Name: monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

Обрабатывать все вирусы гриппа в соответствии с соответствующими требованиями уровня биобезопасности (BSL-2 или выше в зависимости от подтипа). Используйте штаммы IAV с низкой историей прохождения (менее 5x на клетках MDCK), чтобы обеспечить низкую вариацию между экспериментами.
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+influenza+transmission.">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).</li><li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks.">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li><li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats.">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li><li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH,+temperature,+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water.">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li><li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature,+Salinity,+and+pH.">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice.">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li><li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+(Distilled+Water,+Normal+Saline,+and+Surface+Water)+at+Different+Temperatures.">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li><li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water.">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).</li><li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+(H1N1)+virus+in+water+and+on+non-porous+surface.">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).</li><li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020)</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza:+Propagation,+Quantification,+and+Storage.">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells.">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li><li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration,+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances.">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li><li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+(RTCA)+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus.">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology.">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li><li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process.">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li><li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+(H1N1)+Virus.">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay.">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li><li>Labadie, T., Bat&#233;jat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment.">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).</li><li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus.">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li></ol>

RTCA - это технология на основе импеданса, которая все чаще используется для мониторинга свойств клеток в режиме реального времени, таких как клеточная адгезия, пролиферация, миграция и цитотоксичность. В этом исследовании способность этой технологии оценивать выживаемость IAV вне хозяин...

Передача вируса зависит от сочетания нескольких факторов. Для вируса, секретируемого в окружающей среде, его передача также зависит от способности сохраняться в условиях вне хозяина. Таким образом, изучение вирусной инактивации в целом является решающим шагом в оказании помощи национальным органам здравоохранения и лицам, формирующим политику, в осуществлении мер контроля и биобезопасности.
За последнее десятилетие значительно возросли знания о персистенции вируса в естественных и лабораторных условиях. В случае вирусов гриппа А (IAV) их пути передачи представляют вирусные частицы в широком диапазоне условий окружающей среды. В частности, они могут передаваться через 1) фекально-оральные пути через воду (т.е. птичьи вирусы) или 2) прямой или косвенный контакт зараженных фомитов, а также аэрозолей и респираторных капель (т.е. вирусов домашней птицы и млекопитающих)1. В любом случае, IAV подвергаются различным физико-химическим параметрам (т.е. рН, солености, температуре и влажности), что более или менее быстро влияет на их инфекционность2,3,4,5,6,7,8,9. Очень важно, особенно в отношении зоонозных и пандемических вирусов, оценить потенциал факторов окружающей среды, влияющих на динамику вируса, и риски воздействия и межвидовой передачи.
До настоящего времени для оценки инфекционной активности IAV с течением времени использовались традиционные методы вирусологии (т.е. определение титра вируса с помощью анализов бляшек или 50% оценка инфекционной дозы культуры тканей); но эти методы отнимают много времени и требуют многих расходных материалов10,11,12. Измерение импеданса инфицированных клеток с течением времени с помощью микроэлектродов служит полезным инструментом для мониторинга выживаемости IAV в различных условиях окружающей среды, а также вирусной инактивации в целом. Этот метод предоставляет объективные данные в режиме реального времени, которые заменяют субъективное наблюдение человека за цитопатическими эффектами. Его можно использовать для определения титрования вируса, тем самым заменяя традиционные измерения более низкими доверительными интервалами и избегая трудоемких анализов конечных точек.
Существует линейная корреляция между результатами титрования, полученными путем измерения импеданса клеток, и классическим анализом бляшек или методами TCID50. Поэтому данные, полученные методом титрования на основе импеданса, могут быть легко преобразованы в значения TCID50 или pfu путем создания стандартной кривой с последовательным разбавлением вируса13,14,15,16,17. Обнаружение, количественная оценка и эффективность нейтрализующих антител, присутствующих в образцах сыворотки, также могут быть достигнуты с использованием этого экспериментального подхода18,19. Совсем недавно клеточные анализы на основе импеданса использовались для скрининга и оценки противовирусных соединений против альфагерпесвирусов Equid20.
Эта технология была использована для оценки стойкости IAV в соленой воде при различных температурах и для выявления мутаций в гемагглютинине IAV, которые увеличивают или уменьшают стойкость IAV в окружающей среде21. Такой скрининг потребует обширной работы при использовании традиционных методов титрования. Однако эта методология может быть использована для любого вируса, который оказывает влияние на морфологию клеток, количество клеток и силу прикрепления клеточной поверхности. Он также может быть использован для мониторинга стойкости в различных условиях окружающей среды (например, в воздухе, в воде или на поверхностях).
Протокол, описанный здесь, применяет выживание IAV в воде в качестве примера. Вирусы гриппа человека подвергаются воздействию различных физико-химических показателей в течение длительных периодов времени. Соленая (35 г/л NaCl) вода при 35 °C была выбрана в качестве экологической модели на основе предыдущих результатов9. Остаточная инфекционность подвергшихся воздействию вирусов количественно определяется в разные моменты времени через клеточную инфекцию. Клетки MDCK, тип эталонных клеток для амплификации IAV, засеивают на 16 микротитрных пластинах, покрытых микроэлектродными датчиками, и заражаются облученными вирусами через 24 ч. Импеданс клеток измеряется каждые 15 мин и выражается в виде произвольной единицы, называемой клеточным индексом (CI). Цитопатические эффекты, индуцированные вирусом гриппа, скорость начала которого напрямую зависит от количества инфекционных вирусных частиц, привитых культуре клеток, приводит к снижению ДИ, которое впоследствии количественно определяется как значение CIT50 . Это значение соответствует времени, необходимому для измерения снижения на 50% от исходного ДИ (т.е. до добавления вируса). Значения CIT50 , рассчитанные на несколько раз воздействия на окружающую среду, позволяют вывести наклон инактивации вируса после линейной регрессии значений CIT50 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Plate 16 (6 plates)</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>5469830001</td>
			<td>E-plates are avalible in different packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>31095029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>380601310</td>
			<td>The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis

Методы количественной оценки вирусных частиц представляют собой критический аспект многих вирусологических исследований. Хотя существует несколько надежных методов, они либо отнимают много времени, либо не могут обнаружить небольшие вариации. Здесь представлен протокол для точной количественной оценки вирусного титра путем анализа вариаций электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Клеточное сопротивление измеряется с помощью биосенсоров микроэлектрода золота, расположенных под клетками в микропластинах, величина которых зависит от количества клеток, а также их размера и формы. Этот протокол позволяет в режиме реального времени анализировать пролиферацию, жизнеспособность, морфологию и миграцию клеток с повышенной чувствительностью. Также приведен пример практического применения путем количественной оценки распада вируса гриппа А (IAV), представленного различным физико-химическим параметрам, влияющим на вирусную инфекционность с течением времени (т.е. температуре, солености и рН). Для таких приложений протокол снижает необходимую рабочую нагрузку, а также генерирует точные количественные данные инфекционных вирусных частиц. Это позволяет сравнивать склоны инактивации между различными IAV, что отражает их способность сохраняться в данной среде. Этот протокол прост в исполнении, обладает высокой воспроизводимостью и может быть применен к любому вирусу, вызывающему цитопатические эффекты в клеточной культуре.

Исходные данные, полученные через 120 ч при различных концентрациях клеток MDCK, от 15 000 до 120 000 клеток на лунку, показаны на рисунке 1. Через 24 ч измерения CI показывают, что клетки в колодцах, засеянных 30 000 клеток, все еще находились в экспоненциальной фазе роста, и эта концент?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Здесь представлен протокол количественной оценки инфекционных вирусных частиц с использованием мониторинга электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Практическое применение данного метода представлено путем количественной оценки распада вируса гриппа А при различных физико-химических параметрах, имитирующих условия окружающей среды.

Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Методы количественной оценки различных частиц представляют собой критический аспект большинства биологических исследований. Этот протокол позволяет точно количественно оценивать вирусные данные в режиме реального времени. Этот метод заменяет традиционное измерение вирусных данных.Благодаря объективным данным в реальном времени мы находимся ниже нашего доверительного интервала, избегая оценки трудоемких конечных точек. Этот метод может быть использован для всех вирусов, которые вызывают цитопатический эффект. Демонстрировать процедуру будет Квентин Грассин, лаборант из нашей лаборатории.Для размножения и амплификации вирусов H1N1 засейте 7,5 раз 10 до 6 клеток MDCK на двух колбах для культивирования тканей площадью 75 квадратных сантиметров в соответствии со стандартными протоколами и инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия, чтобы достичь 90-100% слияния. На следующий день промыть клетки два раза пятью миллилитрами стерильного PBS на колбу за стирку и пометить одну колбу в качестве контрольной. Затем разбавляют размороженный флакон с запасом вируса гриппа А до соответствующей экспериментальной концентрации в 1,5-миллилитровой пробирке, содержащей свежую среду распространения вируса.Используйте один миллилитр разбавленного вещества для заражения клеток MDCK при множественности инфекции от 1 раза 10 до отрицательных 3 или 1 раз 10 до отрицательных 4 бляшек на клетку и добавьте один миллилитр среды распространения вируса в контрольную колбу. Адсорбировать вирус к клеткам в течение 45 минут при комнатной температуре, помешивая каждые 15 минут. В конце инкубации удаляют инокулятор и заменяют его 15 миллилитрами среды размножения вируса, дополненной одним микрограммом на миллилитр трипсина TPCK для облегчения расщепления вирусного гемагглютинина HA0 на субъединицы HA1 и HA2.Затем поместите колбу в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на три дня. В конце инкубации сравните клетки в каждой культуре под 40-кратным объективом на световом микроскопе, чтобы оценить цитопатические эффекты на клетки. Когда цитопатический эффект будет завершен, добавьте супернатанты клеточной культуры в 15-миллиметровую трубку и соберите клеточный мусор с каждой культуры путем центрифугирования.Затем переложите осветленный супернатант культуры вируса в 15-миллилитровую трубку, а вирусы потомства переложите на одноразовые стерильные криогенные флаконы для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы определить соответствующее количество клеток для клеточной инфекции, подготовьте 24-часовое примерно 80% сливающихся клеточных культур MDCK, как показано перед промывкой клеток PBS и сбором их с 45-минутной инкубацией в трех миллилитрах 0,25% трипсина-ЭДТА на колбу при 37 градусах Цельсия. Когда клетки отделятся, остановите реакцию семью миллилитрами свежей питательной среды на колбу и посчитайте клетки из каждой культуры.Разбавляют клетки до 4 раз по 10 до 5 клеток на миллилитр клеточной культуральной среды и выполняют двукратное последовательное разведение клеток по показаниям. Поместите Е-пластину при комнатной температуре на несколько минут, прежде чем добавлять 100 микролитров клеточной культуральной среды в каждую лунку, не касаясь электродов Е-пластины. Разблокируйте люльки и вставьте передний конец пластины в карман колыбели прибора для измерения импеданса.Закройте дверцу инкубатора и откройте программное обеспечение. В настройках шаблона эксперимента по умолчанию выделите выбранные подставки и дважды щелкните верхнюю страницу, чтобы ввести имя эксперимента. Нажмите Макет и введите необходимую информацию об образце для каждого выбранного колодца пластины.Щелкните Расписание, шаги и Добавить шаг. Программное обеспечение автоматически добавит один секундный шаг для измерения фонового импеданса Нажмите Выполнить и Начать, Продолжить. Нажмите кнопку «График и добавить», чтобы выбрать подходящие скважины, подтвердив, что фоновое сопротивление находится между отрицательными 0,1 и 0,1, прежде чем перейти к следующему шагу.Далее снимите пластину с люльки и добавьте 100 микролитров каждой клеточной суспензии в соответствующие колодцы в двух экземплярах. Оставьте Е-пластину в ламинарной проточной вытяжке на 30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по дну колодцев перед загрузкой Е-пластины в карман колыбели. Щелкните Расписание и Добавить шаг и введите значения для наблюдения за ячейками каждые 30 минут в течение 200 повторений, прежде чем выбрать Начать, Продолжить.Чтобы проверить и построить график данных об импедансе клеток, нажмите «График» и выберите концентрацию клеток, которая находится непосредственно перед стационарной фазой через 24 часа после посева, чтобы получить клетки, которые все еще находятся в фазе роста во время вирусной инфекции. Чтобы определить корреляцию между значениями CIT50 и множественностью инфекции, после культивирования 3-кратно 10 до 4-й свежерасщепленных клеток MDCK в каждую лунку электронной микротитровой пластины в течение 24 часов промыть клетки два раза 100 микролитрами свежей среды распространения вируса на скважину, на промывку, и использовать одноканальную пипетку для добавления 100 микролитров вирусной суспензии в каждую лунку. Когда все разбавления вируса будут добавлены, осторожно загрузите пластину в карман колыбели инструмента при 35 градусах Цельсия и начните мониторинг импеданса клеток каждые 15 минут в течение не менее 100 часов, как показано.После двух циклов измерений нажмите, чтобы приостановить аппарат, и снимите Е-пластину с люльки. Добавьте в каждую лунку 100 микролитров среды для размножения вируса, дополненной трипсином TPCK, и верните Е-пластину в карман колыбели. Затем приступайте к анализу.Для оценки кинетики выживаемости вируса гриппа А добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 35 грамм на литр в дистиллированной воде и добавляют 900 микролитров полученного солевого раствора в двухмиллилитрные криотрубки. Добавьте 100 микролитров вирусного запаса в каждую криотрубку и поместите трубки в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на соответствующий экспериментальный период времени. За день до окончания инкубации засевают 3 раза по 10 до 4-го свежерасщепленных клеток MDCK и 100 микролитров среды размножения вируса на лунку в 16-луночную микротитровую пластину в повторных шагах, что позволяет измерить фоновое сопротивление и равномерное распределение клеток на дно лунок.Затем выращивайте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день промыть клетки дважды, затем заразить клетки 100 микролитрами соленого дистиллированного вируса, разбавленного 10 раз в свежей питательной среде, как показано, и контролировать импеданс клеток каждые 15 минут в течение не менее 100 часов. Здесь показаны исходные данные, полученные через 120 часов с различными концентрациями клеток MDCK.Через 24 часа измерения клеточного индекса показали, что клетки в колодцах, засеянных 3 раза 10 до 4-х клеток, все еще находились в экспоненциальной фазе роста, поэтому эта концентрация клеток использовалась для последующих экспериментов. Клеточные культуры MDCK демонстрируют четкую линейную зависимость между CIT50 и начальной множественностью инфекции вирусом гриппа. Результаты типичного кинетического эксперимента по выживанию показывают снижение клеточного индекса из-за вирус-индуцированного цитопатическим эффектом.CIT50 может быть использован для расчета наклона вирусной инактивации для каждого вируса в каждом состоянии для определения того, какой вирус имел наибольшую стабильность в исследуемой среде. Стабильность вируса косвенно коррелирует со склоном инактивации, позволяя, например, идентифицировать аминокислотные остатки в гемагглютининовом гликопротеине, которые участвуют в выживании вируса гриппа А вне хозяина. Эта техника очень чувствительна к небольшим вариациям.Поэтому рекомендуется использовать автоматический счетчик клеток для получения воспроизводимых результатов между экспериментами. Этот метод также может быть использован для сравнения репликации различных вирусов, для исследования тропизма вируса для нескольких клеточных линий одновременно или для изучения конкретных этапов вирусного цикла.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...