Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

我们要感谢BIOCEV（捷克共和国布拉格）的克里斯蒂安·兰特托博士教我们安装固定蠕虫的口腔微移子技术，感谢法蒂玛·桑托斯博士和黛比·德拉格博士在口腔微管上分享安全设置。我们还感谢弗朗切斯卡·霍奇编辑手稿，沙琳·默多克和巴布拉汉姆研究所设施的支持。OC 受 ERC 638426 和 BBSRC [BBS/E/B000C0426] 支持。

1. 使用荧光染料将蠕虫固定用于脂肪含量成像（BODIPY）10
<ol><li>根据标准程序 2，通过漂白来准备C.elegans 的同步种群。板约1000L1级蠕虫到9厘米线虫生长介质（NGM）板每个条件。 注：由于处理时蠕虫丢失，准备的蠕虫比最后实际量化的蠕虫多。</li>
	<li>要在年轻的成人阶段成像动物（约50小时后L1电镀在20°C），洗每9厘米板与15 mL的M9在锥形管，离心机在252 x g1 分钟，并删除上流板。</li>
	<li>重复洗涤，将 M9 的 1 mL 留在蠕虫颗粒上。</li>
	<li>在2 mL低蛋白结合微离心管中，使用低保留技巧转移含有蠕虫的1 mL。</li>
	<li>在微离心中以 252 x g 旋转 1 分钟，取出上清液，小心不要接触管底的蠕虫颗粒。</li>
	<li>用于使用 4，4-二氟-1，3，5，7，8-彭他基-4-波拉-3a，4a-diaza-s-indacene（BODIPY）染色监测脂肪含量10 （材料表）， 修复蠕虫要么添加0.5 mL的60%异丙醇到蠕虫颗粒3分钟11，或通过添加2 mL的冰冷甲醇10分钟。对于这两个程序，每 30 s 反转一次管。 注意：如果甲醇是所选的固定试剂，由于其毒性，必须在烟罩中执行此步骤。</li>
	<li>在不接触蠕虫颗粒的情况下，尽可能去除固定剂，并添加 1 mL 的 M9。让蠕虫在管底沉淀3~5分钟。</li>
	<li>再次用 1 mL 的 M9 洗涤，让蠕虫沉淀并去除上清液，在管中留下约 50 μL。使用夹子固定管子。</li>
	<li>将安全封闭的管子放入液氮中，然后在 +40°C 下放入温水浴中，冷冻破解蠕虫。</li>
	<li>再重复步骤 1.9。</li>
	<li>在 M9 中以 1 μg/μL 的最终浓度稀释 0.5 mL，并在室温下放在旋转器上 1 小时。</li>
	<li>1小时后，让蠕虫在管底沉淀3~5分钟。</li>
	<li>取出上一液并添加 1 mL 的 M9。</li>
	<li>让蠕虫在底部沉淀并去除上清液。 注意：或者，可以旋转在252 x g 1分钟，因为这似乎不会影响形态。</li>
	<li>添加 0.5 mL 的 M9。 注：如果固定性为 60% 异丙醇，则蠕虫只能在 48 小时内使用。如果固定性是甲醇，蠕虫应在24小时内使用。</li>
</ol>2. 准备加糖垫来安装蠕虫
注：准备加糖垫的关键步骤是获得一个常规厚度的垫。否则，穿过焊盘的蠕虫将在不同的焦平面上，因此很难获得更宽视野的聚焦图像。
<ol><li>在烧杯或圆锥烧瓶中加入 0.2 g 的 agarose 到 10 mL 的灭菌 H 2 O 中，准备2%的气糖垫。在微波炉中加热30s，直到红糖开始沸腾。 注：请勿过热，一旦出现气泡，请停止;否则，它增加了加糖的粘度，使其更难达到所需的垫厚度。</li>
	<li>一旦气糖融化，使用1000μL移液器尖端及其末端切口，在显微镜玻璃幻灯片的中心分配一滴融化的阿加罗斯。立即，但微妙，举行另一个玻璃幻灯片非常接近阿加罗斯下降，并释放到阿加罗斯，形成一个常规厚度垫的最佳显微镜结果。 注意：从高度释放顶部幻灯片不仅会形成气泡，还会导致垫板不均匀。或者，也可以使用两个玻璃幻灯片，在幻灯片的侧面与垫，与薄层胶带在每张幻灯片。</li>
	<li>至少 2~3 分钟后，轻轻取下顶部滑轨。使用顶部幻灯片的侧面，修剪垫，使其方形。在 5 分钟内安装蠕虫，以防止垫在使用前干燥。</li>
</ol>3. 安装固定蠕虫进行成像
<ol><li>通过在 Bunsen 燃烧器的火焰中延伸薄玻璃毛细管来创建口腔微管（图 1A）。在火焰中延伸后，将毛细管分解为两块（图1B）。选择最充分的，通常是最长的，并测试毛细管的端是否打开，通过尝试吸水。 注：如果液体没有进入毛细管，则其太薄或被阻塞。用一把剪刀轻轻切割毛细管的端，避免切割太多，因为如果孔太大，蠕虫会吸气。</li>
	<li>将玻璃毛细管从步骤3.1插入毛细管适配器（图1C），连接到6毫米硅胶管，将6毫米硅胶管的另一端插入0.2 μm过滤器，连接到另一端的3毫米硅胶管（图1C）。将 1 mL 滤片尖端（图1C）插入3毫米硅胶管的自由端以吸气。 注：在实验者的嘴和毛细管之间添加0.2 μm过滤器，以确保实验者的最大安全性。类似的解决方案用于用于处理小鼠胚胎12的嘴微管。如果口腔微管不再吸气液体，请更换过滤器（通常每隔几个月更换一次）。</li>
	<li>在解剖显微镜下使用口腔微管，在固定蠕虫的蠕虫颗粒周围去除尽可能多的液体（图2）。 注：使用手动微移液器移液，可用作步骤 3.1 至 3.3 中的口移液器的替代品，以尽可能多地去除上流液。添加 6 μL 的安装介质。然而，我们发现这种方法不能如此高效，因为焊盘中过多的液体会产生稀疏的蠕虫密度，这使得成像更加耗时。恢复步骤 3.6。查看管的底部，确保移液器不会吸气蠕虫。</li>
	<li>快速将 10 μL 的安装介质 （材料表） 添加到管的底部.</li>
	<li>用洗涤剂（0.01% Triton）的痕迹在PBS中冲洗10μL尖端，以防止蠕虫粘在塑料移液器尖端的两侧。用一把剪刀切开尖端的一端。</li>
	<li>将含有蠕虫的8μL安装介质转移到步骤2.3中准备的阿加罗斯垫上。在显微镜下，轻轻摇动幻灯片，以避免蠕虫重叠。</li>
	<li>用 18 mm x 18 mm 盖玻片盖住 agarose 垫上的安装介质掉落（图 3）。 注：较小的盖玻片是首选，因为它们对蠕虫施加的压力较小。用一对钳子握住盖玻片，将盖玻片的一条边缘涂抹在 agarose 垫上，然后用钳子轻轻沉积盖玻片。</li>
</ol>4. 安装活蠕虫进行成像
注意：要对活蠕虫进行图像成像，它们必须固定在垫子上。实现这一目的的一个方法就是用尼古丁受体激动剂麻痹它们：levamisole（材料表）。
<ol><li>在 M9 中溶解在步骤 2.3 中创建的 agarose 垫上，将 3 mM levamisole 的管道 3±4 μL 溶解在 agarose 垫上。 注：应该有足够的液体体积，蠕虫不是彼此的顶部，但没有太多的液体，蠕虫太稀疏的垫。有经验的蠕虫采摘者可以使用 3 μL 的 levamisole。经验不足的采摘者可能需要添加更大的体积的莱瓦米索，这样利瓦米索不会完全蒸发。</li>
	<li>每个情况选择 30~50 个蠕虫进入利瓦米索的掉落。</li>
	<li>用 18 mm x 18 mm 盖玻片盖住阿加罗斯垫上的利瓦米索滴。图像蠕虫在1小时内，作为麻痹剂将最终导致蠕虫死亡。</li>
</ol>5. 使用荧光显微镜成像幻灯片
<ol><li>使用均匀厚度的 agarose 垫，使用 6 x 6 或 7 x 7 大图像（例如，使用荧光显微镜的 20 倍目标）一次成像幻灯片上的所有蠕虫。如果垫的厚度不均匀，则获取同一幻灯片的多个较小的 3 x 3 或 4 x 4 图像。</li>
	<li>对于所有条件的荧光强度和曝光时间使用相同的设置。调整每个设置以匹配强度最亮的幻灯片，确保没有像素饱和度。有关图像采集的具体细节，请按照显微镜制造商的说明操作。</li>
</ol>6. 使用蠕虫对齐的 FIJI 管道创建对齐单个蠕虫的蒙太奇图像
<ol><li>安装开源图像分析软件包 FIJI13/ImageJ14 https://imagej.net/Fiji。如果以前安装的 FIJI 可用，请确保它更新到版本 1.52a 或更晚版本，因为宏中使用的某些功能（例如表函数）需要此功能。从 Github 下载蠕虫对齐宏：https://github.com/hannekeo/Worm-align。</li>
	<li>打开 FIJI 并运行蠕虫对齐宏。通过单击插件执行蠕虫对齐|宏|在FIJI 主菜单栏中运行（图 S1）。现在，在计算机上找到 Worm-align.ijm脚本。</li>
	<li>宏通过请求图像的位置进行初始化。该管道将同时处理单通道和多通道荧光图像（图S2）。选择一个输入文件夹，宏将自动生成一个输出文件夹，其中将保存所有结果（图 S3）。 注意：所选文件夹仅包含图像文件非常重要，因为存在其他文件格式将导致宏崩溃。理想情况下，仅将使用相同的显微镜设置捕获的图像分组在一起。蠕虫对齐将接受许多不同的文件格式，包括 nd2，czi，tif，rgb，jpg 和 png。输出文件夹的名称与输入文件夹的名称相同，将"_output"添加为后缀，即如果输入文件夹为"图像"，则输出将在"images_output"中找到。输出文件夹将包含四个子文件夹，其中将保存数据。</li>
	<li>允许宏继续打开输入文件夹中的第一个图像，并使用它作为代表性图像来提取一个设置来生成蒙太奇。 注：蠕虫对齐将自动选择输入文件夹中的第一个图像，以生成将应用于文件夹中所有其他图像的设置。如果认为另一个图像更代表数据集，请确保通过在输入文件夹中保存图像的副本，更改名称，以便现在将其列在列表顶部（例如"0_RepresentativeImage"）来选择此图像。</li>
	<li>使用 直线绘图工具 ，在蠕虫的宽度上绘制一条线（图S4），并使用此线的长度来确定单个蠕虫的裁剪区域的高度。对于每个通道，指定名称、查找表 （LUT）、强度设置 （B&C） 以及是否应包含在蒙太奇中（图S4）。 注：这些参数记录并保存在设置文件，设置 .csv，位于 输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中。</li>
	<li>捕获所有设置后，用户将显示应用应用设置后的图像外观（图S5）。如果设置足够，请勾选顶部框。选择蒙太奇生成选项（如果不需要，请删除滴答声）：1. 为每个图像生成选定蠕虫蒙太奇，或 2. 生成组合蒙太奇，其中输入文件夹中所有图像上选择的所有蠕虫将合并到单个蒙太奇中。单击 " 确定"以执行宏的其余部分。 注：如果在单击"确定"之前未勾选顶部框，宏将重新运行设置，因此可以优化图像设置。</li>
	<li>蠕虫对齐管道现在继续打开输入文件夹中的所有图像。对于每幅图像，使用"分段线"工具（在 FIJI 主菜单栏上），在要包含在蒙太奇和/或量化的所有蠕虫的纵向轴上绘制线条。为确保蠕虫正确对齐，请从头到尾（反之亦然）和沿蠕虫的完整长度绘制线（参见图4B中的"好"和"坏"线绘制示例）。</li>
	<li>将每 行添加到 ROI 管理器中，通过单击 Ctrl+T. 蠕虫对齐使用添加到 ROI 管理器中的行，结合蠕虫宽度参数（在步骤 6.4 中设置）生成单个选定蠕虫的裁剪图像。行 RBI 的集合保存在"数据"子文件夹中。此文件夹还包含显示行的原始图像的副本以及蠕虫的数量。线条使用查找表Glasbey_on_dark颜色。拉直蠕虫的图像保存在输出 文件夹single_worms 子文件夹中。此外，如果在此协议的步骤 6.6 中选中，Worm 对齐将生成每个概览图像和/或输入文件夹中所有概览图像选择的所有蠕虫的蒙太奇（参见 图 4C 和图 S7）。这些蒙太奇可以在输出文件夹的"对齐"子文件夹中找到。</li>
</ol>7. 在自动细胞保护器管道中使用蠕虫对齐的输出分析单蠕虫荧光强度
<ol><li>对于蠕虫对齐输出的下游数据处理和分析，从https://cellprofiler.org/下载并安装开源图像分析软件包"CellProfiler15，16"。 从 GitHub Worm_CP. cpproj管道： https://github.com/hannekeo/Worm-align 注意：此处描述的示例管道是使用 CellProfiler2.2.0 构建的，可能无法在 CellProfiler 的后期版本中运行。</li>
	<li>在启动 Worms_CP.cpproj 管道之前，请确保所有预期的输出图像都存在于 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中：原始图像的已处理副本（名为 Original_）、蠕虫总体的二进制图像掩码（名称： Mask_）、在选定蠕虫上绘制的线的线蒙版（名称为 Lines_）以及一个表示原始图像中每个通道的图像（按通道编号命名）。</li>
	<li>要量化单个蠕虫中的荧光强度，请单击 "图像"输入 模块，只需 将 CellProfiler 输出文件夹拖动到显示" 在此放置文件和文件夹"的窗口中。如果从以前的分析中显示图像列表，请先在窗口中右键单击并选择"清除文件列表 "来删除这些图像。要从图像列表中排除"设置.csv"文件，请为筛选器设置选择"仅图像"或"自定义"，其中"扩展是 tif、tiff、ome.tif 或 ome.tiff"（图 S8）。</li>
	<li>单击元数据输入模块。在第二个提取方法中，单击黄色文件夹，并在 WormAlign 输出文件夹中找到 CellProfiler 子 文件夹（图 S9）。选择 "设置.csv 文件，通过将 CSV 文件中的元数据与图像中的元数据（通道元数据）匹配，将文件中的设置链接到 CellProfiler 输出。</li>
	<li>单击 NamesAndType 输入 模块，并插入要量化原始图像的每个通道的新图像。 注：示例管道中已存在的是蠕虫蒙版、两个彩色图像、线蒙版和原始图像，以及三个灰度图像（绿色和红色通道）。如果原始图像的通道比示例图像多或少，需要调整此模块中的列表。</li>
	<li>检查每个列标签/掩码/蠕虫中的图像名称是否正确。 注：一行上的图像名称应全部对应于要分析的同一初始图像。如果在图像分析过程中出错，则某些输出图像将丢失，并且三列标签/掩码/蠕虫下的名称将不再对应于每行相同的初始图像。如果是这种情况，请找出错误在哪里。</li>
	<li>按 "查看输出 设置"以选择文件夹以从 Cellprofiler 保存输出。</li>
	<li>单击 "开始测试模式"。进入测试模式后，通过单击 Run（将运行在管道中的所有活动模块）或 Step（ 一次通过管道运行一个模块）将 管道 的设置应用于数据集中的第一个图像，可以仔细检查管道的设置。 注：在测试模式下，即使管道中存在（且处于活动状态 ）， 也不会导出提取的测量值。</li>
	<li>管道按其应执行的方式后，单击退出测试模式，然后按"分析图像"。根据当前配置，Worms_CP 将使用 Mask_ 图像对粗糙的蠕虫蒙版和 Lines_图像（图S10A）进行分割，以挑出选定的蠕虫并生成单个蠕虫掩码（图 S10C），（2）测量识别和蒙版这些蠕虫中输入图像中所有通道的荧光强度。管道还可以测量背景强度（图S10B），并相应地更正所有图像（以所测参数名称中的字阈值表示），例如：Intensity_MeanIntensity_green_threshold）、（3）测量所选蠕虫的大小，以及 （4） 导出所有测量参数（图 S10D）。</li>
	<li>打开Worm_CP由两个 csv 文件、蠕虫和行.csv这些文件.csv这些文件保存在选定的输出文件夹中（参见图 S11）。这些文件可以在 Excel 或 R（工作室）中打开，用于后期处理和报告。如果需要其他输出（例如每个图像数据），可以在管道中的ExportToSpreadsheet 模块中选择此选项。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. 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作者没有什么可透露的。

蠕虫对齐是基于 FIJI 的图像处理管道，它很容易生成用户选择的蠕虫蒙太奇，其中蠕虫被拉直和对齐，以帮助可视化比较、分类和表示。虽然此功能也由一些现有工具提供，特别是 CellProfiler7中的 WormToolbox 模块，但 Worm 对齐所需的先前图像分析体验相对较少：用户只需跟踪他们想要为蒙太奇（和分析）选择的蠕虫。虽然在原始图像数据上跟踪蠕虫是一个简单的过程，尤其是在触摸屏计算机或平板电脑可用时，但最重要的是，要正确绘制蠕虫的纵向轴线。不完整的线（仅遵循部分蠕虫）将导致蒙太奇（即蠕虫缺少尾端头）中的部分蠕虫，以及 CellProfiler 分析期间的部分分割掩码。此外，如果来自两个单独的蠕虫的线交叉，蠕虫将不能正确处理在蠕虫对齐蒙太奇以及荧光定量。为了进行质量控制，原始图像上的线选择的叠加图像将保存在数据文件夹中，以及一个 QC 表。从这些，有问题的线，将导致不正确的分段蠕虫可以很容易地识别和排除蒙太奇和/或后续分析。
虽然实验者在选择蠕虫时的直接输入似乎有点耗时，但它在实验中，不同发育阶段的蠕虫可以在同一图像中出现：蠕虫可以在"跟踪步骤"中选择，仅概述处于正确发育阶段的蠕虫。或者，可以使用 Worm_CP 的输出筛选蠕虫，这些输出基于跟踪线的长度或分段掩码的区域，这两者都是蠕虫长度/大小的可靠指标。可以说，机器学习算法可能难以识别不同发育阶段的蠕虫，因为它们的大小和外观在 DIC 图像中是如此不同。
Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们通过将蠕虫对齐输出导入简单的 CellProfiler 管道 （Worm_CP）来演示这一点，它允许在运行 Worm 对齐管道时选择的单个蠕虫中量化多通道荧光强度。我们之所以选择这种方法，是因为 CellProfiler 软件具有灵活性：将其他模块整合到管道中以分析单个蠕虫中的其他功能（例如，测量脂质液滴或应力颗粒、核、线粒体）的尺寸非常简单。此外，单个蠕虫掩码可能用于训练 WormToolbox7 的新模型。
此方法的主要优点是速度快，需要简单的蠕虫安装设置。此方法更快，因为它不需要花时间学习软件操作，也不需要通过机器算法7 运行训练集。此外，此方法适用于仅安装在常规的 agarose 垫上的活蠕虫或固定蠕虫。没有必要使用复杂的微流体室，如其他方法5，6开发。

一个相对简单的生物体，线虫，是研究人类疾病的非常有用的模型系统。C.elegans基因组中大约38%的基因在人类1、2中具有功能对应。C. elegans 的独特特性之一是光学透明，便于获取有关荧光报告器跨组织（子）细胞表达的体内信息。这使得C.elegans成为使用基于图像的平台3的高内容屏幕的主要模型有机体。然而，一个经常使这些研究复杂化的问题是，当对密集的蠕虫群进行成像时，它们往往会交叉和聚类，使单个蠕虫之间的比较具有挑战性，使下游图像分析和定量变得多云。
克服这一问题的现有解决方案通常依赖于培养和成像协议的优化，例如通过使用微流体设置4，允许单个蠕虫被捕获在单独的图像5，6。另一些应用机器学习算法，允许识别单个蠕虫，即使在块块中。后者的一个很好的例子是 WormToolbox，它是开源图像分析平台 CellProfiler7 的模块化扩展。WormToolbox 为 C. elegans 的分析提供了高吞吐量和高含量的解决方案，并且它显然受益于 CellProfiler 的加入，因为可以轻松包括其他分析模块。尽管 WormToolbox 附带了预先训练的模型 （DefaultWormModel.xml，但每个新应用程序通常需要重新训练机器学习算法。有关如何做到这一点的在线教程可在 Github （https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/） 上找到。尽管如此，安装和使用 WormToolbox 需要为新手用户投入大量时间。
在这里，我们描述了一个简单、具有成本和时间有效的文化协议，以及 C.elegans的图像群。为了在采集的图像中评估单个蠕虫，我们开发了一个简单的基于 FIJI 的工作流，名为 Worm 对齐。蠕虫对齐可用于生成拉直和对齐蠕虫的单通道或多通道蒙太奇。首先，用户必须通过绘制一条从头部到尾部的线来手动选择单个蠕虫进行分析。蠕虫对齐将使用此选择从概览图像中裁剪选定的蠕虫，并生成蒙太奇，其中所选蠕虫被拉直和对齐，以便于进行可视化比较和呈现。
此外，Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们将 Worm 对齐输出导入到使用开源 cellProfiler Worm_CP的管道中来演示这一点。CellProfiler 的灵活性使其他模块能够用于高含量筛选。我们已经使用Worm_CP管道来量化热冲击反应，这是一种保存完好的保护机制，可以重新折叠因高温8等压力源而错折叠的蛋白质。具体来说，我们把管道应用于携带集成多拷贝转基因的蠕虫，其中热冲击可吸收基因 hsp-70（C12C8.1） 的启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）9。我们还在固定动物Worm_CP上使用了Worm_CP管道，这些动物被贴上了荧光染料的标签，这种染料可以可视化脂质液滴（LDs）， 这是C.elegans10中主要的脂肪储存细胞器。虽然此工作流没有 WormToolBox 提供的吞吐量，但它是一个用户友好且简单的替代方法，用于可视化演示和分析基于 图像的 C. elegans实验。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

从固定或麻醉的 C. elegans 获取图像数据时经常遇到的问题是蠕虫与邻居交叉和聚类。随着蠕虫密度的增加，这个问题更加严重，给成像和定量带来了挑战。我们开发了基于 FIJI 的工作流 Worm 对齐，可用于从 C. elegans 的原始图像数据生成用户选择、拉直和对齐蠕虫的单通道或 多通道蒙太奇。 蠕虫对齐是一种简单且用户友好的工作流，不需要事先对用户或分析算法进行训练。使用蠕虫对齐生成的蒙太奇可以帮助对蠕虫、蠕虫的分类和表示进行目视检查。此外，Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们将 Worm 对齐输出导入到使用开源 cellProfiler Worm_CP的管道中来演示这一点。CellProfiler 的灵活性使其他模块能够用于高含量筛选。作为一个实际的例子，我们在两个数据集上使用了管道：第一个数据集是热冲击检测器蠕虫的图像，这些蠕虫在热冲击可吸收基因 hsp-70的启动者控制下表达绿色荧光蛋白（GFP），第二个数据集是从固定蠕虫获得的图像，用荧光染料染色为脂肪储存。

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Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

蠕虫对齐/Worm_CP 是一个简单的 FIJI/CellProfiler 工作流程，可用于拉直和对齐 卡诺哈布迪蒂斯埃利根样本 ，并评分全蠕虫图像为基础的检测，而无需事先的培训步骤。我们应用蠕虫对Worm_CP/分析方法，用于在活动物中对热休克诱导表达的定量，或在固定样品中对脂滴进行定量分析。

蠕虫对齐和Worm_CP，两个开源管道，用于从卡诺哈布迪蒂斯精英获得的荧光图像数据的直化 和定量

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

我们在这里描述一个简单的开源基于斐济的工作流，名为 Worm-align，它可用于从原始显微镜图像生成单通道或多通道的拉直蠕虫。由于此工作流依赖于感兴趣的用户选择的动物，因此在分析来自 C.elegans 的图像时，它特别有用，因为蠕虫并非全部处于正确的阶段或条件。应当指出，Worm-align 的输出可用于随后使用斐济或其他图像分析软件对荧光进行定量。在这里，我们演示使用 CellProfiler 管道 Worm_CP 的荧光定量。 首先，在 Bunsen 燃烧器的火焰中伸出一个薄玻璃毛细管，创建口腔微管。在火焰中延伸后，如果毛细管在延伸后没有分解成两块，则将毛细管分成两块。如果它分成两块，切出最长的一个。选择较长的片断，通过尝试吸水来测试毛细管是否打开。将适配器从三毫米硅胶管上拆下。将玻璃毛细管插入连接到六毫米硅胶管的毛细管适配器中。然后将六毫米管的另一端插入 0.2 微米过滤器，将另一端插入 3 毫米硅胶管。将一毫米滤波尖插入三毫米硅胶管的自由端以吸液体。在解剖显微镜下，用口腔微管去除固定蠕虫颗粒周围的液体。快速向管底部添加 10 微升安装介质。用洗涤剂的痕迹冲洗 PBS 中的 10 微升尖端，以防止蠕虫粘在塑料移液器尖端的两侧。然后用一把剪刀切开尖端的一端。将八个微升安装介质与蠕虫转移到先前准备的 agarose 垫上。在显微镜下观察幻灯片时，轻轻搅拌它，以避免蠕虫重叠。然后用 18 由 18 毫米的盖玻片盖住 agarose 垫上的安装介质。为了安装活蠕虫，移液器三到四微升三毫摩尔莱瓦米索溶解在M9的阿加罗斯垫上。每个情况选择 30 到 50 个蠕虫到莱瓦米索的掉落中。然后用18由18毫米的盖玻片盖住掉落，并在一小时内对蠕虫进行成像。从 ImageJ 安装开源图像分析软件包斐济，或者如果已在计算机上安装，请验证它是 1.52A 或更晚版本，然后从 GitHub 下载 Worm 对齐存储库并保存在计算机上。下载并安装所有管道组件后，打开斐济，通过单击插件、宏并在主菜单栏中运行来执行 Worm 对齐宏。找到蠕虫对齐。ijm 脚本并单击打开。导航到要分析的图像的输入文件夹，然后单击"选择"，确保所选文件夹仅包含图像文件。宏将自动生成一个输出文件夹，其中将保存所有结果。文件夹的名称将与输出为修复后输出的输入文件夹相同。允许宏打开输入文件夹中的第一个图像，并使用它作为代表性图像来提取生成蒙太奇所需的设置，包括蠕虫的宽度、亮度和对比度。使用直线绘图工具，在蠕虫的宽度上绘制一条线，然后单击"确定"。使用此线的长度确定单个蠕虫的裁剪区域的高度。对于每个通道，指定名称、查找表以及是否应包含在蒙太奇中，然后单击"确定"。接下来，使用滑块调整通道的亮度和对比度设置。对其余通道重复此过程。配置所有设置后，这些设置将被记录在设置表中并保存到输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹。将生成一个图像，以显示应用设置后所有图像的外观。如果图像令人满意，勾选顶部框。选中"所有设置"面板的第二个和第三个框指定蒙太奇生成选项。保持两个框勾选，然后单击"确定"以执行宏的其余部分。如果勾选顶部框，将导致宏重新运行设置。然后，宏继续打开输入文件夹中的所有图像。对于每个图像，使用分段或徒手线工具，在蒙太奇中包含的所有蠕虫的纵向轴上绘制线条。沿着蠕虫的全长绘制一致从头到尾的线条，然后单击 Control T 将每一行添加到 ROI 管理器中。然后，蠕虫对齐将生成单个选定蠕虫的裁剪图像，这些图像将保存在输出文件夹的单个蠕虫子文件夹中。所选所有蠕虫的蒙太奇将保存在对齐的文件夹中。通过单击下载页面上以前 CellProfiler 版本的链接并选择所需的操作系统，下载并安装 CellProfiler 2.2.0。在启动Worm_CP之前，请确保所有预期的输出图像都存在于 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中。原始图像的已处理副本、蠕虫总体的二进制图像掩码、对齐蒙版（如果线在选定的蠕虫上绘制）和一个表示原始图像中每个通道的图像应存在。打开 CellProfiler，然后单击图像输入模块，然后将 CellProfiler 模块文件夹拖到显示在此放置文件和文件夹的窗口中。如果上一分析中存在图像列表，请首先通过在窗口中右键单击并选择清除文件列表来删除这些图像。单击元数据输入模块和第二个提取方法，单击黄色文件夹并导航到 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹。选择设置文件，然后单击更新。接下来，单击输入模块的名称和类型，并确保管道所需的所有图像都存在。在运行管道之前，在输出模块中选择输出结果的目标。使用测试模式通过单击启动测试模式查看管道的性能，并允许它通过文件夹中的第一个图像运行。当对管道的性能感到满意时，单击退出测试模式并分析图像。在开始分析之前，请确保分析模块前面的所有眼睛都闭着。分析完成后，打开由两 Worm_CP个 CSV 文件、蠕虫 CSV 和行 CSV 组成的输出文件夹。根据本协议中描述的方法进行培养和成像 C.elegans 可生成蠕虫群的大型概览图像。管道的输出在很大程度上取决于在图像顶部绘制的线条的质量。此处显示了几个行示例及其来自 Worm 对齐的输出。使用 Worm 对齐脚本时，可从数据子文件夹中的叠加图像以及蒙太奇中单个蠕虫的面板中直观地识别相交蠕虫。QC 表还可用于识别重叠的蠕虫。但是，相交线对于管道Worm_CP问题。这是因为用户Worm_CP线掩码，而不是感兴趣的区域，以帮助识别单个蠕虫。因此，CellProfiler 将其中一个蠕虫分段为两个对象。这种Worm_CP用于量化固定动物的荧光强度，这些动物标有荧光染料，并附在脂滴中。使用手动定量的野生类型和突变DBL1动物之间的脂质液滴含量降低17%，使用管道的Worm_CP 12%。Worm_CP还用于量化活蠕虫的热休克反应，在热冲击可吸收基因的控制之下表达GP。在没有热应力的情况下，蠕虫没有诱导GP表达。当蠕虫暴露为短热冲击时，GFP表达被诱导。其Worm_CP在很大程度上取决于使用 Worm 对齐绘制的线条的质量。确保线条没有接触或重叠，并在同一方向绘制所有线条。检查 QC 表可以帮助您识别接触或重叠的线，以便从分析中排除这些情况。Worm 对齐的输出可用于斐济或其他图像分析软件包的后续定量。我们在这里展示了一个非常基本的 CellProfiler 管道，其中可以非常轻松地将其他分析模块合并到其中，例如，计算脂质液滴的数量或量化蠕虫中单个液滴的强度。这种技术的优点之一是有可能快速量化单个蠕虫的荧光。在我们的实验室中，我们有兴趣使用荧光报告来保持个体生存能力，并且我们经常使用蠕虫Worm_CP和蠕虫分析。

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

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生物学

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