Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Vi vil gerne takke Dr. Christian Lanctôt på BIOCEV (Prag, Tjekkiet) for at lære os munden mikropipette teknik til at montere faste orme og Dr. Fatima Santos og Dr. Debbie Drage for at dele sikkerhed setup på munden mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for at have redigeret manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC understøttes af ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].

1. Fiksering af orme til billeddannelse med fedtindhold ved hjælp af et fluorescerende farvestof til lipiddråber (BODIPY)10
<ol><li>Forbered en synkroniseret population af C. elegans ved blegning i henhold til standardprocedurer2. Plade omkring 1.000 L1-trins orme på en 9 cm nematode vækstmedier (NGM) plade pr betingelse. BEMÆRK: Der fremstilles flere orme end faktisk kvantificeret i slutningen på grund af tab af orme ved håndtering.</li>
	<li>Til billeddyr i ung voksenfase (ca. 50 h post L1 plating ved 20 °C) vaskes hver 9 cm plade med 15 ml M9 i et konisk rør, centrifuge ved 252 x g i 1 min.</li>
	<li>Gentag vask og lad 1 ml M9 over pellet af orme.</li>
	<li>Overfør 1 ml M9 indeholdende ormene i et 2 ml lavt proteinbindende mikrocentrifugerør ved hjælp af lave retentionsspidser.</li>
	<li>Spin ned på 252 x g i en mikrocentrifuge i 1 min og fjern supernatant, være omhyggelig med ikke at røre ormen pellet i bunden af røret.</li>
	<li>Til overvågning af fedtindhold ved hjælp af 4,4-difluor-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) farvning10 (Tabel over materialer), fastsætte orme enten ved at tilføje 0,5 ml af 60% isopropanol til ormen pellet i 3 min11, eller ved at tilføje 2 ml iskold methanol i 10 min. For begge procedurer, invertere røret hver 30 s. FORSIGTIG: Hvis methanol er det valgte fikseringsgenser, skal dette trin udføres i en røghætte på grund af dets toksicitet.</li>
	<li>Fjern så meget fiksativ som muligt uden at røre ormen pellet og tilsæt 1 ml M9. Lad ormene sætte sig i bunden af røret i 3−5 min.</li>
	<li>Vask igen med 1 ml M9, lad ormene bosætte sig og fjerne supernatant, efterlader omkring 50 μL i røret. Fastgør røret ved hjælp af en klemme.</li>
	<li>Frys ormene ved at kaste det sikkert lukkede rør i flydende nitrogen og derefter ind i et varmt vandbad ved ~ 40 °C.</li>
	<li>Gentag trin 1.9 en gang til.</li>
	<li>Der tilsættes 0,5 ml BODIPY fortyndet i M9 ved en endelig koncentration på 1 μg/μL, og den sættes på en rotator ved stuetemperatur i 1 time.</li>
	<li>Efter 1 time, lad ormene bosætte sig i bunden af røret i 3−5 min.</li>
	<li>Fjern supernatant og tilsæt 1 ml M9.</li>
	<li>Lad ormene bosætte sig i bunden og fjerne supernatant. BEMÆRK: Alternativt er det muligt at dreje ned ved 252 x g i 1 min.</li>
	<li>Der tilsættes 0,5 ml M9. BEMÆRK: Hvis fiksativ er 60% isopropanol, kan ormene kun anvendes inden for 48 timer. Hvis fikseringsmiddel er methanol, bør ormene udnyttes inden for 24 timer.</li>
</ol>2. Forberedelse agarose puder til at montere orme
BEMÆRK: Det kritiske trin under forberedelsen af en agarosepude er at få en pude med regelmæssig tykkelse. Ellers vil orme på tværs af puden være i forskellige brændpunkter, hvilket gør det vanskeligt at få et fokuseret billede af et bredere synsfelt.
<ol><li>Der tilsættes 2 % agarosepuder ved tilsætning af 0,2 g agarose til 10 ml steriliseret H2O i et bægerglas eller en konisk kolbe. Varm mikrobølgeovnen i 30 s, indtil agarose begynder at koge. BEMÆRK: Overophedes og stop ikke, så snart der opstår bobler. ellers øger det agaroseens viskositet, hvilket gør det sværere at opnå den ønskede padtykkelse.</li>
	<li>Når agarose er smeltet, dispenseres en dråbe smeltet agarose i midten af et mikroskopglasskreds ved hjælp af en 1000 μL pipettespids med det helt store snit. Umiddelbart, men fint, holde en anden glas dias meget tæt på agarose drop og slip den på agarose til at danne en pude af regelmæssig tykkelse for bedste mikroskopi resultater. BEMÆRK: Hvis du slipper det øverste dias fra en højde, dannes det ikke kun bobler, men vil resultere i en ujævn pude. Alternativt er det også muligt at bruge to glasdias, der flankerer diaset med puden, med et tyndt lag tape på hvert dias.</li>
	<li>Efter mindst 2−3 min, fjern forsigtigt den øverste slide. Brug siden af den øverste slide, trimme puden for at gøre det firkantet formet. Monter ormene inden for 5 min, for at forhindre puden i at tørre før brug.</li>
</ol>3. Montering af faste orme til billeddannelse
<ol><li>Opret en mundmikropipette ved at udvide en tynd glaskapillær i flammen af en Bunsen brænder (Figur 1A). Efter forlængelse i flammen, bryde kapillær i to stykker (Figur 1B). Vælg den mest hensigtsmæssige, normalt den længste, og test, om enden af kapillær er åben ved at forsøge at aspirere vand. BEMÆRK: Hvis væsken ikke kommer ind i kapillæren, er den for tynd eller blokeret. Skær forsigtigt enden af kapillæren med en saks, undgå at skære for meget som orme vil blive aspireret, hvis hullet er for stort.</li>
	<li>Sæt glaskapillæren fra trin 3.1 i kapillæradapteren (Figur 1C), der er fastgjort til silikonerøret på 6 mm silikone, og sæt den anden ende af silikonerøret i et 0,2 μm filter, der er fastgjort til et 3 mm silikonerør i den anden ende (Figur 1C). Sæt en 1 ml filterspids (Figur 1C) i den frie ende af silikonerøret for at aspirere væske. BEMÆRK: Der tilsættes 0,2 μm filter mellem eksperimentatorens munding og kapillæren for at sikre maksimal sikkerhed for eksperimentatoren. En lignende opløsning anvendes til mundmikropipetter, der anvendes til håndtering af museembryoner12. Skift filteret (normalt med få måneders mellemrum), hvis mundmikropipetten ikke længere aspirerer væske.</li>
	<li>Brug munden mikropipette under en dissektion mikroskop, fjerne så meget væske som muligt omkring ormen pellet af faste orme (Figur 2). BEMÆRK: Pipettering supernatant ud ved hjælp af en manuel mikropipette kan bruges som et alternativ til munden pipetter i trin 3.1 til 3.3 for at fjerne så meget supernatant som muligt. Der tilsættes 6 μL monteringsmedium. Vi finder dog, at denne metode ikke virker så effektivt, fordi overdreven væske i puder skaber en sparsom orm tæthed, hvilket gør billeddannelse mere tidskrævende. Fortsæt trin 3.6. Kig på bunden af røret og sørg for, at pipetten ikke aspirere ormene.</li>
	<li>Der tilsættes hurtigt 10 μL monteringsmedium (Materialetabel) til bunden af røret.</li>
	<li>Skyl en 10 μL spids i PBS med spor af vaskemiddel (0,01% Triton) for at forhindre orme i at holde sig til siderne af plastpipettespidsen. Skær slutningen af spidsen med en saks.</li>
	<li>Overfør 8 μL monteringsmedium, der indeholder ormene, over på agarosepuden, der er fremstillet i trin 2.3. Under mikroskopet skal du forsigtigt ryste diaset for at undgå overlapning af ormene.</li>
	<li>Dæk dråben af monteringsmediet på agarosepuden med en dæksel på 18 mm x 18 mm (Figur 3). BEMÆRK: Mindre dækslæb foretrækkes, da de udøver mindre pres på ormene. Hold dækslæbet med en pincet og påfør den ene kant af dækslæbet mod agarosepuden, før dækslæbet forsigtigt deponeres med pincetten.</li>
</ol>4. Montering levende orme til billeddannelse
BEMÆRK: For at billedet levende orme, de skal immobiliseres på puden. En måde at opnå dette på er at lamme dem med nikotinreceptoren agonist: levamisole (Tabel over Materialer).
<ol><li>Pipette 3−4 μL μL 3 mM levamisole opløst i M9 på agarosepuden, der er skabt i trin 2.3. BEMÆRK: Der skal være nok flydende volumen, at ormene ikke er oven på hinanden, men ikke for meget væske, at ormene er for sparsomme på puden. Erfarne orm plukkere kan bruge 3 μL levamisole. Mindre erfarne plukkere kan være nødvendigt at tilføje en større mængde levamisole, således at levamisole ikke helt fordampe.</li>
	<li>Pick 30−50 orme pr tilstand i dråbe levamisole.</li>
	<li>Dæk dråben af levamisole på agarosepuden med en 18 mm x 18 mm dækslet. Billede orme inden for 1 h, som lammende agent i sidste ende vil føre til døden af ormene.</li>
</ol>5. Billeddiagnostiske dias med epifluorescensmikroskop
<ol><li>Med en agarose pad af ensartet tykkelse, billede alle orme på diaset på én gang ved hjælp af en 6 x 6 eller 7 x 7 stort billede for eksempel med 20x målsætningen om en fluorescerende mikroskop. Hvis tykkelsen af puden ikke er lige, erhverve flere mindre 3 x 3 eller 4 x 4 billeder af samme dias.</li>
	<li>Brug de samme indstillinger til fluorescensintensitet og eksponeringstid for alle forhold. Juster hver indstilling, så den passer til det dias, der har den klareste intensitet, så der ikke er nogen pixelmætning. Følg producentens anvisninger for at få specifikke instruktioner om anskaffelse af billeder.</li>
</ol>6. Oprettelse af montagebilleder af justerede enkelte orme ved hjælp af Worm-align FIJI-rørledningen
<ol><li>Installer open source-billedanalysesoftwarepakken FIJI13/ImageJ14 fra https://imagej.net/Fiji. Hvis en forudgående installation af FIJI er tilgængelig, skal du sikre dig, at den er opdateret til version 1.52a eller nyere, da nogle af de funktioner, der anvendes i makroen (f.eks. tabelfunktioner), kræver dette. Hent makroen Worm-align fra Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.</li>
	<li>Åbn FIJI, og kør makroen Worm-align. Udfør Worm-align ved at klikke på Plugins | Makroer | Kør i FIJI hovedmenulinjen(Figur S1). Find nu scriptet Worm-align.ijm på computeren.</li>
	<li>Makroen initialiserer ved at bede om placeringen af billederne. Rørledningen vil arbejde på både single-channel og multi-kanal fluorescens billeder (Figur S2). Vælg en inputmappe, og makroen genererer automatisk en outputmappe, hvor alle resultater gemmes (Figur S3). BEMÆRK: Det er vigtigt, at den valgte mappe kun indeholder billedfiler, da tilstedeværelsen af andre filformater får makroen til at gå ned. Ideelt set kun gruppere billeder, der blev taget med de samme indstillinger for mikroskoper. Worm-align vil acceptere mange forskellige filformater, herunder nd2, czi, tif, rgb, jpg og png. Navnet på outputmappen vil være det samme som inputmappen, hvor '_output' tilføjes som et postfix, images_output dvs. Outputmappen indeholder fire undermapper, hvor dataene gemmes.</li>
	<li>Lad makroen fortsætte med at åbne det første billede i inputmappen og bruge det som et repræsentativt billede til at udtrække en indstilling for at generere montagen. BEMÆRK: Worm-align vælger automatisk det første billede i inputmappen for at generere de indstillinger, der skal anvendes på alle andre billeder i mappen. Hvis et andet billede anses for at være mere repræsentativt for datasættet, skal du sikre dig, at dette billede er valgt ved at gemme en kopi af billedet i inputmappen og ændre navnet, så det nu står øverst på listen (f.0_RepresentativeImage eks.</li>
	<li>Med tegneværktøjet på lige linje tegnes en linje hen over bredden af en orm (Figur S4) og bruge længden af denne linje til at bestemme højden af de beskårne områder for enkelte orme. For hver kanal skal du angive navnet, opslagstabellen (LUT), intensitetsindstillinger (B&C), og om den skal medtages i montagen (Figur S4). BEMÆRK: Disse parametre registreres og gemmes i en indstillingsfil, Indstillinger.csv, der er placeret i undermappen CellProfiler i outputmappen.</li>
	<li>Når alle indstillinger er blevet fanget, brugeren er vist, hvad billederne vil se ud efter anvendelse af de anvendte indstillinger (Figur S5). Markér det øverste felt, hvis indstillingerne er tilstrækkelige. Vælg indstillinger for montagegenerering (fjern flåter, hvis det ikke er nødvendigt): 1. Generér en montage af udvalgte orme for hvert enkelt billede eller 2. Generér en kombineret montage, hvor alle orme, der er valgt på alle billeder i inputmappen, kombineres til en enkelt montage. Klik på OK for at udføre resten af makroen. BEMÆRK: Hvis det øverste felt ikke er markeret, før du klikker på 'OK', kører makroen opsætningen igen, så billedindstillingerne kan optimeres.</li>
	<li>Worm-align-pipelinen fortsætter nu med at åbne alle billeder i inputmappen. For hvert billede tegnes linjer på længdeaksen for alle orme, der skal indgå i montagen og/eller kvantificeringen (figur 4 og Figur S6) ved hjælp af værktøjet »segmenteret linje« (på FIJI's hovedmenulinje). For at sikre korrekt justering af orm, tegne linjer konsekvent fra hoved til hale ende (eller omvendt), og langs hele længden af ormen (se eksempler på "god" og "dårlig" linje tegning i figur 4B).</li>
	<li>Føj hver linje til roi-lederenved at klikke på Ctrl+T. Worm-align bruger de linjer, der er føjet til roi-lederen, i kombination med parameteren worm width (angivet i trin 6.4) til at generere beskårne billeder af enkelte markerede orme. Samlingen af linje-RO'er gemmes i undermappen 'data'. Denne mappe indeholder også en kopi af det oprindelige billede, der viser linjerne, samt nummeret på ormen. Streger er farvekodet med Glasbey_on_dark opslagstabellen. Billederne af udsøgte orme gemmes i den single_worms i outputmappen. Hvis Worm-align er valgt i trin 6.6 i denne protokol, producerer den desuden montager af alle orme, der er valgt pr. oversigtsbillede og/eller for alle oversigtsbilleder i inputmappen (se Figur 4C og Figur S7). Disse montager findes i undermappen 'justeret' i outputmappen.</li>
</ol>7. Analyse af fluorescensintensitet med en enkelt orm ved hjælp af output fra Worm-align i en automatiseret CellProfiler-pipeline
<ol><li>Til downstream-databehandling og -analyse af Worm-align-outputtet skal du hente og installere open source-billedanalysesoftwarepakken 'CellProfiler15,16 fra https://cellprofiler.org/. Download Worm_CP.cpproj pipeline fra GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align BEMÆRK: Det eksempelpipeline, der er beskrevet her, blev bygget ved hjælp af CellProfiler2.2.0 og kører muligvis ikke i senere versioner af CellProfiler.</li>
	<li>Før du starter pipelinen Worms_CP.cpproj, skal du sikre dig, at alle forventede outputbilleder er til stede i undermappen CellProfiler i outputmappen Worm-align: en behandlet kopi af det oprindelige billede (navngivet: Original_), en binær billedmaske af ormenpopulationen (navngivet: Mask_), en stregmaske af de linjer, der er tegnet på udvalgte orme (navngivet: Lines_), og et billede, der repræsenterer hver af de kanaler, der findes i det oprindelige billede (navngivet efter kanalnummer).</li>
	<li>Hvis du vil kvantificere fluorescensintensiteten i enkelte orme, skal du klikke på inputmodulet Billeder og blot trække cellprofiler-outputmappen ind i det vindue, hvor der står Slip filer og mapper her. Hvis der findes en liste over billeder fra tidligere analyser, skal du først fjerne dem ved at højreklikke i vinduet og vælge Ryd filliste. Hvis du vil ekskludere filen 'Indstillinger.csv' fra billedlisten, skal du vælge enten 'Kun billeder' eller 'Brugerdefineret' med 'Udvidelse er tif, tiff.tif ome.tif eller ome.tiff' for filterindstillingerne (Figur S8).</li>
	<li>Klik på inputmodulet Metadata. I den anden udtrækningsmetode skal du klikke på den gule mappe og finde undermappen CellProfiler i outputmappen WormAlign (Figur S9). Vælg filen Indstillinger.csv og sammenkæd indstillingerne i filen med CellProfiler-outputtet ved at matche metadataene i CSV-filerne med dem i billederne (kanalmetadata).</li>
	<li>Klik på inputmodulet NamesAndTypes, og indsæt et nyt billede for hver kanal i det oprindelige billede, der skal kvantificeres. BEMÆRK: Der findes allerede i eksempelpipelinen ormenmasken, to farvebilleder, linjemasken og det oprindelige billede og tre gråskalabilleder (den grønne og den røde kanal). Listen i dette modul skal justeres, hvis de oprindelige billeder har flere eller færre kanaler end eksempelbillederne.</li>
	<li>Kontroller, at navnet på billederne i hver kolonneetiket/maske/orme er korrekt. BEMÆRK: Navnene på billederne på en linje skal alle svare til det samme oprindelige billede, der skal analyseres. Hvis der opstår en fejl under billedanalyseprocessen, mangler nogle af outputbillederne, og navnene under de tre kolonners etiket/maske/orme svarer ikke længere til det samme oprindelige billede for hver linje. Hvis dette er tilfældet, finde, hvor fejlen er.</li>
	<li>Tryk på Vis outputindstilling for at vælge den mappe, der skal gemmes fra Cellprofiler.</li>
	<li>Klik på Start testtilstand. Når du er i testtilstand, skal du dobbelttjekke indstillingerne for pipelinen ved at anvende dem på det første billede i datasættet ved at klikke på Kør (som vil køre gennem alle aktive moduler i pipelinen) eller Trin (som vil køre gennem rørledningen et modul ad gangen). BEMÆRK: Mens de udtrukne målinger er i testtilstand, eksporteres de ikke, selvom der findes et ExportToSpreadsheet-modul (og er aktivt) i pipelinen.</li>
	<li>Når rørledningen udfører, som den skal, skal du klikke på Afslut testtilstand og derefter trykke på Analysér billeder. Som det er konfigureret i øjeblikket, vil Worms_CP (1) bruge Mask_-billedet til at segmentere en grov ormmaske og Lines_-billedet (Figur S10A) til at fremhæve de valgte orme og producere enkelt ormmasker (Figur S10C), (2) måle fluorescensintensiteten for alle kanaler, der er til stede i inputbillederne i de identificerede og maskerede orme. Rørledningen kan også måle baggrundsintensiteten (Figur S10B) og korrigere alle billeder i overensstemmelse hermed (angivet med ordtærsklen i navnet på den målte parameter, f.eks.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) måle størrelsen af de valgte orme og (4) eksportere alle målte parametre (Figur S10D).</li>
	<li>Åbn Worm_CP output bestående af to csv-filer, orme.csv og linjer.csv der er gemt i den valgte outputmappe (se Figur S11). Disse filer kan åbnes i Excel eller R (Studio) til efterbehandling og rapportering. Hvis der er behov for yderligere output, f.eks.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Worm-align er en FIJI-baseret billedbehandlingspipeline, der let genererer montager af brugervalgte orme, hvor orme rettes og justeres for at hjælpe med visuel sammenligning, klassificering og repræsentation. Selv om denne funktion er også tilbydes af nogle eksisterende værktøjer, især WormToolbox modul i CellProfiler7, Worm-align kræver forholdsvis lidt forudgående billedanalyse erfaring: Brugere behøver kun at spore de orme, de gerne vil vælge til montage (og analyse). Selv om det er nemt at spore ormene på de rå billeddata , især når en berøringsskærmscomputer eller -tablet er tilgængelig, er det altafgørende, at linjer tegnes korrekt langs ormenes længdeakse. Ufuldstændige linjer, der kun følger en del af ormen, vil resultere i delvise orme i montagen (dvs. orme manglende hoveder af hale ender) og delvis segmentering masker under CellProfiler analyse. Hvis linjer fra to individuelle orme krydser, behandles ormene heller ikke korrekt i ormenjusteringsmontagen samt til fluorescens kvantificering. Til kvalitetskontrol gemmes et overlejringsbillede af linjevalgene på det oprindelige billede i datamappen sammen med en QC-tabel. Fra disse kan problematiske linjer, der fører til forkert segmenterede orme, let identificeres og udelukkes fra montage og/eller efterfølgende analyse.
Selv om den direkte input fra eksperimentatoren i udvælgelsen af orme måske synes lidt tidskrævende, det præsenterer en klar fordel af arbejdsgangen i forhold til andre i eksperimenter, hvor orme fra forskellige udviklingsstadier er til stede i det samme billede: Orme kan vælges i løbet af "sporing trin", ved at skitsere kun de orme, der er i den rigtige udviklingsfase. Alternativt kan orme filtreres ved hjælp af output fra Worm_CP baseret på enten længden af sporingslinjen eller segmentmaskens område, begge pålidelige indikatorer for ormenes længde/størrelse. Velsagtens, machine-learning algoritmer kan kæmpe for at genkende orme fra forskellige udviklingsstadier, som deres størrelse og udseende i DIC billeder er så forskellige.
Produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerede dette ved at importere Worm-align output i en simpel CellProfiler pipeline (Worm_CP), som gør det muligt at kvantificere multi-kanal fluorescens intensitet i de enkelte orme, der blev valgt, mens du kører Worm-align pipeline. Vi valgte denne tilgang på grund af cellprofiler-softwarens fleksibilitet: Det er ligetil at indarbejde yderligere moduler i rørledningen for at analysere yderligere funktioner i de enkelte orme (f.eks. måling af størrelsen af lipiddråber eller stressgranulat, kerner, mitokondrier). Desuden kan de enkelte orm masker potentielt bruges til at træne en ny model for WormToolbox7.
De vigtigste fordele ved denne metode er, at det er hurtigt og kræver en simpel orm montering set-up. Denne metode er hurtigere, da det ikke kræver at bruge tid på at lære software drift eller kører uddannelse sæt gennem en maskinealgoritme 7. Desuden virker denne metode med enten levende eller faste orme simpelthen monteret på regelmæssige agarose puder. Der er ingen grund til at anvende komplekse mikrofluidiske kamre, som er udviklet i andremetoder 5,6.

En forholdsvis enkel organisme, nematode C. elegans, er en yderst nyttig model system til at studere sygdomme hos mennesker. Omkring 38% af generne i C. elegans genomet har funktionelle modstykker hos mennesker1,2. En af de unikke egenskaber ved C. elegans er, at det er optisk gennemsigtig, så nem adgang til in vivo oplysninger om (sub) cellulære udtryk for fluorescerende journalister på tværs af væv. Dette gør C. elegans en førsteklasses model organisme for højt indhold skærme ved hjælp af billedbaserede platforme3. Men et problem, der ofte komplicerer disse undersøgelser er, at når billeddannelse tætte populationer af orme, de har tendens til at krydse og klynge, foretage sammenligninger på tværs af de enkelte orme udfordrende, uklarhed downstream billedanalyse og kvantitet.
Eksisterende løsninger, derovervinderdette problem, er typisk afhængige af optimering af dyrknings- og billeddiagnostisk protokol,f.eks. Andre har anvendt machine-learning algoritmer giver mulighed for anerkendelse af enkelte orme, selv i en klumpet befolkning. Et glimrende eksempel på sidstnævnte er WormToolbox, som er en modulær udvidelse af open source-billedanalyse platform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyder en løsning med høj overførselshastighed og højt indhold til analyse af C. elegans, og det er klart, at det er en god fordel, at den er inkluderet i CellProfiler, da yderligere analysemoduler nemt kan medtages. Selvom WormToolbox leveres med en færdig uddannet model (DefaultWormModel.xml), er omskoling af maskinlæringsalgoritmen normalt påkrævet for hvert nyt program. Online tutorials om hvordan du gør dette er tilgængelige på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). På trods af dette, installere og bruge WormToolbox kræver en betydelig tidsinvestering for nybegyndere.
Her beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv og tidseffektiv protokol til kultur og billedpopulationer af C. elegans. For at gøre det muligt at vurdere de enkelte orme i de erhvervede billeder har vi udviklet en simpel open source FIJI-baseret arbejdsgang, kaldet Worm-align. Worm-align kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af rettede og justerede orme. For det første skal brugeren manuelt vælge individuelle orme til analyse ved at trække en linje fra hovedet til halen. Worm-align bruger denne markering til at beskære markerede orme fra oversigtsbilledet og generere en montage, hvor udvalgte orme rettes og justeres for at lette visuel sammenligning og præsentation.
Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Vi har brugt Worm_CP rørledningen til at kvantificere varmechokrespons, en godt bevaret beskyttende mekanisme, der omfolderer proteiner, der er fejlfoldet på grund af stressfaktorer såsom høj temperatur8. Konkret har vi anvendt rørledningen til orme bærer en integreret multi-kopi transgene, hvor initiativtageren til en varmechok inducerende gen, hsp-70 (C12C8.1), drev grøn fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brugt Worm_CP rørledningen på faste dyr, der er blevet mærket med en fluorescerende farvestof, der visualiserer lipid dråber (LDs), de vigtigste fedt opbevaring organelle i C. elegans10. Selvom denne arbejdsproces ikke har det gennemløb, der tilbydes af WormToolBox, er det et brugervenligt og enkelt alternativ til visuel præsentation og analyse af billedbaserede C. elegans eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Et problem, der ofte opstår, når de henter billeddata fra fast eller bedøvet C. elegans er, at orme krydser og klynger med deres naboer. Dette problem forværres med stigende tæthed af orme og skaber udfordringer for billedbehandling og kvantificering. Vi udviklede en FIJI-baseret arbejdsgang, Worm-align, der kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af brugeropdelede, rettede og justerede orme fra rå billeddata af C. elegans. Worm-align er en enkel og brugervenlig arbejdsproces, der ikke kræver forudgående uddannelse af hverken brugeren eller analysealgoritmen. Montager genereret med Worm-align kan støtte den visuelle inspektion af orme, deres klassificering og repræsentation. Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Som et praktisk eksempel har vi brugt rørledningen på to datasæt: det første datasæt er billeder af varmechok reporter orme, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af promotoren for et varmechok inducerende gen hsp-70, og det andet datasæt er billeder fra faste orme, farves for fedt-butikker med en fluorescerende farvestof.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP er en simpel FIJI / CellProfiler workflow, der kan bruges til at rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og til at score hele ormen billede-baserede analyser uden behov for forudgående uddannelse trin. Vi har anvendt Worm-align/Worm_CP til kvantificering af varmechok induceret udtryk i levende dyr eller lipiddråber i faste prøver.

Worm-align og Worm_CP, To open source-rørledninger til glatning og kvantificering af Fluorescens Image Data Opnået fra Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Vi beskriver her en simpel opensource Fiji-baseret arbejdsgang ved navn Worm-align, som kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontage af glattede orme af interesse fra rå mikroskopiske billeder. Da denne arbejdsproces er afhængig af bruger valgte dyr af interesse, kan det være særligt nyttigt, når du analyserer billeder fra C.elegans, hvor ormene ikke alle er på det rigtige stadium eller i den korrekte tilstand. Det skal bemærkes, at produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescens med enten Fiji eller anden billedanalyse software.Her demonstrerer vi fluorescens kvantificering ved hjælp af CellProfiler rørledningen Worm_CP. Begynd med at skabe en mund mikropipette ved at udvide en tynd glas kapillær i flammen af en Bunsen brænder. Efter forlængelse i flammen, bryde kapillær i to stykker, hvis det ikke bryde i to stykker efter forlængelse.Hvis det brød i to stykker, skæres i slutningen af den længste. Vælg det længere stykke, og test, om kapillæren er åben ved at forsøge at aspirere vand. Fjern adapteren fra et 3 millimeter silikonerør.Sæt glaskapillær i en kapillær adapter forbundet med en seks millimeter silikone rør. Sæt derefter den anden ende af det seks millimeter rør i et 0,2 mikrometerfilter og et tre millimeter silikonerør i den anden ende. Sæt en en millimeter filterspids i den frie ende af det tre millimeter silikonerør for at aspirere væske.Under en dissektion mikroskop, fjerne så meget væske som muligt omkring en pellet af faste orme med munden mikropipette. Tilsæt hurtigt 10 mikroliter monteringsmedium til bunden af røret. Skyl en 10 mikroliterspids i PBS med spor af vaskemiddel for at forhindre orme i at holde sig til siderne af plastpipettespidsen.Skær derefter slutningen af spidsen med en saks. Overfør otte mikroliter af monteringsmedium med ormene på en tidligere forberedt agarose pad. Mens du observerer diaset under mikroskopet, skal du forsigtigt agitere det for at undgå overlapning af ormene.Derefter dække dråbe montering medium på agarose pad med en 18 af 18 millimeter coverslip. At montere levende orme, pipette tre til fire mikroliter af tre millimolar levamisole opløst i M9 på en agarose pad. Pick 30 til 50 orme pr tilstand i dråbe levamisole.Derefter dække faldet med en 18 med 18 millimeter coverslip og billede ormene inden for en time. Installer open source-billedanalysesoftwarepakken Fiji fra ImageJ, eller hvis den allerede er installeret på computeren, skal du kontrollere, at den er version 1.52A eller nyere, og hent derefter Worm-align-lageret fra GitHub, og gem det på computeren. Når alle pipelinekomponenter er blevet downloadet og installeret, skal du åbne Fiji og udføre makroen Worm-align ved at klikke på plugins, makroer og køre på hovedmenulinjen.Find Worm-align. ijm script og klik åben. Gå til inputmappen med de billeder, der skal analyseres, og klik på Vælg, og sørg for, at den valgte mappe kun indeholder billedfiler.Makroen genererer automatisk en outputmappe, hvor alle resultater gemmes. Navnet på mappen vil være det samme som inputmappen med output som en post-fix. Tillad makroen at åbne det første billede i inputmappen og bruge det som et repræsentativt billede til at udtrække de indstillinger, der kræves for at generere montagen, herunder ormenes bredde, lysstyrken og kontrasten.Tegn en streg over en orms bredde ved hjælp af værktøjet til tegning med lige linjer, og klik på OK. Brug længden af denne linje til at bestemme højden på de beskårne områder for enkelte orme. For hver kanal skal du angive navnet, opslagstabellen, og om den skal medtages i montagen, og klik derefter på OK. Juster derefter indstillingerne for lysstyrke og kontrast for kanalerne ved hjælp af skyderne. Gentag denne proces for de resterende kanaler.Når alle indstillinger er konfigureret, registreres de i en indstillingstabel og gemmes i undermappen CellProfiler i outputmappen. Et billede genereres for at vise, hvordan alle billeder vil se ud efter anvendelse af indstillingerne. Hvis billedet er tilfredsstillende, skal du sætte kryds i det øverste felt.Den anden og tredje boks i kontrolpanelet angiver alle indstillinger indstillingerne for montagegenerering. Lad begge felter være markeret, og klik på OK for at udføre resten af makroen. Hvis du ikke markerer det øverste felt, kører makroen igen installationen.Makroen fortsætter derefter med at åbne alle billeder i inputmappen. For hvert billede skal du tegne linjer på længdeaksen for alle orme, der skal medtages i montagen, ved hjælp af det segmenterede værktøj eller frihåndslinjeværktøjet. Tegn linjer konsekvent fra hoved til hale eller omvendt langs ormenes fulde længde, og føj hver linje til roi-lederen ved at klikke på Kontrol-T.Når alle ønskede orme er blevet tilføjet, skal du klikke på OK. Worm-align genererer derefter beskårne billeder af enkelte valgte orme, som gemmes i undermappen til en enkelt orm i outputmappen.Montager af alle valgte orme gemmes i den justerede mappe. Hent og installer CellProfiler 2.2.0 ved at klikke på linket til tidligere CellProfiler-udgivelser på overførselssiden og vælge det nødvendige operativsystem. Før du starter Worm_CP-rørledningen, skal du sikre dig, at alle forventede outputbilleder er til stede i undermappen CellProfiler i outputmappen Worm-align.En behandlet kopi af det oprindelige billede, en binær billedmaske af ormenpopulationen, juster masken, hvis linjen tegnes på udvalgte orme, og et billede, der repræsenterer hver af kanalerne i det oprindelige billede, skal være til stede. Åbn CellProfiler, og klik derefter på inputmodulet for billeder, og træk cellprofilmodulmappen ind i vinduet, hvor der står drop-filer og mapper her. Hvis der findes en liste over billeder fra en tidligere analyse, skal du først fjerne disse ved at højreklikke i vinduet og vælge ryd filliste.Klik på metadata input modul og på den anden udtrækning metode, skal du klikke på den gule mappe og navigere til CellProfiler undermappe af Worm-align output mappe. Vælg indstillingsfilen, og klik derefter på Opdater. Klik derefter på navne og typer input modul, og sørg for, at alle billeder, der kræves for rørledningen er til stede.Før du kører pipelinen, skal du vælge en destination for outputresultaterne i outputmodulet. Brug testtilstanden til at se, hvordan pipelinen klarer sig, ved at klikke på starttesttilstand og lade den køre gennem det første billede i mappen. Når du er tilfreds med pipelinens ydeevne, skal du klikke på afslut testtilstand og analysere billeder.Før analyse påbegyndes, skal du sørge for, at alle øjne foran analysemodulet er lukket. Når analysen er færdig, skal du Worm_CP en outputmappe, der består af to CSV-filer, orme CSV og linjer CSV. Culturing og billeddannelse C.elegans i henhold til den metode, der er beskrevet i denne protokol producerer store overblik billeder af orm populationer.Rørledningens output afhænger i høj grad af kvaliteten af de linjer, der trækkes oven på billederne. Flere linje eksempler og deres output fra Worm-align er vist her. Når du bruger worm-align-scriptet, er visuel identifikation af krydsende orme mulig fra de overlejringsbilleder, der findes i dataundermappen, samt fra panelerne af individuelle orme i montagen.QC-tabellen kan også bruges til at identificere overlappende orme. De krydsende linjer er dog problematiske for den Worm_CP rørledning. Dette skyldes, Worm_CP bruger stregmaske, ikke områder af interesse, til at hjælpe med at identificere de enkelte orme.Derfor segmenterer CellProfiler en af ormene som to objekter. Den Worm_CP rørledning er blevet brugt til at kvantificere fluorescensintensiteten fra faste dyr mærket med et fluorescerende farvestof, der inkorporerer i lipiddråber. Lipiddråbeindholdet reduceres med 17 % mellem vilde dyr og mutantE DBL1-dyr ved hjælp af manuel kvantificering og med 12 % ved hjælp af Worm_CP rørledningen.Worm_CP også brugt til at kvantificere varmechokresponset i levende orme, der udtrykker GFP under kontrol af et varmechok, der er inducereligt gen. I mangel af varme stress, har ormene ikke fremkalde GFP udtryk. Når ormene udsættes som et kort varmechok, induceres GFP-udtrykket.Produktionen af Worm_CP i høj grad af kvaliteten af de linjer, du tegner ved hjælp af Worm-align. Sørg for, at dine linjer ikke rører eller overlapper hinanden, og tegn alle dine linjer i samme retning. Hvis du kontrollerer QC-tabellen, kan du identificere linjer, der rører ved eller overlapper hinanden, så du kan udelukke disse sager fra din analyse.Produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering enten i Fiji eller i andre billedanalyse softwarepakker. Vi har vist her en meget grundlæggende CellProfiler pipeline, hvor andre analysemoduler meget let kunne indarbejdes, for eksempel for at tælle antallet af lipiddråber eller for at kvantificere intensiteten af de enkelte dråber i en orm. En af fordelen ved denne teknik er en mulighed for at kvantificere fluorescens fra de enkelte orme hurtigt.I vores laboratorium har vi en interesse i individuel levedygtighed ved hjælp af fluorescensjournalister, og vi bruger Worm-align og Worm_CP rutinemæssigt til dette formål.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow til High-indhold, individuel celle Kvantificering af fluorescerende markører fra Universal Microscope data, støttet af Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og kvantificere udviklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Brug Open source Værktøj

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation og Kvantificering af telomer og repetitive sekvenser Brug Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA-prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis hjælp Automated Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantificering af Lipid overflod og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nilen rød og olie røde O farvning

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...