Name: monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

לטפל בכל וירוסי שפעת על פי דרישות רמת בטיחות ביולוגית מתאימה (BSL-2 ומעלה בהתאם לסוג המשנה). השתמש בזני IAV עם היסטוריית מעבר נמוכה (פחות מפי 5 בתאי MDCK) כדי להבטיח שונות נמוכה בין ניסויים.
1. הכנת ריאגנטים וחומרי התחלה
<ol><li>הכנת תאי MDCK ומדיום תרבית תאים סטריליים<ol>
<li>טפחו תאי כליות ...

<ol>
	<li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+influenza+transmission.">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).</li><li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks.">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li><li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats.">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li><li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH,+temperature,+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water.">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li><li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature,+Salinity,+and+pH.">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice.">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li><li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+(Distilled+Water,+Normal+Saline,+and+Surface+Water)+at+Different+Temperatures.">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li><li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water.">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).</li><li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+(H1N1)+virus+in+water+and+on+non-porous+surface.">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).</li><li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020)</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza:+Propagation,+Quantification,+and+Storage.">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells.">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li><li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration,+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances.">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li><li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+(RTCA)+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus.">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology.">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li><li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process.">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li><li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+(H1N1)+Virus.">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay.">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li><li>Labadie, T., Bat&#233;jat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment.">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).</li><li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus.">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li></ol>

RTCA היא טכנולוגיה מבוססת עכבה המשמשת יותר ויותר לניטור בזמן אמת של תכונות התא, כגון דבקות בתאים, התפשטות, הגירה וציטוטוקסיות. במחקר זה, היכולת של טכנולוגיה זו להעריך את הישרדות IAV מחוץ למארח מודגמת על ידי מדידת מדרון אי-השבתת וירוסים. טכניקות קפדניות כגון TCID50 ובדיקות פלאק מוחלפות על יד...

העברת וירוס מסתמכת על שילוב של מספר גורמים. עבור וירוס המופרש בסביבה, העברתו תלויה גם ביכולת להתמיד בתנאים מחוץ למארח. לימוד אי-ההשבתה הנגיפית באופן כללי הוא, אם כן, צעד מכריע בסיוע לרשויות הבריאות הלאומיות ולקובעי המדיניות ליישם אמצעי בקרה ובטיחות ביולוגית.
הידע על התמדה בנגיף בהגדרות טבעיות ומעבדה גדל במידה ניכרת בעשור האחרון. במקרה של וירוסי שפעת A (IAV), נתיבי ההולכה שלהם מגישים חלקיקים ויראליים למגוון רחב של תנאים סביבתיים. באופן ספציפי, הם יכולים להיות מועברים באמצעות 1) מסלולים צואתיים דרך מים (כלומר, וירוסי עופות), או 2) מגע ישיר או עקיף על ידי fomites מזוהמים, כמו גם אירוסולים וטיפות נשימה (כלומר, עופות ווירוסים יונקים)1. בכל מקרה, IAV מוגשים לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים (כלומר, pH, מליחות, טמפרטורה ולחות), אשר משפיעים פחות או יותר במהירות על הזיהום שלהם2,3,4,5,5,6,7,8,9. יש חשיבות רבה, במיוחד לגבי וירוסים זואונוטיים ומגיפה, כדי להעריך את הפוטנציאל של גורמים סביבתיים להשפיע על הדינמיקה של וירוס ואת הסיכונים של חשיפה והעברה בין מינים.
עד כה, טכניקות וירולוגיה מסורתיות (כלומר, קביעת טיטר ויראלי באמצעות בדיקות פלאק או 50% תרבות רקמות הערכת מינון זיהומיות) שימשו להערכת זיהום IAV לאורך זמן; אבל טכניקות אלה גוזלות זמן רב ודורשות אספקה רבה 10,11,12. מדידת עכבה תאים נגועים לאורך זמן עם microelectrodes משמש ככלי שימושי כדי לפקח על הישרדות IAV בתנאים סביבתיים שונים, כמו גם איון ויראלי בכלל. שיטה זו מספקת נתונים אובייקטיביים בזמן אמת המחליפים התבוננות אנושית סובייקטיבית של השפעות ציטופתיות. זה יכול לשמש כדי לקבוע את טיטר וירוס, ובכך להחליף מדידות מסורתיות עם מרווחי ביטחון נמוכים יותר והימנעות בדיקות נקודות קצה אינטנסיביות עבודה.
קיים מתאם ליניארי בין תוצאות טיטרציה המתקבלות על ידי מדידה של עכבה בתא ועל ידי בדיקת פלאק קלאסית או שיטות TCID50. לכן, נתונים המתקבלים בשיטת טיטרציה מבוססת עכבה ניתן לשנות בקלות ערכי TCID50 או pfu על ידי יצירת עקומה סטנדרטית עם דילול סדרתי של הנגיף13,14,14,15,16,17. זיהוי, כימות ויעילות של נטרול נוגדנים הנמצאים בדגימות סרום ניתן להשיג גם באמצעות גישה ניסיונית זו18,19. לאחרונה, בדיקות תאיות מבוססות עכבה שימשו כדי לסנן ולהעריך תרכובות אנטי ויראליות נגד Equid alphaherpesviruses20.
טכנולוגיה זו שימשה להערכת ההתמדה של IAVs במים מלוחים בטמפרטורות שונות וכדי לזהות מוטציות hemagglutinin של IAV להגדיל או להקטין את ההתמדה IAV בסביבה21. סינון כזה ידרוש עבודה נרחבת אם משתמשים בשיטות טיטרציה מסורתיות. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו עבור כל וירוס בעל השפעה על מורפולוגיה של תאים, מספר תא ועוצמת ההתקשרות של פני התא. זה יכול לשמש גם כדי לפקח על התמדה בתנאים סביבתיים שונים (כלומר, באוויר, במים, או על משטחים).
הפרוטוקול המתואר כאן מיישם את הישרדות IAV במים כדוגמה. נגיפי שפעת אנושית נחשפים לפרמטרים פיזיקוכימיים שונים בתקופות ממושכות. מי מלוחים (35 גרם / L NaCl) בטמפרטורה של 35 °C (35 °F) נבחרו כמודל הסביבתי בהתבסס על תוצאות קודמות9. הדבקה שיורית של וירוסים חשופים מכמתת בנקודות זמן שונות באמצעות זיהום תאים. תאי MDCK, סוג תא הייחוס להגברת IAV, נזרעים על 16 לוחות מיקרוטיטר היטב מצופים בחיישני מיקרואלקטרודים ומודבקים בווירוסים חשופים 24 שעות מאוחר יותר. עכבה תאית נמדדת כל 15 דקות ומתבטאת כיחידה שרירותית הנקראת אינדקס התא (CI). השפעות ציטוטפתיות הנגרמות על ידי וירוס שפעת, שקצב הופעתו תלוי ישירות במספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים המחוסנים לתרבית התאים, מוביל לירידה ב- CI, אשר לאחר מכן מכמת כערך CIT50 . ערך זה מתאים לזמן הדרוש כדי למדוד הפחתה של 50% מה- CI הראשוני (כלומר, לפני הוספת וירוס). ערכי CIT50 המחושב עבור מספר פעמים חשיפה סביבתית מאפשרים ניכוי של שיפוע ההשבתה של וירוס לאחר רגרסיה ליניארית של ערכי CIT50 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Plate 16 (6 plates)</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>5469830001</td>
			<td>E-plates are avalible in different packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>31095029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>380601310</td>
			<td>The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis

שיטות לכימות חלקיקי וירוס מייצגות היבט קריטי של מחקרים וירולוגיים רבים. למרות שקיימות מספר טכניקות אמינות, הן גוזלות זמן רב או אינן מסוגלות לזהות וריאציות קטנות. מוצג כאן פרוטוקול לכימות מדויק של טיטר ויראלי על ידי ניתוח וריאציות עכבה חשמלית של תאים נגועים בזמן אמת. עכבה תאית נמדדת באמצעות ביו-סנסורים מיקרואלקטרודים מזהב הממוקמים מתחת לתאים במיקרופלסטיק, שבהם הגודל תלוי במספר התאים, כמו גם בגודלם ובצורתם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של התפשטות תאים, כדאיות, מורפולוגיה והגירה עם רגישות מוגברת. כמו כן מסופקת דוגמה ליישום מעשי על ידי כימות הריקבון של וירוס שפעת A (IAV) שהוגש לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים המשפיעים על זיהום ויראלי לאורך זמן (כלומר, טמפרטורה, מליחות, pH). עבור יישומים כאלה, הפרוטוקול מפחית את עומס העבודה הדרוש תוך יצירת נתוני כימות מדויקים של חלקיקי וירוס זיהומיות. זה מאפשר השוואה של מדרונות אי-השבתה בין IAV שונים, אשר משקף את יכולתם להתמיד בסביבה נתונה. פרוטוקול זה קל לביצוע, ניתן לשחזור מאוד, והוא יכול להיות מיושם על כל וירוס המייצר אפקטים ציטופתיים בתרבית התא.

נתונים גולמיים המתקבלים לאחר 120 שעות עם ריכוזים שונים של תאי MDCK, מ-15,000 ל-120,000 תאים לבאר, מוצגים באיור 1. לאחר 24 שעות, מדדי CI מראים כי תאים בבארות זרעו עם 30,000 תאים היו עדיין בשלב המעריכי של צמיחה, וריכוז התא הזה שימש לניסויים נוספים. איור 2 ממחיש את המתאם הליניארי ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

שיטות לכימות חלקיקים שונות מייצגות היבט קריטי של רוב מחקרי הביולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויק של הנתונים הנגיפיים בזמן אמת. טכניקה זו מחליפה את המדידה המסורתית של נתונים ויראליים.על-ידי נתונים אובייקטיביים בזמן אמת, אנו נמצאים מתחת למרווח הביטחון שלנו, תוך הימנעות מנקודות קצה עתירות עבודה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל הווירוסים הגורמים לאפקט ציטופתי. מי שידגים את ההליך יהיה קוונטין גראסין, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלנו.כדי להפיץ ולהגביר וירוסי H1N1, זרע 7.5 כפול 10 ל 6 תאי MDCK על שני צלוחיות תרבית רקמות 75 ס"מ רבוע על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ודגר את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להגיע 90 עד 100% מפגש. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטרים של PBS סטרילי לכל בקבוקון לכל לשטוף, ולתייג בקבוקון אחד כמו הפקד. לאחר מכן, לדלל בקבוקון מופשר של שפעת מלאי וירוסים לריכוז הניסיוני המתאים בצינור 1.5 מיליליטר המכיל מדיום התפשטות וירוס טרי.השתמש מיליליטר אחד של המלאי המדולל כדי להדביק את תאי MDCK בריבוי של זיהום של 1 כפול 10 למינוס 3, או 1 כפול 10 למינוס 4 יחידות יוצרות פלאק לכל תא, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום התפשטות וירוס לבקבוק הבקרה. ספיחה הנגיף לתאים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, עם ערבוב כל 15 דקות. בסוף הדגירה, להסיר את inoculum ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר של מדיום התפשטות וירוס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של טריפסין TPCK כדי להקל על מחשוף של hemagglutinin נגיפי HA0 לתוך יחידות משנה HA1 ו HA2.לאחר מכן מניחים את הבקבוקון בחממה של 35 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. בסוף הדגירה, השווה את התאים בכל תרבית תחת מטרה של 40x על מיקרוסקופ אור כדי להעריך את ההשפעות הציטוטפתיות על התאים. כאשר ההשפעה הציטופתית הושלמה, הוסף את supernatants תרבית התאים לצינור 15 מ"מ ולאסוף את הפסולת התאית מכל תרבות על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן, העבירו את תרבות הנגיף המובהקת לצינור של 15 מיליליטר, והעבירו את נגיפי הצאצאים לבקבוקונים קריוגניים סטריליים לשימוש חד פעמי לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את כמות התא המתאים לזיהום תאים, להכין 24 שעות ביממה כ 80% תרביות תא MDCK משולב כפי שהודגם לפני שטיפת התאים עם PBS ולקצור אותם עם דגירה של 45 דקות בשלוש מיליליטר של 0.25%טריפסין-EDTA לכל בקבוק ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מתנתקים, הפסיקו את התגובה עם שבעה מיליליטרים של תרבית טרייה בינונית לכל בקבוקון, וספרו את התאים מכל תרבית.לדלל את התאים ל 4 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של מדיום תרבית התא ולבצע דילול טורי כפול של התאים כפי שצוין. מניחים צלחת אלקטרונית בטמפרטורת החדר במשך מספר דקות לפני הוספת 100 מיקרוליטרים של תרבית תאים בינונית לכל באר מבלי לגעת באלקטרודות של הצלחת האלקטרונית. פתחו את העריסות והכניסו את הקצה הקדמי של הצלחת לכיס העריסה של מכשיר מדידת העכבה.סגור את דלת האינקובטור ופתח את התוכנה. בהגדרת תבנית הניסוי המוגדרת כברירת מחדל, סמן את העריסות שנבחרו ולחץ פעמיים בעמוד העליון כדי להזין את שם הניסוי. לחץ על פריסה והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה בלוח.לחץ על תזמון, שלבים והוסף שלב. התוכנה תוסיף באופן אוטומטי שלב של שנייה אחת כדי למדוד את העכבה ברקע לחץ על ביצוע והתחלה, המשך. לחץ על התווה והוסף כדי לבחור את הבארות המתאימות, המאשרות כי עכבה ברקע היא בין מינוס 0.1 ל- 0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.לאחר מכן, להסיר את הצלחת מן העריסה ולהוסיף 100 microliters של כל השעיה תא לבארות המתאימות בשכפול. השאירו את צלחת E במכסה המנוע לזרימה למינארית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר חלוקה אחידה של התאים על קרקעיות הבארות לפני טעינת צלחת E לכיס העריסה. לחץ על תזמן והוסף שלב והזן ערכים כדי לפקח על התאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות לפני בחירת התחל, המשך.כדי לבדוק ולהתוות את נתוני עכבה התא, לחץ על התווה ובחר את ריכוז התאים שנמצא ממש לפני השלב הנייח 24 שעות לאחר הזריעה כדי להשיג תאים שעדיין נמצאים בשלב גידול במהלך הזיהום הנגיפי. כדי לקבוע את המתאם בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום, לאחר כת 3 כפול 10 עד 4 תאי MDCK שזה עתה התפצלו לכל באר של צלחת המיקרוטיטר האלקטרונית למשך 24 שעות, שטפו את התאים פעמיים עם 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוס טרי לבאר, לכל שטיפה, והשתמשו בפיפטה חד-ערוצית כדי להוסיף 100 מיקרוליטרים של השעיה ויראלית לכל באר. כאשר כל דילול הנגיף נוספו, טען בעדינות את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב 35 מעלות צלזיוס, ולהתחיל ניטור עכבה התא כל 15 דקות לפחות 100 שעות, כפי שהוכח.לאחר שני מחזורים של מדידות, לחץ כדי להשהות את המנגנון, ולהסיר את צלחת E מהעריסה. הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוס בתוספת טריפסין TPCK לכל באר ולהחזיר את צלחת E לכיס העריסה. לאחר מכן, התחל את הניתוח.כדי להעריך את שפעת A וירוס הישרדות קינטיקה, להוסיף נתרן כלורי לריכוז סופי של 35 גרם לליטר במים מזוקקים, ולהוסיף 900 microliters של תמיסת מלח וכתוצאה מכך שתי מיקרו-צינורות קריו. הוסף 100 מיקרוליטרים מלאי ויראלי לכל קריו-שפופרת והנח את הצינורות בחממה של 35 מעלות צלזיוס לפרק הזמן הניסיוני המתאים. יום לפני תום הדגירה, זרעים 3 כפול 10 עד 4 תאי MDCK מפוצלים טריים ו -100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוסים לבאר בצלחת מיקרוטיטר של 16 בארות בשלבים חוזרים, המאפשרים מדידה של עכבה ברקע וחלוקה אחידה של התאים לתחתית הבארות.לאחר מכן לגדל את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים, ולאחר מכן להדביק את התאים עם 100 microliters של הנגיף מזוקק מלוחים מדולל 10 פעמים במדיום תרבית טרי, כפי שהוכח, ולפקח על עכבה התא כל 15 דקות לפחות 100 שעות. כאן, נתונים גולמיים המתקבלים לאחר 120 שעות עם ריכוזים שונים של תאי MDCK מוצגים.לאחר 24 שעות, מדידות מדד התאים גילו כי תאים בבארות שנזרעו עם 3 כפול 10 עד 4 התאים היו עדיין בשלב המעריכי של הצמיחה, ולכן, ריכוז תאים זה שימש לניסויים הבאים. תרביות תאים MDCK להפגין קשר ליניארי ברור בין CIT50 ואת הריבוי הראשוני של זיהום על ידי וירוס שפעת. התוצאות מניסוי קינטי הישרדות טיפוסי מראות ירידה במדד התאים עקב השפעה ציטופתית הנגרמת על ידי וירוס.ניתן להשתמש ב- CIT50 כדי לחשב את שיפוע ההשבתה הנגיפי עבור כל וירוס בכל תנאי לקביעה איזה וירוס היה היציבות הגדולה ביותר בסביבה הנחקרת. היציבות של הנגיף בקורלציה עקיפה למדרון ההשבתה, ומאפשרת, למשל, שאריות חומצות אמינו בגליקופרוטאין המגלוטין המעורבים בשפעת A הישרדות וירוס מחוץ לפונדקאי להיות מזוהה. טכניקה זו רגישה מאוד לווריאציות קטנות.לכן, מומלץ להשתמש במונה תאים אוטומטי על מנת להשיג תוצאות הניתנות לשחזור בין ניסויים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות את השכפול של וירוסים שונים, כדי לחקור את הטרופיזם וירוס עבור מספר קווי תאים בכל פעם, או ללמוד שלבים ספציפיים של מחזור הנגיף.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...