Name: monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

적절한 생체 안전 수준 요구 사항 (BSL-2 이상 하위 유형에 따라) 모든 인플루엔자 바이러스를 처리하십시오. 낮은 통로 기록 (MDCK 세포에 5 배 미만)을 가진 IAV 균주를 사용하여 실험 사이의 낮은 변화를 보장하십시오.
1. 시약 및 시작 재료의 준비
<ol><li>MDCK 세포 및 멸균 세포 배양 배지의 준비<ol>
<li>10% 열 불활성 태아 종아리 혈청(FCS) 및 항생제(100단위/mL 페니실린, 100 mg/mL 연?...

<ol>
	<li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+influenza+transmission.">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).</li><li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks.">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li><li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats.">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li><li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH,+temperature,+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water.">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li><li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature,+Salinity,+and+pH.">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice.">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li><li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+(Distilled+Water,+Normal+Saline,+and+Surface+Water)+at+Different+Temperatures.">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li><li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water.">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).</li><li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+(H1N1)+virus+in+water+and+on+non-porous+surface.">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).</li><li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020)</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza:+Propagation,+Quantification,+and+Storage.">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells.">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li><li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration,+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances.">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li><li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+(RTCA)+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus.">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology.">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li><li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process.">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li><li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+(H1N1)+Virus.">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay.">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li><li>Labadie, T., Bat&#233;jat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment.">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).</li><li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus.">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li></ol>

RTCA는 세포 준수, 증식, 마이그레이션 및 세포 독성과 같은 세포 특성의 실시간 모니터링에 점점 더 많이 사용되는 임피던스 기반 기술입니다. 이 연구에서는, 호스트 외부의 IAV 생존을 평가하는 이 기술의 능력은 바이러스 불활성화 경사를 측정하여 입증된다. TCID50 및 플라크 애세와 같은 까다로운 기술은 세포 생존가능성에 대한 객관적인 실시간 평가로 대체되므로 바이러스에 의해 유?...

바이러스의 전송은 몇몇 요인의 조합에 의존합니다. 환경에서 분비된 바이러스의 경우, 전송은 호스트 외부의 조건에서 지속되는 능력에 따라 달라집니다. 일반적으로 바이러스 성 불활성화를 연구하는 것은, 그러므로, 국가 보건 당국과 정책 입안자가 통제 및 생물 안전 조치를 실행하는 것을 돕는 중요한 단계입니다.
자연 및 실험실 설정에서 바이러스 지속성에 대 한 지식은 지난 10 년 동안 상당히 증가 했다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 이들의 전송 경로는 광범위한 환경 조건에 바이러스 입자를 제출합니다. 구체적으로, 1) 배설구 경로를 통해 물(즉, 조류 바이러스) 또는 2) 오염된 포미트뿐만 아니라 에어로졸 및 호흡기 방울(즉, 가금류 및 포유류 바이러스)에 의한 직접 또는 간접 접촉을 통해 전달될 수 있다. 어쨌든, IAV는 다양한 물리화학적 매개변수(즉, pH, 염분, 온도 및 습도)에 제출되며, 이는 감염성에 다소 빠르게 영향을 미칩니다2,3,4,5,6,7,8,9. 특히 동물노닉 및 전염병 바이러스에 관한 매우 중요하며, 바이러스 역학에 영향을 미치는 환경 요인의 잠재력과 노출 및 종 간 전염의 위험을 평가하는 것이 매우 중요합니다.
지금까지, 전통적인 바이러스학 기술 (즉, 플라크 애스터또는 50% 조직 배양 전염성 용량 추정을 통해 바이러스 성 titer 결정) 시간이 지남에 따라 IAV 감염성을 평가하는 데 사용되었습니다; 그러나 이러한 기술은 시간이 많이 소요되며 많은 공급이 필요합니다10,11,12. 감염된 세포를 마이크로 전극으로 시간이 지남에 따라 임피던드를 측정하는 것은 일반적으로 바이러스 성 불활성화뿐만 아니라 다른 환경 조건에서 IAV 생존을 모니터링하는 유용한 도구역할을합니다. 이 방법은 세포 병증 효과의 주관적인 인간 관찰을 대체하는 객관적인 실시간 데이터를 제공합니다. 그것은 바이러스 적정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 따라서 낮은 신뢰 간격으로 기존의 측정을 대체하고 노동 집약적 인 엔드 포인트 측정을 피할 수 있습니다.
선형 상관 관계는 세포 임피던드의 측정과 고전적인 플라크 분석또는 TCID50 방법에 의해 얻어진 적정 결과 사이에 존재한다. 따라서, 임피던스 기반 적정 법으로 얻은 데이터는 바이러스의 직렬 희석을 이용한 표준 곡선을 생성하여 TCID50 또는 pfu 값에서 쉽게 변형될 수 있다13,14,15,16,17. 혈청 시료에 존재하는 항체중화의 검출, 정량화 및 효능또한 이러한 실험접근법18,19를 사용하여 달성될 수 있다. 최근에는 임피던스 기반 세포 소가 Equid alphaherpesviruses20에 대한 항바이러스 화합물을 선별하고 평가하는 데 사용되었습니다.
이 기술은 다른 온도에서 식염수에서 IAV의 지속성을 평가하고 환경에서 IAV 지속성을 증가또는 감소IAV의 헤마글루티닌에서 돌연변이를 식별하는 데 사용되었습니다21. 이러한 심사는 전통적인 적정 방법을 사용하는 경우 광범위한 작업이 필요합니다. 그러나, 이 방법론은 세포 형태, 세포 수 및 세포 표면 부착 강도에 영향을 미치는 모든 바이러스에 사용될 수 있다. 또한 다양한 환경 조건(예: 공기, 물 또는 표면)에서 지속성을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 물에 IAV 생존을 예로 적용합니다. 인간 인플루엔자 바이러스는 장기간 다른 물리화학 적 매개 변수에 노출됩니다. 식염수(35g/L NaCl)의 35°C에서 의 물은 이전 결과에 기초하여 환경 모델로 선택되었다9. 노출된 바이러스의 잔류 감염성은 세포 감염을 통해 상이한 시점에서 정량화된다. IAV 증폭을 위한 기준 세포 형인 MDCK 세포는 마이크로 전광제 센서로 코팅된 16개의 잘 된 마이크로티터 플레이트에 시드되고 24시간 후에 노출된 바이러스에 의해 감염된다. 세포 임피던스는 매 15분마다 측정되고 세포 지수(CI)라고 불리는 임의단위로 표현된다. 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 세포요법 효과는, 그 개시의 비율은 세포 배양에 접종된 전염하는 바이러스성 입자의 수에 직접적으로 의존합니다, CI 감소로 이끌어 내고, 이는 그 후에 CIT50 값으로 정량화됩니다. 이 값은 초기 CI(즉, 바이러스 첨가 전)로부터 50% 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당합니다. 여러 환경 노출 시간에 대해 계산된 CIT50 값은 CIT50 값의 선형 회귀 후 바이러스의 불활성화 경사를 공제할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Plate 16 (6 plates)</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>5469830001</td>
			<td>E-plates are avalible in different packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>31095029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>380601310</td>
			<td>The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis

바이러스 입자 정량화에 대한 방법은 많은 바이러스학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 몇 가지 신뢰할 수 있는 기술이 존재하지만 시간이 많이 걸리거나 작은 변형을 감지할 수 없습니다. 여기에 제출된 것은 감염된 세포의 전기임피던스 변이를 실시간으로 분석하여 바이러스 성 티터의 정확한 정량화를 위한 프로토콜이다. 세포 임피던스는 마이크로 플레이트의 세포 아래에 위치한 금 마이크로 전기 전전자 바이오 센서를 통해 측정되며, 크기는 세포의 수와 크기와 모양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜을 사용하면 향상된 감도로 세포 증식, 생존 가능성, 형태 학 및 마이그레이션을 실시간으로 분석할 수 있습니다. 또한 시간이 지남에 따라 바이러스 감염에 영향을 미치는 다양한 물리화학 적 매개 변수 (즉, 온도, 염도 및 pH)에 제출 된 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)의 부패를 정량화하여 실용적인 응용 프로그램의 예가 제공됩니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 프로토콜은 전염성 바이러스 입자의 정확한 정량화 데이터를 생성하는 동시에 필요한 워크로드를 줄입니다. 그것은 주어진 환경에서 지속 할 수있는 용량을 반영하는 다른 IAV 사이의 불활성화 슬로프의 비교를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 매우 재현 가능하며, 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 모든 바이러스에 적용 될 수 있습니다.

MDCK 세포의 상이한 농도를 가진 120시간 후에 얻어진 원시 데이터는, 15,000에서 120,000세포당, 도 1에 도시된다. 24시간 후, CI 측정은 30,000개의 세포로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었으며, 이 세포 농도가 추가 실험을 위해 사용되었다는 것을 보여준다. 도 2 는 CIT50 값과 초기 감염 복합성 사이의 선형 상관관계를 보여...

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Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

다양한 입자 정량화를 위한 방법은 대부분의 생물학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 바이러스 성 데이터의 정확한 정량화를 실시간으로 허용합니다. 이 기술은 바이러스 데이터의 전통적인 측정을 대체합니다.객관적인 실시간 데이터를 통해, 우리는 평가된 노동 집약적인 엔드포인트를 피하면서 신뢰 도면에 미치지 못하고 있습니다. 이 방법은 세포 병증 효과를 유도하는 모든 바이러스에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 기술자 인 쿠엔틴 그라신 (Quentin Grassin)이 될 것입니다.H1N1 바이러스를 전파하고 증폭하기 위해 표준 프로토콜에 따라 75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에 6 MDCK 세포에 7.5 배 10을 씨앗, 90 ~ 100 %의 합류에 도달하기 위해 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양. 다음 날, 세척당 플라스크 당 멸균 PBS 5 밀리리터로 세포를 두 번 세척하고 플라스크 를 대조군으로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 신선한 바이러스 전파 배지를 함유한 1.5밀리리터 튜브에서 적절한 실험 농도로 인플루엔자 A 바이러스 스톡의 해동 유리병을 희석한다.희석된 주식의 1밀리리터를 사용하여 MDCK 세포를 1배 10의 감염으로 감염하여 음수 3, 또는 1회 10을 셀당 음수 4플라크 형성 단위로 감염시키고, 대조군 플라스크에 바이러스 전파 배지 1밀리리터를 첨가한다. 15분마다 저어주면서 실온에서 45분 동안 바이러스를 세포에 흡착시합니다. 인큐베이션의 끝에서, 접종을 제거하고 HA1 및 HA2 서브 유닛으로 바이러스 헤마글루티닌 HA0의 분열을 용이하게하기 위해 TPCK 트립신의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 보충된 바이러스 전파 매체의 15 밀리리터로 대체한다.그런 다음 플라스크를 섭씨 35도 인큐베이터에 3일 동안 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포에 대한 세포 병증 효과를 평가하기 위해 가벼운 현미경에 40배 의 목표 하에서 각 배양에서 세포를 비교한다. 세포병증 효과가 완료되면 세포 배양 슈퍼나티를 15mm 튜브에 추가하고 원심분리에 의해 각 배양에서 세포 이물질을 수집합니다.이어서, 15밀리리터 튜브로 명확한 바이러스 배양 상수체를 전송하고, 자손 바이러스를 영하 80도 저장을 위한 일회용 멸균 극저온 바이알로 알리쿼트한다. 세포 감염에 적합한 세포 수량을 결정하기 위해 PBS로 세포를 세척하고 플라스크 당 0.25 %의 3 밀리리터에서 45 분 배양으로 수확하기 전에 입증 된 대로 24 시간 약 80 %의 COfluent MDCK 세포 배양을 준비하십시오. 세포가 분리되면 플라스크 당 신선한 배양 배지의 7 밀리리터로 반응을 멈추고 각 배양에서 세포를 계산합니다.세포 배양 배지의 밀리리터 당 5세포에 4배 10번으로 세포를 희석시키고 지시된 바와 같이 세포의 2배 연속 희석을 수행한다. E 플레이트의 전극을 만지지 않고 각 웰에 세포 배양 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하기 전에 몇 분 동안 실온에서 전자 플레이트를 놓습니다. 요람의 잠금을 해제하고 임피던스 측정 기기의 요람 주머니에 플레이트 프런트 엔드를 삽입합니다.인큐베이터의 문을 닫고 소프트웨어를 엽니다. 기본 실험 패턴 설정에서 선택한 요람을 강조 표시하고 상단 페이지를 두 번 클릭하여 실험 이름을 입력합니다. 레이아웃을 클릭하고 플레이트의 각 선택된 웰에 필요한 샘플 정보를 입력합니다.일정, 단계 및 단계를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 배경 임피던스 클릭 실행 및 시작, 계속을 측정하기 위해 1 초 단계를 추가합니다. 플롯을 클릭하고 추가하여 적절한 우물을 선택하여 배경 임피던스가 다음 단계로 진행하기 전에 음수 0.1에서 0.1 사이임을 확인합니다.다음으로, 요람에서 플레이트를 제거하고 각 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 복제하여 적절한 우물에 추가합니다. E 플레이트를 적층 유동 후드에 30분 동안 두어 E 플레이트를 요람 주머니에 적재하기 전에 우물 바닥에 셀을 균일하게 분배할 수 있도록 합니다. 일정 및 단계 추가값을 클릭하고 값을 입력하여 시작, 계속을 선택하기 전에 200회 반복을 위해 30분마다 셀을 모니터링합니다.세포 임피던스 데이터를 확인하고 플롯하려면, 플롯을 클릭하고 바이러스 감염 중 여전히 성장 단계에있는 세포를 얻기 위해 시드 후 24 시간 고정 단계 24 시간 앞에 있는 세포의 농도를 선택합니다. CIT50 값과 감염의 복합성 사이의 상관관계를 결정하기 위해, 4회 갓 분할된 MDCK 세포를 전자 마이크로티터 플레이트의 각 웰로 3배 10배 배양한 후, 세척당 100마이크로리터의 신선한 바이러스 전파 배지로 세포를 2회 세척하고, 각 10개의 마이크로리터에 10개의 마이크로리터를 추가하여 10개의 마이크로리티터를 첨가한다. 모든 바이러스 희석제가 첨가되면 플레이트를 35도의 요람 주머니에 부드럽게 적재하고, 입증된 바와 같이 15분마다 세포 임피던스 모니터링을 시작한다.측정의 두 주기 후, 장치를 일시 중지하려면 클릭하고 요람에서 전자 플레이트를 제거합니다. TPCK 트립신으로 보충된 100마이크로리터의 바이러스 전파 매체를 각 웰에 넣고 E 플레이트를 요람 포켓에 넣습니다. 그런 다음 분석을 시작합니다.인플루엔자 A 바이러스 생존 운동학을 평가하기 위해 증류수의 리터당 35그램의 최종 농도에 염화나트륨을 추가하고, 결과식염수 의 900 마이크로리터를 2밀리리터 저온튜브에 추가합니다. 각 저온 튜브에 100 마이크로리터 바이러스 성 스톡을 추가하고 적절한 실험 기간 동안 35도 섭씨 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나기 전날, 종자 3배 10~4차 갓 분할된 MDCK 세포와 16웰 마이크로티터 플레이트당 100마이크로리터의 바이러스 전파 배지를 반복단계로 반복하여, 웰 의 바닥에 있는 세포의 배경 임피던스 및 균일한 분포를 측정할 수 있다.그런 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 다음 날, 세포를 두 번 세척한 다음, 식염수 증류 바이러스의 100 마이크로리터로 세포를 감염시키고, 입증된 바와 같이 신선한 배양 배지에서 10회 희석하고, 적어도 100시간 동안 15분마다 세포 임피던스를 모니터링한다. 여기서, MDCK 세포의 상이한 농도로 120시간 후에 얻어진 원시 데이터가 도시된다.24시간 후, 세포 지수 측정결과, 4세포에 3배 10으로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었다는 사실이 밝혀졌으며, 따라서 이러한 세포 농도는 후속 실험에 사용되었다. MDCK 세포 배양은 인플루엔자 바이러스에 의한 CIT50과 초기 감염 복합성 사이의 명확한 선형 관계를 입증한다. 전형적인 생존 운동 실험에서 결과는 바이러스 유도 세포 병증 효과로 인한 세포 지수의 감소를 보여줍니다.CIT50은 연구된 환경에서 가장 큰 안정성을 가진 바이러스의 판정을 위해 각 조건에서 각 바이러스에 대한 바이러스 불활성화 경사를 계산하는 데 사용될 수 있다. 바이러스의 안정성은 간접적으로 불활성화 경사와 상관관계가 있으며, 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 생존에 관여하는 헤마글루티닌 당단백질내의 아미노산 잔류물이 확인될 수 있도록 한다. 이 기술은 작은 변화에 매우 민감합니다.따라서, 실험 사이에 재현 가능한 결과를 얻기 위해 자동 세포 카운터를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 또한 다른 바이러스의 복제를 비교하는 데 사용할 수 있습니다, 한 번에 여러 세포주에 대한 바이러스 트로피즘을 조사, 또는 바이러스 주기의 특정 단계를 연구.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...