Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

We willen dr. Christian Lanctôt van BIOCEV (Praag, Tsjechië) bedanken voor het leren van de mondmicropipet-techniek om vaste wormen te monteren en Dr. Fatima Santos en Dr. Debbie Drage voor het delen van veiligheidsopstelling op mondmicropipet. We danken ook Francesca Hodge voor het bewerken van het manuscript, Sharlene Murdoch en Babraham Institute Facilities voor hun steun. OC wordt ondersteund door ERC 638426 en BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Worm-align is een FIJI-gebaseerde beeldverwerkingspijplijn die gemakkelijk montages van door de gebruiker geselecteerde wormen genereert, waarin wormen worden rechtgetrokken en uitgelijnd om visuele vergelijking, classificatie en representatie te helpen. Hoewel deze functie ook wordt aangeboden door een aantal bestaande tools, met name de WormToolbox module in CellProfiler7, Worm-align vereist relatief weinig eerdere beeldanalyse ervaring: Gebruikers hoeven alleen maar te traceren die wormen die ze willen selecteren voor de montage (en analyse). Hoewel het traceren van de wormen op de ruwe beeldgegevens een eenvoudig proces is - vooral wanneer een touch-screen computer of tablet beschikbaar is- is het van het grootste belang dat lijnen correct worden getrokken langs de lengteas van de wormen. Onvolledige lijnen, die slechts een deel van de worm volgen, zullen resulteren in gedeeltelijke wormen in de montage (d.w.z. wormen die kop van staarteinden missen) en gedeeltelijke segmentatiemaskers tijdens de analyse van CellProfiler. Ook, als lijnen van twee individuele wormen kruisen, zullen de wormen niet correct worden verwerkt in de worm uitlijning montage evenals voor fluorescentie kwantificering. Voor kwaliteitscontrole wordt een overlayafbeelding van de lijnselecties op de oorspronkelijke afbeelding opgeslagen in de gegevensmap, samen met een QC-tabel. Van deze, problematische lijnen die zullen leiden tot onjuist gesegmenteerde wormen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en uitgesloten van montage en / of latere analyse.
Hoewel de directe input van de experimentator in de selectie van wormen misschien een beetje tijdrovend lijkt, presenteert het een duidelijk voordeel van de workflow ten opzichte van anderen in experimenten waar wormen uit verschillende ontwikkelingsstadia aanwezig zijn in hetzelfde beeld: Wormen kunnen worden geselecteerd tijdens de "traceringsstap", door alleen die wormen te schetsen die zich in de juiste ontwikkelingsfase bevinden. Als alternatief kunnen wormen worden gefilterd met behulp van de uitvoer van Worm_CP op basis van de lengte van de traceringslijn, of het gebied van het segmentatiemasker, beide betrouwbare indicatoren van de lengte/grootte van de wormen. Ongetwijfeld, machine-learning algoritmen kunnen moeite hebben om wormen te herkennen uit verschillende ontwikkelingsstadia, als hun grootte en uiterlijk in de DIC-beelden is zo verschillend.
De output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentie intensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI direct, of in andere beeldanalyse software platforms. We hebben dit aangetoond door de Worm-align output te importeren in een eenvoudige CellProfiler-pijplijn (Worm_CP), die de kwantificering van multi-channel fluorescentieintensiteit mogelijk maakt in die individuele wormen die zijn geselecteerd tijdens het uitvoeren van de Worm-align-pijplijn. We kozen voor deze aanpak vanwege de flexibiliteit van de CellProfiler-software: Het is eenvoudig om extra modules in de pijplijn op te nemen om extra functies in individuele wormen te analyseren (bijvoorbeeld het meten van de grootte van lipidedruppels, of stresskorrels, kernen, mitochondriën). Bovendien kunnen de enkele wormmaskers mogelijk worden gebruikt om een nieuw model voor WormToolbox7te trainen.
De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het snel is en vereist een eenvoudige worm montage set-up. Deze methode is sneller omdat het geen tijd nodig heeft om software te leren werken of trainingssets uit te voeren via een machinealgoritme7. Bovendien werkt deze methode met levende of vaste wormen die eenvoudig op gewone agarosepads zijn gemonteerd. Het is niet nodig om complexe microfluïde kamers te gebruiken, zoals ontwikkeld in andere methoden5,6.

Een relatief eenvoudig organisme, de nematode C. elegans,is een uiterst nuttig modelsysteem voor het bestuderen van menselijke ziekten. Ongeveer 38% van de genen in het genoom van C. elegans heeft functionele tegenhangers bij mensen1,2. Een van de unieke kenmerken van C. elegans is dat het optisch transparant is, waardoor gemakkelijk toegang is tot in vivo informatie over (sub)cellulaire expressie van tl-verslaggevers over weefsels. Dit maakt C. elegans een topmodel organisme voor high-content schermen met behulp van image-based platforms3. Echter, een probleem dat vaak compliceert deze studies is dat wanneer de beeldvorming dichte populaties van wormen, ze de neiging om te kruisen en te clusteren, het maken van vergelijkingen tussen individuele wormen uitdagend, vertroebelen downstream beeldanalyse en kwantificering.
Bestaande oplossingen die dit probleem te overwinnen meestal vertrouwen op de optimalisatie van de culturing en imaging protocol, zoals door het gebruik van micro-fluidics setups4, waardoor enkele wormen worden vastgelegd in afzonderlijke beelden5,6. Anderen hebben toegepast machine-learning algoritmen waardoor voor de erkenning van enkele wormen, zelfs in een samengeklonterde bevolking. Een uitstekend voorbeeld van de laatste is de WormToolbox, dat is een modulaire uitbreiding van de open-source beeldanalyse platform, CellProfiler7. WormToolbox biedt een high-throughput en high-content oplossing voor analyse van C. elegans, en profiteert duidelijk van de opname ervan in CellProfiler, omdat aanvullende analysemodules gemakkelijk kunnen worden opgenomen. Hoewel WormToolbox wordt geleverd met een vooraf opgeleid model (DefaultWormModel.xml), is omscholing van het machine learning-algoritme meestal vereist voor elke nieuwe toepassing. Online tutorials over hoe dit te doen zijn beschikbaar op Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Ondanks dit, het installeren en gebruiken van WormToolbox vereist een aanzienlijke tijd-investering voor beginnende gebruikers.
Hier beschrijven we een eenvoudig en kosteneffectief protocol voor cultuur en beeldpopulaties van C. elegans. Om de beoordeling van individuele wormen in de verworven beelden mogelijk te maken, hebben we een eenvoudige open-source FIJI-gebaseerde workflow ontwikkeld, genaamd Worm-align. Worm-align kan worden gebruikt om single- of multi-channel montages van rechtgetrokken en uitgelijnde wormen te genereren. Ten eerste moet de gebruiker handmatig individuele wormen selecteren voor analyse door een lijn van het hoofd naar de staart te trekken. Worm-align gebruikt deze selectie om geselecteerde wormen uit de overzichtsafbeelding bij te snijden en een montage te genereren waarin geselecteerde wormen worden rechtgetrokken en uitgelijnd om visuele vergelijking en presentatie te vergemakkelijken.
Bovendien kan de output van Worm-align worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentieintensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI rechtstreeks, of in andere softwareplatforms voor beeldanalyse. We laten dit zien door de Worm-align output te importeren in Worm_CP, een pijplijn die gebruik maakt van de open-source CellProfiler software. De flexibiliteit van CellProfiler maakt de integratie van extra modules voor hoog-inhoudsonderzoek mogelijk. We hebben de Worm_CP pijpleiding gebruikt om de warmteschokrespons te kwantificeren, een goed bewaard beschermd mechanisme dat eiwitten die verkeerd zijn gevouwen als gevolg van stressoren zoals hoge temperatuur8,opnieuw vouwt. Specifiek hebben we de pijpleiding toegepast op wormen die een geïntegreerde multi-copy transgene, waar de promotor van een warmteshock induceerbare gen, hsp-70(C12C8.1), drijft groene fluorescerende eiwit (GFP)9. We hebben ook gebruik gemaakt van de Worm_CP pijpleiding op vaste dieren die zijn geëtiketteerd met een fluorescerende kleurstof die lipide druppels (LP's) visualiseert, de belangrijkste vetopslag organelle in C. elegans10. Hoewel deze workflow niet over de doorvoer van WormToolBox beschikt, is het een gebruiksvriendelijk en eenvoudig alternatief voor visuele presentatie en analyse van op afbeeldingen gebaseerde C. elegans-experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Een probleem vaak ondervonden bij het verwerven van beeldgegevens van vaste of verdoofde C. elegans is dat wormen kruisen en clusteren met hun buren. Dit probleem wordt verergerd door de toenemende dichtheid van wormen en creëert uitdagingen voor beeldvorming en kwantificering. We ontwikkelden een fiji-gebaseerde workflow, Worm-align, die kan worden gebruikt om single- of multi-channel montages van door de gebruiker geselecteerde, rechtgetrokken en uitgelijnde wormen te genereren uit ruwe beeldgegevens van C. elegans. Worm-align is een eenvoudige en gebruiksvriendelijke workflow die geen voorafgaande training van de gebruiker of het analysealgoritme vereist. Montages gegenereerd met Worm-align kan helpen bij de visuele inspectie van wormen, hun classificatie en representatie. Bovendien kan de output van Worm-align worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentieintensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI rechtstreeks, of in andere softwareplatforms voor beeldanalyse. We laten dit zien door de Worm-align output te importeren in Worm_CP, een pijplijn die gebruik maakt van de open-source CellProfiler software. De flexibiliteit van CellProfiler maakt de integratie van extra modules voor hoog-inhoudsonderzoek mogelijk. Als praktisch voorbeeld hebben we de pijplijn gebruikt op twee datasets: de eerste dataset zijn beelden van warmteschok reporter wormen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken onder de controle van de promotor van een warmteschok inducible gen hsp-70, en de tweede dataset zijn beelden verkregen uit vaste wormen, gekleurd voor vet-winkels met een fluorescerende kleurstof.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP is een eenvoudige FIJI / CellProfiler workflow die kan worden gebruikt om recht te maken en uit te lijnen Caenorhabditis elegans monsters en om hele worm beeld-gebaseerde tests te scoren zonder de noodzaak van voorafgaande training stappen. We hebben Worm-align/Worm_CP toegepast op de kwantificering van warmte-shock geïnduceerde expressie bij levende dieren of lipide druppels in vaste monsters.

Worm-align en Worm_CP, Twee Open-Source Pipelines voor straightening en kwantificering van fluorescentie beeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

We beschrijven hier een eenvoudige opensource Fiji-gebaseerde workflow genaamd Worm-align, die kan worden gebruikt om single of multi-channel montages van rechtgetrokken wormen van belang van ruwe microscopie beelden te genereren. Omdat deze workflow afhankelijk is van door de gebruiker geselecteerde dieren van belang, kan het vooral handig zijn bij het analyseren van afbeeldingen van C.elegans waar de wormen zich niet allemaal in de juiste fase of conditie bevinden. Opgemerkt moet worden dat de output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentie met Fiji of andere beeldanalyse software.Hier tonen we fluorescentie kwantificering met behulp van de CellProfiler pijpleiding Worm_CP. Begin met het creëren van een mondmicropipet door het uitbreiden van een dunne glazen capillair in de vlam van een Bunsen brander. Na uitbreiding in de vlam, breek de capillaire in twee stukken als het niet breken in twee stukken na verlenging.Als het brak in twee stukken, snijd het einde van de langste. Selecteer het langere stuk en test of de capillaire open is door te proberen water aan tezuigen. Maak de adapter los van een siliconen buis van drie millimeter.Sluit de glazen capillair aan op een capillaire adapter gekoppeld aan een siliconen buis van zes millimeter. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de zes millimeter buis aan in een 0,2 micrometerfilter en een drie millimeter siliconen buis aan de andere kant. Sluit een filterpunt van één millimeter aan op het vrije uiteinde van de drie millimeter siliconen buis om vloeistof aan te trekken.Verwijder onder een dissectiemicroscoop zoveel mogelijk vloeistof rond een pellet van vaste wormen met de mondmicropipet. Voeg snel 10 microliter montagemedium toe aan de onderkant van de buis. Spoel een 10 microliter tip in PBS met sporen van wasmiddel om te voorkomen dat wormen aan de zijkanten van de plastic pipetpunt blijven plakken.Snijd vervolgens het uiteinde van de punt met een schaar. Breng acht microliter van montagemedium met de wormen op een eerder voorbereide agarosepad. Tijdens het observeren van de dia onder de microscoop, zachtjes roeren om overlap van de wormen te voorkomen.Bedek vervolgens de druppel montagemedium op het agarosepad met een 18 bij 18 millimeter coverslip. Om levende wormen te monteren, pipet drie tot vier microliters van drie millimolar levamisole opgelost in M9 op een agarose pad. Kies 30 tot 50 wormen per aandoening in de druppel levamisole.Bedek vervolgens de daling met een omslag van 18 bij 18 millimeter en beeld de wormen binnen een uur. Installeer het open source image analysis software pakket Fiji van ImageJ, of als het al is geïnstalleerd op de computer, controleren of het versie 1.52A of hoger, download dan de Worm-align repository van GitHub en sla het op de computer. Zodra alle pijplijnonderdelen zijn gedownload en geïnstalleerd, opent u Fiji en voert u de wormuitlijnende macro uit door op plug-ins, macro's en uitgevoerd in de hoofdmenubalk uit te voeren.Zoek de Worm-align. ijm script en klik open. Navigeer naar de invoermap met de te analyseren afbeeldingen en klik op selecteren, om ervoor te zorgen dat de geselecteerde map alleen afbeeldingsbestanden bevat.De macro genereert automatisch een uitvoermap waarin alle resultaten worden opgeslagen. De naam van de map is hetzelfde als de invoermap met uitvoer als een post-fix. Laat de macro de eerste afbeelding in de invoermap openen en deze gebruiken als een representatieve afbeelding om de instellingen te extraheren die nodig zijn om de montage te genereren, inclusief de breedte van de wormen, de helderheid en het contrast.Teken met de rechte lijn tekent u een lijn over de breedte van een worm en klikt op OK. Gebruik de lengte van deze lijn om de hoogte van de bijgesneden gebieden voor enkele wormen te bepalen. Geef voor elk kanaal de naam, opzoektabel op en of deze in de montage moet worden opgenomen en klik op OK. Pas vervolgens de instellingen voor helderheid en contrast voor de kanalen aan met behulp van de schuifregelaars. Herhaal dit proces voor de overige kanalen.Zodra alle instellingen zijn geconfigureerd, worden ze opgenomen in een instellingentabel en opgeslagen in de CellProfiler-submap van de uitvoermap. Er wordt een afbeelding gegenereerd om te laten zien hoe alle afbeeldingen eruit zien na toepassing van de instellingen. Als de afbeelding bevredigend is, vinkt u het bovenste vakje aan.Het tweede en derde vakje van het vinkje alle instellingen paneel geven de opties voor montage generatie. Laat beide vakjes aangevinkt en klik op OK om de rest van de macro uit te voeren. Als u het bovenste vakje niet aanvinkt, wordt de installatie opnieuw uitgevoerd door de macro.De macro gaat vervolgens verder met het openen van alle afbeeldingen in de invoermap. Teken voor elke afbeelding lijnen op de lengteas van alle wormen die in de montage moeten worden opgenomen met behulp van het gesegmenteerde of het freehandlijngereedschap. Teken lijnen consequent van kop naar staart of vice versa langs de volledige lengte van de wormen en voeg elke regel toe aan de ROI-manager door op Control T.Once alle gewenste wormen zijn toegevoegd, klik op OK. Worm-align genereert vervolgens bijgesneden afbeeldingen van enkele geselecteerde wormen, die worden opgeslagen in de enkele wormsubmap van de uitvoermap.Montages van alle geselecteerde wormen worden opgeslagen in de uitgelijnde map. Download en installeer CellProfiler 2.2.0 door op de koppeling voor eerdere CellProfiler-releases op de downloadpagina te klikken en het vereiste besturingssysteem te selecteren. Voordat u de Worm_CP pijplijn start, moet u ervoor zorgen dat alle verwachte uitvoerafbeeldingen aanwezig zijn in de cellprofiler-submap van de map Worm-align output.Een verwerkte kopie van de oorspronkelijke afbeelding, een binair afbeeldingsmasker van de wormpopulatie, uitlijnen masker als de lijn is getekend op geselecteerde wormen en een afbeelding die elk van de kanalen in de oorspronkelijke afbeelding moet aanwezig zijn. Open CellProfiler, klik vervolgens op de invoermodule voor afbeeldingen en sleep de modulemap CellProfiler naar het venster met de tekst drop files and folders hier. Als een lijst met afbeeldingen uit een vorige analyse aanwezig is, verwijdert u deze eerst door met de rechtermuisknop in het venster te klikken en de lijst met bestanden wissen te selecteren.Klik op de module met metadata-invoer en klik op de tweede extractiemethode op de gele map en navigeer naar de cellprofiler-submap van de map Worm-align output. Selecteer het instellingenbestand en klik op bijwerken. Klik vervolgens op de invoermodule voor namen en typen en zorg ervoor dat alle afbeeldingen die nodig zijn voor de pijplijn aanwezig zijn.Voordat u de pijplijn uitvoert, selecteert u een bestemming voor de uitvoerresultaten in de uitvoermodule. Gebruik de testmodus om te zien hoe de pijplijn presteert door op de starttestmodus te klikken en deze door de eerste afbeelding in de map te laten lopen. Wanneer u tevreden bent met de prestaties van de pijplijn, klikt u op de testmodus afsluiten en afbeeldingen analyseren.Voordat u met de analyse begint, moet u ervoor zorgen dat alle ogen voor de analysemodule gesloten zijn. Wanneer de analyse is voltooid, opent u de Worm_CP uitvoermap die bestaat uit twee CSV-bestanden, wormen CSV en lijnen CSV. Culturing and imaging C.elegans volgens de in dit protocol beschreven methode levert grote overzichtsbeelden op van wormpopulaties.De uitvoer van de pijplijn hangt grotendeels af van de kwaliteit van de lijnen die bovenop de afbeeldingen zijn getekend. Verschillende lijnvoorbeelden en hun output van Worm-align worden hier getoond. Bij het gebruik van de Worm-align script, visuele identificatie van kruisende wormen is mogelijk van de overlay beelden gevonden in de gegevens submap, evenals van de panelen van individuele wormen in de montage.De QC-tabel kan ook worden gebruikt om overlappende wormen te identificeren. Kruislijnen zijn echter problematisch voor de Worm_CP-pijplijn. Dit komt omdat Worm_CP lijnmasker gebruikt, niet regio's van belang, om individuele wormen te identificeren.Daarom segmenteert CellProfiler een van de wormen als twee objecten. De Worm_CP pijpleiding is gebruikt om fluorescentieintensiteit te kwantificeren van vaste dieren gelabeld met een fluorescerende kleurstof die is opgenomen in lipide druppels. Het lipidedruppelgehalte wordt verminderd met 17% tussen wilde type en gemuteerde DBL1 dieren met behulp van handmatige kwantificering, en met 12% met behulp van de Worm_CP pijpleiding.Worm_CP werd ook gebruikt om de reactie van de hitteschok te kwantificeren bij levende wormen die GFP uitdrukken onder controle van een hitteshock-induceerbare gen. Bij afwezigheid van hittestress induceren de wormen geen GFP-expressie. Wanneer de wormen worden blootgesteld als een korte hitteschok, wordt de GFP-expressie geïnduceerd.De output van Worm_CP hangt grotendeels af van de kwaliteit van de lijnen die u tekent met behulp van Worm-align. Zorg ervoor dat uw lijnen niet raken of overlappen en teken al uw lijnen in dezelfde richting. Als u de QC-tabel controleert, u lijnen identificeren die elkaar raken of overlappen, zodat u deze gevallen uitsluiten van uw analyse.De output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering, hetzij in Fiji of in andere softwarepakketten voor beeldanalyse. We hebben hier een zeer eenvoudige CellProfiler-pijpleiding getoond waarin andere analysemodules heel gemakkelijk kunnen worden opgenomen, bijvoorbeeld om het aantal lipidedruppels te tellen of om de intensiteit van individuele druppels in een worm te kwantificeren. Een van het voordeel van deze techniek is een mogelijkheid om fluorescentie van individuele wormen snel te kwantificeren.In ons lab hebben we een belang bij individuele levensvatbaarheid met behulp van fluorescentie verslaggevers en we gebruiken Worm-align en Worm_CP routinematig voor dit doel.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...