Name: high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

Мы благодарим Шарлин Мердок и учреждения Института Бэррахэма за их поддержку. JLP была поддержана Wellcome Trust (093970//10/) и OC поддерживается ERC 638426 и BBSRC «BBS/E/B000C0426».

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

В этой статье, Червь к КТ протокол показан как быстрый и эффективный метод для извлечения РНК из одиночных червей или небольшой бассейн червей. Высокая пропускная способность, предлагаемая нанофлюидной системой, делает ее идеальной для количественной оценки межидеозных измерений изменчивости. Кроме того, высокая чувствительность этого метода позволяет обнаруживать гены, выраженные на низких уровнях, которые падают ниже обнаружения при использовании технологий РНК-сек9 одного червя.
При рассмотрении выбора метода подготовки кДНА от одиночных червей. Ly et al.29 оптимизировали протокол, который опирается на протеиназу K для пищеварения кутикулы. Кутикула является основным препятствием для изоляции молекул от червей и протеиназа K обеспечивает эффективный метод, чтобы сломать его. Тем не менее, протеиназа K должна быть тепловой инактивированной, чтобы иметь возможность использовать ферменты для обратной транскрипции. В то время как Ly et al. использовали 10-минутное воздействие 96 градусов по Цельсию, этого шага удалось избежать в этом протоколе, потому что РНК легко разлагается. Вместо того, чтобы использовать протеиназу K, для разрыва кутикулы использовались повторные циклы замораживания оттепели. Замораживание оттепели является эффективным методом, чтобы сломать кутикулу, потому что больше РНК может быть изолирована на червя. Ly et al. сообщают, что общая РНК, извлеченная на червя, составляет 35 нг с использованием протеиназы K, в то время как этот протокол получает 51,75 нг ± 6,74 SEM от общей РНК на червя. Избежание теплового воздействия в сочетании с шагами по предварительной упрощения, по-видимому, расширяет динамический диапазон обнаружения Worm-to-CT по сравнению со стандартными протоколами. Ly et al. сообщают абсолютные значения Ct 21.1 ± 0.15 для hsp-16.2 и 22.8 ± 0.17 для hsp-70 после теплового удара. Используя те же условия теплового удара (1 ч при температуре 30 градусов по Цельсию), этот протокол получает абсолютные значения Ct 17,93 ± 0,57 для hsp-16.2 и 21.13 ±0.33 для hsp-70. Это указывает на то, что метод лиза замораживания оттепели обеспечивает более высокие урожаи РНК и более подходит для низко выраженных стенограмм.
Нанофлюидные системы идеально подходят при расследовании данного набора целевых стенограмм и использовании либо меньшего (многослойного чипа), либо большего (однослойного чипа) количества образцов, позволяющих адаптироваться к масштабу эксперимента. Чтобы получить объективную картину всех стенограмм, выраженных в одном черве, очевидным выбором является использование РНК-секвенирования. Если, однако, в центре внимания эксперимента меньше, но все еще относительно большой набор целевых генов, это более экономически эффективным, чтобы использовать этот протокол, при условии, что исследователь имеет доступ к нанофлюиды ПЦР машины. Стоимость реагентов нанофлюидной системы и чипа с одним массивом оценивается примерно в 13 фунтов стерлингов за червя, в то время как затраты на реагенты для секвенирования одного червя соцдемов составить около 60 фунтов стерлингов за червя, не считая затрат на секвенирование.
При рассмотрении того, что ПЦР-платформа для использования, Червь к КТ метод в сочетании с нанофлюидной qPCR предлагает преимущества в отношении времени и пропускной способности. За примерно 2 дня работы можно получить 9216 результатов RT-qPCR, в то время как усиление такого же количества целей с помощью стандартной платформы qPCR займет около 5 рабочих недель с использованием анализа пластин 96 хорошо, запуская четыре пластины в день. Однако, если количество целей, которые будут протестированы меньше, то более экономически эффективным является использование Worm-to-CT в сочетании со стандартной машиной qPCR. Одно массивные чипы не могут быть повторно запущены, поэтому запуск пустых скважин снижает эффективность затрат.
Одним из ограничений метода является потенциальное образование грунтовки-праймеров димеров во время мультиплексирования, но это происходит менее чем в 1% случаев. Хотя протокол Worm-to-CT эффективен и обеспечивает надежные результаты при применении к одиночным червям, во время уборки около 5%, что, вероятно, соответствует случаям, когда червь остается в ловушке крышки или верхней части трубки.
В совокупности этот универсальный и надежный метод обеспечивает повышенную пропускную способность и чувствительность по сравнению с более стандартными методами. Этот метод может быть очень полезен для проверки высокой пропускной способности экранов и является отличным выбором для мониторинга или проверки уровня экспрессии генов одного червя. Этот метод может быть применен к другим сложным методам, таким как количественная экспрессия генов из изолированных тканей. Например, изоляция полных тканей, таких как кишечник, гонады или клетки, изолированные FACs, обеспечивает достаточно материала для выполнения экспериментов по секвенированию РНК. Однако ограниченное количество материала часто приводит к дублированию считывания, что исключает количественную оценку редких стенограмм. В этом сценарии использование технологии на основе нанофлюиды должно обеспечить дополнительную чувствительность к экспериментам и повысить эффективность затрат, если исследователям необходимо контролировать только подмножество всех транскриптов в этих тканях или клетках.

Оптимизация одноклеточного секвенирования РНК и qPCR показала, что транскрипционные импульсы или всплески могут привести к массовым изменениям в количестве молекул РНК наклетку 1. Кроме того, эти технологии выявили существенную неоднородность клеток, ранее пропущенную стандартными объемными транскрипционными измерениями. В зависимости от контекста, некоторая одноклеточная транскрипционная изменчивость вызвана смешанным клеточным составом тканей. Однако даже в изогенных популяциях клеток, выращенных в одной среде, широко распространена транскрипционнаянеоднородность 2,3. Эта «биологическая изменчивость» все чаще идентифицируется как повсеместное свойство клеточных сетей, от бактерий до человека. В некоторых случаях, он может иметь фенотипические последствия в развитии, прогрессирование рака, задержка ВИЧ, и ответна химиотерапию 4,5.
Нематод Caenorhabditis elegans является уникальной моделью организма с идеальными характеристиками для изучения причин и последствий биологической изменчивости между людьми. Эти нематоды являются простой моделью организма, состоящего из 959 клеток, и их прозрачная кутикула делает их податливой для in vivo изображенийисследований 6. C. elegans — гермафродитический вид, который размножается преимущественно путем самообогащения; это привело к изогенным лабораторным штаммам. Несмотря на изогенность и контролируемые культурные условия, многие фенотипы и стенограммы являются переменными между людьми, предполагая, что стохастические или микропрофронные различия способствуют неоднородности междулюдьми 7,8. Такая изменчивость экспрессии генов имеет многочисленные фитнес-последствия, в том числе изменчивость в переизбытке мутаций, выживаемость, сроки развития иплодовитость 7,8,9. Благодаря этим особенностям исследования с одним червем предоставляют беспрецедентную возможность для изучения биологической изменчивости всего организма.
В этой области существует основополагающую потребность в разработке и оптимизации технологий точного обнаружения стенограмм на уровне одного червя. Новые технологии, такие как одновой червь РНКсеквенирования 10, РНК секвенированияиз изолированных тканей 11, и одноклеточногосеквенирования 12 теперь доступны для C. elegans. Однако основная проблема остается: при мониторинге межиндивидуальности слабо выраженные гены часто опадают ниже обнаруживаемыхуровней 13. Это особенно актуально для редких стенограмм, изолированных от небольших количеств исходного материала, так как существует устоявшаяся обратная связь между средним выражением и технической дисперсией, часто вызывая редкие стенограммы, чтобы упасть ниже статистических отсечки13. Оптимизация высокой пропускной способности мультиплексных технологий qPCR оказалась полезной для млекопитающих одноклеточных исследований, в частности при изученииэкспрессии редких транскриптов 14,15. Эта технология также может быть использована для бенчмаркинга и проверки других технологий с одним червем.
Worm-to-CT — это быстрый и надежный метод, адаптированный из набора, используемого в исследованиях клеточной биологии, для подготовки к кДНА с одним червем. cDNA, полученный этим методом в сочетании с мультиплексной нанофлюидной технологией qPCR, был выбран потому, что он обеспечивает более высокую экспериментальную пропускную способность, более широкий динамический диапазон обнаружения и был проверен для одноклеточныхцелей 14,15. Описанная подготовка кДНА также применима для использования со стандартными технологиями ПЦР. Пропускная способность увеличивается двумя способами: во-первых, препарат cDNA быстрее и надежнее, чем традиционный гуанидий тиоцианат-фенол-хлороформ, потому что черви непосредственно добавляются в буфер лиза, пропуская прямую изоляцию легко разлагаемой РНК. Во-вторых, использование нанофлюидных технологий значительно увеличивает количество образцов и целей, которые могут быть запущены одновременно. В этой работе сравниваются две фишки: чип с одной массивом и многослойный чип. Одно массивный чип может работать 96 одиночных червей и 96 наборов грунтовок, в результате чего 9216 реакций за эксперимент. Для достижения аналогичной пропускной способности с использованием стандартных технологий qPCR потребуется 96 отдельных экспериментов qPCR, используя 96 пластин. Меньший и более гибкий многослойный чип состоит из шести массивов 12 x 12, что приводит к 864 реакциям. Превосходная надежность и чувствительность метода повышаются с помощью нанофлюидной технологии и введения шага предварительной упрощения. Метод, представленный в настоящем документе, предназначен для использования вместе с самым новым статистическим алгоритмом для извлечения биологической дисперсии. В этой статье представлен протокол для быстрого приготовления кДНК и высокой пропускной способности qPCR как для одного червя, так и для образцов пакетных червей; алгоритм будет опубликован в другом месте. Для этого протокола организация каждого чипа должна быть подготовлена до начала эксперимента. В таблице 1 и таблице 2 приведены примеры этих планов для многофункциональных и однослойных чипов соответственно. Есть также обзоры протокола Worm-to-CT, подробно описанного на рисунке 1, и запуск микросхем с мульти-массивом и одним массивом на рисунке 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

В настоящем документе представлена высокая пропускная способность обратной транскрипции количественных ПЦР (RT-qPCR) анализ для Caenorhabditis elegans, который является быстрым, надежным и очень чувствительным. Этот протокол получает точные измерения экспрессии генов от одиночных червей или от навалочных образцов. Представленный здесь протокол предусматривает новую адаптацию существующих методов комплементарной подготовки ДНК (кДНК) в сочетании с нанофлюидной платформой RT-qPCR. Первая часть этого протокола, названная "Worm-to-CT", позволяет кДНА производство непосредственно из нематод без необходимости предварительной изоляции мРНК. Это увеличивает экспериментальную пропускную способность, позволяя подготовку cDNA от 96 червей в 3,5 ч. Вторая часть протокола использует существующую нанофлюидную технологию для запуска высокой пропускной способности RT-qPCR на cDNA. В настоящем документе оцениваются два различных нанофлюидных чипа: первый выполняет 96 образцов и 96 целей, в результате чего 9216 реакций примерно за 1,5 дня работы скамейки. Второй тип чипа состоит из шести массивов 12 x 12, что приводит к 864 реакциям. Здесь метод Worm-to-CT демонстрируется количественной оценкой уровней мРНК генов, кодирующих белки теплового шока от одиночных червей и от объемных образцов. При условии, обширный список грунтовки предназначены для усиления обработанных РНК для большинства генов кодирования в геноме C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

В этой статье описан протокол высокой пропускной способности для быстрого и надежного определения уровней экспрессии генов в отдельных или объемных образцах C. elegans. Этот протокол не требует изоляции РНК и производит кДНК непосредственно из образцов. Он может быть использован вместе с высокой пропускной способностью мультиплексных нанофлюидных платформ в режиме реального времени qPCR.

Высокая пропускная способность Количественный RT-PCR в одиночных и массовых C. elegans образцы с использованием нанофлюидных технологий

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Высокопроизводительная ДНК плазменный мультиплексирование и трансфекция с использованием акустической технологии нанодозирования

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Проектирование автоматизированных, высокая пропускная способность, непрерывный рост клеток эксперименты с использованием Эволюционивер

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...