Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

نود أن نشكر الدكتور كريستيان لانكت في BIOCEV (براغ ، جمهورية التشيك) لتعليمنا تقنية micropipette الفم لتركيب الديدان الثابتة والدكتورة فاطمة سانتوس والدكتورة ديبي دراج لتقاسم الإعداد السلامة على micropipette الفم. كما نشكر فرانشيسكا هودج على تحرير المخطوطة، ومرافق معهد شارلين مردوخ وبابراهام لدعمهم. OC معتمد من قبل ERC 638426 و BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

محاذاة الفيروس المتنقل هي خط أنابيب معالجة الصور القائم على فيجي الذي يولد بسهولة المونتاج من الديدان التي يختارها المستخدم، حيث يتم تقويم الديدان ومحاذيتها للمساعدة في المقارنة البصرية والتصنيف والتمثيل. على الرغم من أن هذه الميزة هي أيضا التي تقدمها بعض الأدوات الموجودة ، لا سيما وحدة WormToolbox في CellProfiler7، دودة محاذاة يتطلب القليل نسبيا من تجربة تحليل الصور السابقة : المستخدمين بحاجة فقط لتتبع تلك الديدان التي ترغب في تحديد للمونتاج (والتحليل). على الرغم من أن تتبع الديدان على بيانات الصورة الخام هو عملية سهلة - خاصة عندما يتوفر جهاز كمبيوتر أو قرص يعمل باللمس - ، فمن الأهمية بمكان ، أن يتم رسم الخطوط بشكل صحيح على طول المحور الطولي للدودة. خطوط غير مكتملة، التي تتبع سوى جزء من الدودة، سوف يؤدي إلى الديدان الجزئية في المونتاج (أي، الديدان في عداد المفقودين رؤساء من ينتهي الذيل) وأقنعة التجزئة الجزئية أثناء تحليل CellProfiler. أيضا، إذا خطوط من اثنين من الديدان الفردية عبر، لن تتم معالجة الديدان بشكل صحيح في المونتاج محاذاة دودة وكذلك لتكميم الفلوريسين. لمراقبة الجودة يتم حفظ صورة تراكب من التحديدات الخط على الصورة الأصلية في مجلد البيانات، جنبا إلى جنب مع جدول QC. من هذه الخطوط الإشكالية التي ستؤدي إلى ديدان مجزأة بشكل غير صحيح يمكن بسهولة تحديدها واستبعادها من مونتاج و/ أو تحليل لاحق.
على الرغم من أن المدخلات المباشرة من المجرب في اختيار الديدان ربما يبدو قليلا مضيعة للوقت ، فإنه يقدم ميزة واضحة من سير العمل على الآخرين في التجارب حيث الديدان من مراحل النمو المختلفة موجودة في نفس الصورة : الديدان يمكن اختيارها خلال "خطوة التتبع" ، من خلال تحديد فقط تلك الديدان التي هي في مرحلة النمو الصحيح. بدلاً من ذلك، يمكن تصفية الديدان باستخدام الإخراج من Worm_CP استناداً إما إلى طول خط التتبع، أو منطقة قناع التجزئة، وكلاهما مؤشرات موثوقة لطول/حجم الديدان. يمكن القول إن خوارزميات التعلم الآلي قد تكافح من أجل التعرف على الديدان من مراحل نمو مختلفة ، حيث أن حجمها ومظهرها في صور DIC مختلفان جدًا.
ويمكن استخدام ناتج محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلوريس في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامج تحليل الصور الأخرى. وقد أثبتنا ذلك من خلال استيراد إخراج Worm-align في خط أنابيب CellProfiler بسيط (Worm_CP)، والذي يسمح بالتكميم الكمي لكثافة الفلورانس متعدد القنوات في تلك الديدان الفردية التي تم اختيارها أثناء تشغيل خط أنابيب محاذاة الدودة. اخترنا هذا النهج بسبب مرونة برنامج CellProfiler: من السهل دمج وحدات إضافية في خط الأنابيب لتحليل ميزات إضافية في الديدان الفردية (على سبيل المثال قياس حجم قطرات الدهون ، أو حبيبات الإجهاد ، النوى ، الميتوكوندريا). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من المحتمل أن تستخدم أقنعة دودة واحدة لتدريب نموذج جديد ل WormToolbox7.
المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي أنه سريع ويتطلب تركيب دودة بسيطة. هذه الطريقة هي أسرع لأنها لا تتطلب قضاء الوقت في عملية برنامج التعلم ولا تشغيل مجموعات التدريب من خلال خوارزمية الجهاز7. وعلاوة على ذلك، يعمل هذا الأسلوب مع إما الديدان الحية أو الثابتة شنت ببساطة على منصات agarose العادية. ليست هناك حاجة لاستخدام غرف microfluidic معقدة، كما وضعت في أساليب أخرى5،6.

كائن بسيط نسبيا، والنيماتودا C. elegans، هو نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة الأمراض البشرية. حوالي 38٪ من الجينات في الجينوم C. elegans لديها نظراء وظيفية في البشر1,2. واحدة من الخصائص الفريدة لـ C. elegans هي أنها شفافة بصرياً، مما يتيح سهولة الوصول إلى المعلومات الحية في ما يتعلق بالتعبير الخلوي (الفرعي) لمراسلي الفلورسنت عبر الأنسجة. وهذا يجعل C. elegans كائن حي نموذج رئيس لشاشات عالية المحتوى باستخدام منصات الصور القائمة3. ومع ذلك ، فإن إحدى القضايا التي غالبا ما تعقد هذه الدراسات هو أنه عند تصوير مجموعات كثيفة من الديدان ، فإنها تميل إلى العبور والتجميع ، مما يجعل المقارنات عبر الديدان الفردية صعبة ، وتخيم على تحليل الصور في المصب والكمية.
الحلول القائمة التي تتغلب على هذه المسألة تعتمد عادة على تحسين الاستزراع و بروتوكول التصوير ، مثل استخدام الاجهزة micro-fluidics4، والسماح للدود واحد ليتم التقاطها في صور منفصلة5،6. وقد طبّق آخرون خوارزميات للتعلم الآلي تسمح بالاعتراف بالدودية الفردية، حتى في مجموعات سكانية متكتلة. مثال ممتاز لهذا الأخير هو WormToolbox، وهو امتداد وحدات من منصة تحليل الصور مفتوحة المصدر، CellProfiler7. WormToolbox يقدم عالية الإنتاجية وعالية المحتوى الحل لتحليل C. elegans، وتستفيد بوضوح من إدراجها في CellProfiler ، كما يمكن بسهولة وحدات تحليل إضافية يمكن تضمينها. على الرغم من أن WormToolbox يأتي مزوداً بنموذج مسبق التدريب (DefaultWormModel.xml)، فإن إعادة تدريب خوارزمية التعلم الآلي مطلوبة عادةً لكل تطبيق جديد. الدروس على الانترنت حول كيفية القيام بذلك متوفرة على Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). على الرغم من هذا ، يتطلب تثبيت WormToolbox واستخدامه استثمارًا كبيرًا للوقت للمستخدمين المبتدئين.
هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيط والتكلفة وفعالة من حيث الوقت للثقافة ، وصورة السكان من C. elegans. للسماح لتقييم الديدان الفردية في الصور المكتسبة قمنا بتطوير سير عمل بسيط مفتوح المصدر يستند إلى FIJI ، واسمه محاذاة الدودة. يمكن استخدام محاذاة الفيروس المتنقل لإنشاء المونتاجات أحادية أو متعددة القنوات من الديدان المُستقيمة والمحاذية. أولاً، يجب على المستخدم اختيار الديدان الفردية يدويًا للتحليل عن طريق رسم خط من الرأس إلى الذيل. سيستخدم Worm-align هذا التحديد لاحصد الديدان المحددة من صورة النظرة العامة، وتوليد مونتاج يتم فيه تقويم الديدان المحددة ومحاذاتها لتسهيل المقارنة البصرية والعرض.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مخرجات محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلور في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامجيات تحليل الصور الأخرى. نحن نبرهن على ذلك عن طريق استيراد إخراج Worm-محاذاة إلى Worm_CP، خط أنابيب يستخدم برنامج CellProfiler مفتوح المصدر. تمكن مرونة CellProfiler من دمج وحدات إضافية للفحص عالي المحتوى. لقد استخدمنا خط أنابيب Worm_CP لتحديد استجابة الصدمة الحرارية ، وهي آلية وقائية محفوظة بشكل جيد تعيد تخزين البروتينات التي تم طيها بشكل خاطئ بسبب الضغوطات مثل ارتفاع درجة الحرارة8. على وجه التحديد، قمنا بتطبيق خط الأنابيب على الديدان التي تحمل transgene متعددة النسخ المتكاملة، حيث المروج من صدمة الحرارة الجينات غير قابل للدمج، hsp-70 (C12C8.1)، يدفع البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)9. كما استخدمنا خط أنابيب Worm_CP على الحيوانات الثابتة التي تم وضع علامة عليها بصبغة فلورية تصور قطرات الدهون (LDs) ، وهي العضوات الرئيسية لتخزين الدهون في C. elegans10. في حين أن هذا العمل لا يملك الإنتاجية التي تقدمها WormToolBox ، بل هو بديل سهل الاستعمال وبسيطة للعرض البصري وتحليل الصور القائمة على التجارب ج. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

مشكلة غالبا ما تواجه عند الحصول على بيانات الصورة من ثابت أو تخدير C. elegans هو أن الديدان عبر وتكتل مع جيرانهم. وتتفاقم هذه المشكلة مع زيادة كثافة الديدان وتخلق تحديات للتصوير والتحديد الكمي. قمنا بتطوير سير العمل القائم على FIJI ، دودة الانحياز ، التي يمكن استخدامها لتوليد المونتاج واحد أو متعدد القنوات من المستخدم المحدد ، تقويم ومحاذاة الديدان من بيانات الصورة الخام من C. elegans. محاذاة الفيروس المتنقل هو سير عمل بسيط وسهل الاستخدام لا يتطلب تدريب مسبق من المستخدم أو خوارزمية التحليل. يمكن للمونتاجات التي تم إنشاؤها مع دودة الانحياز مساعدة التفتيش البصرية من الديدان، وتصنيفها والتمثيل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مخرجات محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلور في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامجيات تحليل الصور الأخرى. نحن نبرهن على ذلك عن طريق استيراد إخراج Worm-محاذاة إلى Worm_CP، خط أنابيب يستخدم برنامج CellProfiler مفتوح المصدر. تمكن مرونة CellProfiler من دمج وحدات إضافية للفحص عالي المحتوى. وكمثال عملي، استخدمنا خط الأنابيب على مجموعتي بيانات: مجموعة البيانات الأولى هي صور ديدان مراسل الصدمات الحرارية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مروج صدمة الحرارة الجين hsp-70، ومجموعة البيانات الثانية هي الصور التي تم الحصول عليها من الديدان الثابتة ، الملطخة لمخازن الدهون مع صبغة الفلورسنت.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

دودة محاذاة / Worm_CP هو سير عمل فيجي / CellProfiler بسيطة التي يمكن استخدامها لتصويب ومواءمة Caenorhabditis elegans عينات وتسجيل كامل دودة تستند إلى صورة المقايسات دون الحاجة إلى خطوات التدريب المسبق. لقد طبقنا دودة محاذاة / Worm_CP إلى الكم من الحرارة الناجمة عن التعبير في الحيوانات الحية أو قطرات الدهون في عينات ثابتة.

دودة الانحياز Worm_CP، خطين أنابيب مفتوحة المصدر لتقويم و كمية بيانات صورة الفلوريسنس التي تم الحصول عليها من Elegans Caenorhabditis

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

نحن نصف هنا بسيطة مفتوحة المصدر فيجي القائم على سير العمل المسمى دودة محاذاة، والتي يمكن استخدامها لتوليد المونتاج واحد أو متعدد القنوات من الديدان استقامة من الفائدة من الصور المجهرية الخام. لأن هذا العمل يعتمد على الحيوانات المختارة من قبل المستخدم من الفائدة ، قد يكون من المفيد بشكل خاص عند تحليل الصور من C.elegans حيث لا الديدان كلها في المرحلة الصحيحة أو الشرط. وتجدر الإشارة إلى أن الناتج من محاذاة الدودة يمكن استخدامها في التحديد الكمي اللاحق للفلوريس مع أي فيجي أو غيرها من برامج تحليل الصور.هنا نبرهن على القياس الكمي الفلوري باستخدام خط أنابيب CellProfiler Worm_CP. ابدأ بإنشاء ميكروبيبت الفم عن طريق تمديد شعري زجاجي رفيع في شعلة شعلة بونسن. بعد التمديد في اللهب، وكسر الشعيرات الدموية إلى قطعتين إذا لم تقتحم إلى قطعتين بعد التمديد.إذا كان كسر إلى قطعتين، وقطع نهاية أطول واحد. حدد أطول قطعة واختبار ما إذا كان الشعرية مفتوحة من خلال محاولة لpirate المياه. فصل المحول من أنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر.قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحول شعري مرتبط بأنبوب سيليكون من عيار 6 ملليمترات. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب الستة ملليمترات في مرشح ميكرومتر 0.2 وأنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر على الطرف الآخر. قم بتوصيل طرف مرشح ملليمتر واحد في النهاية الحرة لأنبوب السيليكون ثلاثي المليمتر لتبخر السائل.تحت مجهر تشريح، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل حول بيليه من الديدان الثابتة مع ميكروبيبت الفم. إضافة بسرعة 10 ميكرولترات من تصاعد المتوسطة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. شطف طرف 10 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني مع آثار المنظفات لمنع الديدان من التمسك الجانبين من تلميح الماصات البلاستيكية.ثم قطع نهاية الحافة مع زوج من مقص. نقل ثمانية ميكروليترات من المتوسطة المتصاعدة مع الديدان على وسادة agarose أعدت سابقا. أثناء مراقبة الشريحة تحت المجهر ، يهيج بلطف لتجنب تداخل الديدان.ثم تغطية قطرة من المتوسط تصاعد على وسادة agarose مع 18 في 18 ملليمتر coverslip. لتركيب الديدان الحية، ماصة ثلاثة إلى أربعة ميكرولترات من ثلاثة ملليمتر levamisole حل في M9 على وسادة agarose. اختيار 30 إلى 50 الديدان في حالة في قطرة من levamisole.ثم تغطية قطرة مع 18 في 18 ملليمتر يغطي وصورة الديدان في غضون ساعة واحدة. تثبيت حزمة برامج تحليل الصور مفتوحة المصدر فيجي من ImageJ، أو إذا كان مثبتًا بالفعل على الكمبيوتر، تحقق من أنه الإصدار 1.52A أو الإصدار الأحدث، ثم قم بتنزيل مستودع محاذاة الفيروس المتنقل من GitHub واحفظه على الكمبيوتر. بمجرد أن يتم تنزيل جميع مكونات خط الأنابيب وتثبيتها، افتح Fiji ونفذ الماكرو المتنقل بمحاذاة الفيروس بالنقر فوق المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وتشغيلها في شريط القوائم الرئيسي.حدد موقع محاذاة الفيروس المتنقل. ijm النصي وانقر على فتح. انتقل إلى مجلد الإدخال مع الصور التي سيتم تحليلها وانقر فوق حدد، مع التأكد من أن المجلد المحدد يحتوي على ملفات الصور فقط.سيقوم الماكرو تلقائياً بإنشاء مجلد إخراج حيث سيتم حفظ كافة النتائج. سيكون اسم المجلد نفس مجلد الإدخال مع الإخراج كـ إصلاح ما بعد. السماح الماكرو لفتح الصورة الأولى في مجلد الإدخال واستخدامه كصورة تمثيلية لاستخراج الإعدادات المطلوبة لإنشاء المونتاج، بما في ذلك عرض الديدان، والسطوع، والتباين.باستخدام أداة رسم الخط المستقيم، ارسم خطًا عبر عرض الفيروس المتنقل وانقر فوق موافق. استخدم طول هذا الخط لتحديد ارتفاع المناطق التي تم اقتصاصها للفيروسات المتنقلة المفردة. لكل قناة، حدد الاسم، جدول البحث، وما إذا كان يجب تضمينه في المونتاج، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، اضبط إعدادات السطوع والتباين للقنوات باستخدام أشرطة التمرير. كرر هذه العملية للقنوات المتبقية.بمجرد أن يتم تكوين كافة الإعدادات، سيتم تسجيلها في جدول إعدادات وحفظها في المجلد الفرعي CellProfiler من مجلد الإخراج. يتم إنشاء صورة لإظهار ما ستبدو عليه جميع الصور بعد تطبيق الإعدادات. إذا كانت الصورة مرضية، ضع علامة على المربع العلوي.المربع الثاني والثالث من لوحة الاختيار جميع إعدادات تحديد الخيارات لتوليد المونتاج. اترك كلا المربعين علامة وانقر فوق موافق لتنفيذ بقية الماكرو. سيؤدي الفشل في وضع علامة على المربع العلوي إلى إعادة تشغيل الإعداد من قبل الماكرو.الماكرو ثم ينتقل إلى فتح كافة الصور في مجلد الإدخال. لكل صورة، رسم خطوط على محور طولي من كافة الديدان ليتم تضمينها في المونتاج باستخدام مجزأة أو أداة خط حر. رسم خطوط باستمرار من الرأس إلى الذيل أو العكس بالعكس على طول كامل من الديدان وإضافة كل سطر إلى مدير ROI عن طريق النقر على التحكم T.Once تمت إضافة كافة الديدان المطلوبة، انقر فوق موافق. ثم سيقوم محاذاة الفيروس المتنقل بإنشاء صور مقصوصة من الديدان المحددة المفردة، والتي سيتم حفظها في المجلد الفرعي المتنقل الواحد لمجلد الإخراج.سيتم حفظ المونتاجات من كافة الفيروسات المتنقلة المحددة في المجلد المحاذى. قم بتنزيل وتثبيت CellProfiler 2.2.0 بالنقر فوق الارتباط للإصدارات CellProfiler السابقة على صفحة التنزيل وتحديد نظام التشغيل المطلوب. قبل بدء تشغيل خط أنابيب Worm_CP تأكد من وجود كافة الصور الإخراج المتوقعة في المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة.يجب أن تكون هناك نسخة مُعالجة من الصورة الأصلية، وقناع صورة ثنائية للسكان المتنقلين، وقناع محاذاة إذا كان الخط مرسومًا على دودة محددة وصورة واحدة تمثل كل قناة من القنوات في الصورة الأصلية. فتح CellProfiler، ثم انقر على وحدة إدخال الصور واسحب مجلد وحدة CellProfiler إلى النافذة التي تقول إسقاط الملفات والمجلدات هنا. إذا كانت قائمة الصور موجودة من تحليل سابق، قم أولاً بإزالة هذه الصور بالنقر بزر الماوس الأيمن في النافذة وتحديد قائمة ملفات واضحة.انقر على وحدة إدخال بيانات التعريف وعلى أسلوب الاستخراج الثاني، انقر فوق المجلد الأصفر وانتقل إلى المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة. حدد ملف الإعدادات، ثم انقر على التحديث. بعد ذلك، انقر على أسماء وأنواع وحدة الإدخال، وتأكد من أن جميع الصور المطلوبة لخط الأنابيب موجودة.قبل تشغيل خط الأنابيب، حدد وجهة لنتائج الإخراج في وحدة المخرجات. استخدم وضع الاختبار لمعرفة كيفية تنفيذ خط الأنابيب بالنقر فوق وضع اختبار البدء والسماح له بتشغيل الصورة الأولى في المجلد. عندما راض عن أداء خط الأنابيب، انقر فوق وضع اختبار الخروج وتحليل الصور.قبل البدء في التحليل، تأكد من أن جميع العيون أمام وحدة التحليل مغلقة. عند اكتمال التحليل، افتح مجلد الإخراج Worm_CP الذي يتكون من ملفين CSV وDدان CSV وSdds CSV. زراعة وتصوير C.elegans وفقا للطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج صور كبيرة نظرة عامة من السكان دودة.يعتمد إنتاج خط الأنابيب إلى حد كبير على جودة الخطوط المرسومة فوق الصور. تظهر هنا أمثلة السطر عدة والإخراج الخاصة بهم من محاذاة دودة. عند استخدام البرنامج النصي المتنقل، يمكن تحديد الهوية المرئية للدود المتقاطعة من صور التراكب الموجودة في المجلد الفرعي للبيانات، وكذلك من لوحات الديدان الفردية في المونتاج.ويمكن أيضاً استخدام جدول مراقبة الجودة لتحديد الديدان المتداخلة. ومع ذلك، خطوط المتقاطعة هي مشكلة لخط Worm_CP. وذلك لأن Worm_CP يستخدم قناع الخط، وليس المناطق ذات الأهمية، للمساعدة في تحديد الديدان الفردية.لذلك، سيتم تقسيم CellProfiler أحد من الفيروسات المتنقلة ككائنين. وقد استخدم خط أنابيب Worm_CP لقياس شدة الفلور من الحيوانات الثابتة التي تحمل صبغة فلورية تدمج في قطرات الدهون. وينخفض محتوى قطرات الدهون بنسبة 17٪ بين نوع البرية والحيوانات DBL1 متحولة باستخدام القياس الكمي اليدوي، و 12٪ باستخدام خط أنابيب Worm_CP.Worm_CP أيضاً لقياس استجابة الصدمات الحرارية في الديدان الحية التي تعبر عن GFP تحت السيطرة على جين غير قابل للعلاج بالصدمة الحرارية. في غياب الإجهاد الحراري، لم تستحث الديدان تعبير GFP. عندما تتعرض الديدان كصدمة حرارة قصيرة، يتم حدوث تعبير GFP.يعتمد إخراج Worm_CP إلى حد كبير على جودة الخطوط التي ترسمها باستخدام محاذاة Worm. تأكد من أن خطوطك لا تلمس أو تتداخل ورسم كل ما تبذلونه من خطوط في نفس الاتجاه. يمكن أن يساعدك فحص جدول مراقبة الجودة في تحديد الخطوط التي يتم لمسها أو تداخلها حتى تتمكن من استبعاد تلك الحالات من تحليلك.ويمكن استخدام ناتج محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق إما في فيجي أو في حزم برامج تحليل الصور الأخرى. لقد أظهرنا هنا خط أنابيب CellProfiler الأساسية للغاية التي يمكن دمج وحدات التحليل الأخرى بسهولة ، على سبيل المثال ، لحساب عدد قطرات الدهون أو لقياس شدة قطرات فردية داخل دودة. واحدة من ميزة هذه التقنية هي إمكانية قياس الفلورية من الديدان الفردية بسرعة.في مختبرنا ، لدينا مصلحة في الجدوى الفردية باستخدام مراسلي الفلوريسنس ونستخدم دودة الانحياز Worm_CP بشكل روتيني لهذا الغرض.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

التحديد الكمي لوفرة الدهن وتقييم توزيع الدهن في ايليجانس كاينورهابديتيس "الأحمر النيل" و "النفط تلطيخ س الأحمر"

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...