protocollo Worm-to-CT e la normale estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio22 su campioni sfusi. Coerentemente con i risultati precedenti, nei mutanti hsf-1(sy441)23, i livelli di trascrizioni hsp in risposta allo shock termico sono diminuiti. Gli istogrammi di cui sopra raffigurano l'induzione di hsp-70 in assenza di (-), o a seguito (+) di un breve shock termico di 30 min a 34 °C. Il cDNA è stato ottenuto utilizzando l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio applicata a 1.000 vermi (a sinistra) o utilizzando il metodo Worm-to-CT applicato a 30 vermi in pool (a destra). Sono stati confrontati i livelli di espressione di hsp-70 per 100 ng di RNA totale ottenuti con ciascun metodo. Come previsto, nell'hsf-1(sy441) l'induzione trascrizionale di hsp-70 in risposta allo shock termico è diminuita significativamente dell'82,7% utilizzando il tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio e del 92,3% utilizzando il metodo Worm-to-CT. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. Ogni punto rappresenta una replica biologica. I dati sono stati log trasformati per l'analisi statistica, in quanto non soddisfacivano le convenzioni richieste per l'analisi parametrica. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un ANOVA RM-Un-way utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak. Tipo jolly = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Le barre indicano l'errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> Figura 4: I modelli di espressione erano coerenti tra i sistemi qPCR standard e qPCR nanofluidici. (A) Il livello di espressione di sma-3 (A), sma-10 (B) o dnj-26 (C) mRNA è stato determinato attraverso qPCR regolare e qPCR nanofluidico (chip multi-array) da tre repliche biologiche di cDNA generate attraverso Worm-to CT dal ceppo di tipo selvatico (N2) e dal ceppo knockout dbl-1(nk3) 25. I livelli relativi di espressione dell'mRNA sono stati determinati per ogni ceppo utilizzando il metodo Delta-Ct21. Il cambiamento di piegatura è stato quindi determinato dividendo i livelli di espressione ottenuti nei vermi dbl-1(nk3) per i corrispondenti livelli di mRNA nel ceppo N2. Come mostrato nel pannello A, i modelli erano coerenti per entrambi i metodi in ogni singola replica biologica. (B) e (C) sono gli stessi di (A) rispettivamente per i livelli di sma-10 e dnj-26 mRNA. I livelli di mRNA target sono stati normalizzati rispetto ai geni delle pulizie cdc-42 e pmp-3. L'analisi statistica è stata calcolata per ogni gene utilizzando un test t accoppiato confrontando i risultati delle tre repliche biologiche prodotte attraverso qPCR standard e quelle generate attraverso qPCR nanofluidico. I valori P di questi confronti erano rispettivamente 0,3113, 0,2635 e 0,3481 per sma-3, sma-10 e dnj-26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> Figura 5: L'utilizzo del metodo Worm-to-CT su campioni di massa o su singoli worm ha fornito livelli di espressione simili quando normalizzato per worm. I livelli di espressione di (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 e (C) hsp-70 (C12C8.1) sono stati analizzati in giovani animali adulti in assenza di shock termico eseguendo Worm-to-CT su una massa di 25 animali o su 36 singoli individui. Quando i dati sono stati normalizzati per worm, non c'era alcuna differenza significativa tra i livelli ottenuti per worm per ogni trascrizione utilizzando entrambi i metodi. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. Le barre rappresentano l'errore standard della media. Statistics = test t accoppiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> Figura 6: RT-qPCR ad alta produttività su singoli worm utilizzando il metodo Worm-to-CT potrebbe monitorare la variabilità inter-individuale nell'espressione genica. (A) I livelli di espressione media per 53 trascrizioni ottenute in caso di esposizione a un breve shock termico (30 min a 34 °C). I boxplot rappresentano la distribuzione dell'espressione media dell'mRNA dai singoli worm (sono state utilizzate in media tre repliche tecniche per singolo worm). I punti rappresentano i livelli di espressione in 28 singoli worm. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. (B) Il coefficiente divariazione 26 (CV) in funzione dell'espressione media dell'mRNA per 53 trascrizioni a seguito dell'esposizione a uno shock termico breve è stato calcolato da 28 singoli animali (dati grezzi mostrati nel pannello B). L'insieme di trascrizioni include la variabile nlp-29 trascrizione27 e due trascrizioni stabili (ife-1 e Y45F10D.4; dati non pubblicati). Il CV è il rapporto tra la deviazione standard e la media. Questo CV è stato utilizzato per stimare la variabilità inter-individuale nell'espressione di trascrizione tra i singoli worm. Come previsto, la variabilità inter-individuale è stata ridimensionata con livelli di espressione media ridotti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> Figura 7: Le repliche tecniche non erano necessarie quando si analizzava la variabilità inter-individuale nell'espressione genica usando un chip nanofluidico. I dati presentati in questo grafico sono stati ottenuti in 28 singoli vermi a seguito di un breve shock termico (30 min a 34 °C). Ogni punto rosso rappresenta il coefficiente di variazione (CV) dei livelli di espressione di trascrizione media per una trascrizione saggiata tra 28 singoli vermi (bio CV). Ogni punto blu rappresenta il CV dei livelli di espressione tra tre repliche tecniche ottenute da un singolo worm, per trascrizione saggiata (CV tecnico). Questo grafico mostra che la variabilità tecnica (tra repliche tecniche) era molto inferiore alla variabilità biologica (tra singoli vermi), suggerendo che non è necessario eseguire repliche tecniche su un array di espressioni geniche nanofluidiche quando si saggia l'espressione genica in singoli worm, in modo simile agli studi asingola cellula 14,15,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Pianificare il layout per un chip multi-array. La tabella precedente mostra un layout semplice che può essere utilizzato durante la pianificazione di un'esecuzione di chip multi-array. A sinistra ci sono gli spazi che dovrebbero essere riempiti con i bersagli di interesse del primer e a destra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con i campioni di interesse. Ogni saggio e matrice di campioni è accoppiato per numero attraverso il chip. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Pianificare il layout per un chip a matrice singola. La tabella precedente mostra un layout semplice che può essere utilizzato durante la pianificazione di un'esecuzione di chip a matrice singola. A sinistra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con bersagli di interesse primer e a destra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con i campioni di interesse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Elenco dei primer RT-qPCR utilizzati nel presente studio. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 1: Primer della base di dati dei primer RT-qPCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

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High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In questo articolo viene descritto un protocollo ad alta produttività per una determinazione rapida e affidabile dei livelli di espressione genica in campioni C. elegans singoli o sfusi. Questo protocollo non richiede l'isolamento dell'RNA e produce cDNA direttamente dai campioni. Può essere utilizzato insieme a piattaforme qPCR multiplexate ad alta produttività in tempo reale.

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