Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Wir danken Dr. Christian Lantét von BIOCEV (Prag, Tschechische Republik) dafür, dass er uns die Mundmikropipettentechnik zur Montage fester Würmer beigebracht hat, und Dr. Fatima Santos und Dr. Debbie Drage für die gemeinsame Sicherheitseinrichtung auf Mundmikropipette. Wir danken auch Francesca Hodge für die Bearbeitung des Manuskripts, Sharlene Murdoch und Babraham Institute Facilities für ihre Unterstützung. OC wird von ERC 638426 und BBSRC [BBS/E/B000C0426] unterstützt.

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Worm-align ist eine FIJI-basierte Bildverarbeitungspipeline, die leicht Montagen von vom Benutzer ausgewählten Würmern erzeugt, in denen Würmer begradigt und ausgerichtet werden, um visuelle Vergleich, Klassifizierung und Darstellung zu unterstützen. Obwohl diese Funktion auch von einigen vorhandenen Tools angeboten wird, insbesondere dem WormToolbox-Modul in CellProfiler7, erfordert Worm-align vergleichsweise wenig Erfahrung mit der vorherigen Bildanalyse: Benutzer müssen nur die Würmer verfolgen, die sie für die Montage (und Analyse) auswählen möchten. Obwohl die Verfolgung der Würmer auf den Rohbilddaten ein einfacher Prozess ist - insbesondere wenn ein Touchscreen-Computer oder Tablet verfügbar ist -, ist es von größter Bedeutung, dass Linien korrekt entlang der Längsachse der Würmer gezeichnet werden. Unvollständige Linien, die nur einem Teil des Wurms folgen, führen zu Teilwürmern in der Montage (d. h. Würmern fehlen den Köpfen der Schwanzenden) und teilsegmentierenden Masken während der CellProfiler-Analyse. Wenn sich auch Linien von zwei einzelnen Würmern kreuzen, werden die Würmer in der Schneckenausrichtungsmontage sowie bei der Fluoreszenzquantifizierung nicht korrekt verarbeitet. Zur Qualitätskontrolle wird ein Überlagerungsbild der Zeilenauswahl auf dem Originalbild im Datenordner zusammen mit einer QC-Tabelle gespeichert. Aus diesen können problematische Linien, die zu falsch segmentierten Würmern führen, leicht identifiziert und von der Montage und/oder nachfolgenden Analyse ausgeschlossen werden.
Obwohl die direkte Eingabe des Experimentators bei der Auswahl der Würmer vielleicht etwas zeitaufwändig erscheint, stellt sie einen klaren Vorteil des Workflows gegenüber anderen in Experimenten dar, bei denen Würmer aus verschiedenen Entwicklungsstadien im selben Bild vorhanden sind: Würmer können während des "Tracing Step" ausgewählt werden, indem nur die Würmer skizziert werden, die sich in der richtigen Entwicklungsphase befinden. Alternativ können Würmer mithilfe der Ausgabe von Worm_CP gefiltert werden, entweder basierend auf der Länge der Ablaufverfolgungslinie oder dem Bereich der Segmentierungsmaske, beides zuverlässige Indikatoren für die Länge/Größe der Würmer. Vermutlich können maschinelle Lernalgorithmen Schwierigkeiten haben, Würmer aus verschiedenen Entwicklungsstadien zu erkennen, da ihre Größe und ihr Aussehen in den DIC-Bildern so unterschiedlich sind.
Die Ausgabe von Worm-align kann für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir haben dies demonstriert, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in eine einfache CellProfiler-Pipeline (Worm_CP importiert haben, die die Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenzintensität in den einzelnen Würmern ermöglicht, die beim Ausführen der Worm-Align-Pipeline ausgewählt wurden. Diesen Ansatz haben wir uns aufgrund der Flexibilität der CellProfiler Software gewählt: Es ist einfach, zusätzliche Module in die Pipeline zu integrieren, um zusätzliche Merkmale in einzelnen Würmern zu analysieren (z.B. Messung der Größe von Lipidtröpfchen oder Spannungsgranulat, Kernen, Mitochondrien). Darüber hinaus könnten die einzelnen Wurmmasken möglicherweise verwendet werden, um ein neues Modell für WormToolbox7zu trainieren.
Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie schnell ist und eine einfache Wurmmontage erfordert. Diese Methode ist schneller, da sie keine Zeit mit dem Erlernen von Softwareoder dem Ausführen von Trainingssätzen über einen Maschinenalgorithmus7erfordert. Darüber hinaus funktioniert diese Methode entweder mit lebenden oder festen Würmern, die einfach auf regulären Agarose-Pads montiert sind. Es besteht keine Notwendigkeit, komplexe mikrofluidische Kammern zu verwenden, wie in anderen Methodenentwickelt 5,6.

Ein relativ einfacher Organismus, die Nematode C. elegans, ist ein äußerst nützliches Modellsystem zur Untersuchung menschlicher Krankheiten. Etwa 38% der Gene im C. elegans Genom haben funktionelle Gegenstücke beim Menschen1,2. Eines der einzigartigen Merkmale von C. elegans ist, dass es optisch transparent ist und einen einfachen Zugang zu In-vivo-Informationen über die (sub-)zelluläre Expression von fluoreszierenden Reportern über Gewebe hinweg ermöglicht. Dies macht C. elegans zu einem erstklassigen Modellorganismus für bildschirmreiche Bildschirme mit hoher Inhalte mit bildbasierten Plattformen3. Ein Problem, das diese Studien oft erschwert, ist jedoch, dass sie bei der Abbildung dichter Populationen von Würmern dazu neigen, sich zu kreuzen und zu bündeln, indem sie Vergleiche zwischen einzelnen Würmern herausfordern, die nachgelagerte Bildanalyse und -quantifizierung trüben.
Vorhandene Lösungen, die dieses Problem lösen, basieren in der Regel auf der Optimierung des Kultivierungs- und Bildgebungsprotokolls, z. B. durch die Verwendung von Mikrofluidik-Setups4, so dass einzelne Würmer in separaten Bildern erfasst werden können5,6. Andere haben maschinelle Lernalgorithmen angewendet, die die Erkennung einzelner Würmer ermöglichen, selbst in einer verklumpten Population. Ein hervorragendes Beispiel dafür ist die WormToolbox, eine modulare Erweiterung der Open-Source-Bildanalyseplattform CellProfiler7. WormToolbox bietet eine Lösung mit hohem Durchsatz und hohem Inhalt für die Analyse von C. elegansund profitiert eindeutig von der Aufnahme in CellProfiler, da zusätzliche Analysemodule problemlos einbezogen werden können. Obwohl WormToolbox mit einem vortrainierten Modell (DefaultWormModel.xml geliefert wird, ist in der Regel für jede neue Anwendung eine Umschulung des Machine-Learning-Algorithmus erforderlich. Online-Tutorials dazu sind auf Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) verfügbar. Trotzdem erfordert die Installation und Verwendung von WormToolbox eine erhebliche Zeitinvestition für unerfahrene Benutzer.
Hier beschreiben wir ein einfaches und kosten- und zeiteffektives Protokoll zur Kultur und Imagepopulationen von C. elegans. Um die Beurteilung einzelner Würmer in den aufgenommenen Bildern zu ermöglichen, haben wir einen einfachen Open-Source-WORKFLOW auf FIJI-Basis namens Worm-align entwickelt. Worm-align kann verwendet werden, um Ein- oder Mehrkanalmontagen von begradigten und ausgerichteten Würmern zu erzeugen. Zunächst muss der Benutzer einzelne Würmer für die Analyse manuell auswählen, indem er eine Linie vom Kopf zum Schwanz zeichnet. Worm-align verwendet diese Auswahl, um ausgewählte Würmer aus dem Übersichtsbild zuzuschneiden und eine Montage zu generieren, in der ausgewählte Würmer begradigt und ausgerichtet werden, um den visuellen Vergleich und die Präsentation zu erleichtern.
Darüber hinaus kann die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir demonstrieren dies, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in Worm_CP importieren, eine Pipeline, die die Open-Source-Software CellProfiler verwendet. Die Flexibilität von CellProfiler ermöglicht die Integration zusätzlicher Module für das High-Content-Screening. Wir haben die Worm_CP-Pipeline verwendet, um die Wärmeschock-Reaktion zu quantifizieren, einen gut erhaltenen Schutzmechanismus, der Proteine, die aufgrund von Stressoren wie Hochtemperatur8falsch gefaltet werden, neu faltet. Insbesondere haben wir die Pipeline auf Würmer mit einem integrierten Multi-Copy-Transgen angewendet, wo der Promotor eines Hitzeschock-induzierbaren Gens, hsp-70(C12C8.1), grünes fluoreszierendes Protein (GFP)9antreibt. Wir haben auch die Worm_CP-Pipeline für feste Tiere verwendet, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnet wurden, der Lipidtröpfchen (LDs), die Hauptfettspeicherorganelle in C. elegans10visualisiert. Obwohl dieser Workflow nicht den von WormToolBox angebotenen Durchsatz hat, ist er eine benutzerfreundliche und einfache Alternative zur visuellen Darstellung und Analyse bildbasierter C. elegans-Experimente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Ein Problem, das häufig beim Erfassen von Bilddaten von festen oder anästhesierten C. elegans auftritt, ist, dass Würmer sich mit ihren Nachbarn kreuzen und gruppieren. Dieses Problem verschärft sich durch die zunehmende Dichte von Würmern und schafft Herausforderungen für die Bildgebung und Quantifizierung. Wir haben einen FIJI-basierten Workflow, Worm-align, entwickelt, der verwendet werden kann, um Ein- oder Mehrkanalmontagen von vom Benutzer ausgewählten, begradigten und ausgerichteten Würmern aus Rohbilddaten von C. elegans zu generieren. Worm-align ist ein einfacher und benutzerfreundlicher Workflow, der weder eine vorherige Schulung des Benutzers noch des Analysealgorithmus erfordert. Mit Worm-align erzeugte Montagen können die visuelle Inspektion von Würmern, deren Klassifizierung und Darstellung unterstützen. Darüber hinaus kann die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir demonstrieren dies, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in Worm_CP importieren, eine Pipeline, die die Open-Source-Software CellProfiler verwendet. Die Flexibilität von CellProfiler ermöglicht die Integration zusätzlicher Module für das High-Content-Screening. Als praktisches Beispiel haben wir die Pipeline auf zwei Datensätzen verwendet: Der erste Datensatz sind Bilder von Hitzeschock-Reporterwürmern, die unter der Kontrolle des Promotors eines Hitzeschock-induzierbaren Gens hsp-70grünes fluoreszierendes Protein (GFP) ausdrücken, und der zweite Datensatz sind Bilder, die von festen Würmern gewonnen wurden, die für Fettspeicher mit einem fluoreszierenden Farbstoff gebeizt wurden.

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Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP ist ein einfacher FIJI/CellProfiler-Workflow, der verwendet werden kann, um Caenorhabditis elegans-Proben zu begradigen und auszurichten und bildbasierte Tests zu bewerten, ohne dass vorherige Trainingsschritte erforderlich sind. Wir haben Worm-align/Worm_CP auf die Quantifizierung der hitzeschockinduzierten Expression bei lebenden Tieren oder Lipidtröpfchen in festen Proben angewendet.

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Wir beschreiben hier einen einfachen OpenSource-Workflow auf Fidschi-Basis namens Worm-align, der verwendet werden kann, um Einzel- oder Mehrkanalmontagen von begradigten Würmern von Interesse aus rohen Mikroskopiebildern zu erzeugen. Da dieser Workflow von vom Benutzer ausgewählten Tieren von Interesse abhängt, kann dies besonders nützlich sein, wenn Bilder von C.elegans analysiert werden, bei denen sich die Würmer nicht alle im richtigen Stadium oder Zustand befinden. Es sollte beachtet werden, dass die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenz mit Fidschi oder einer anderen Bildanalysesoftware verwendet werden kann.Hier demonstrieren wir die Fluoreszenzquantifikation mit der CellProfiler-Pipeline Worm_CP. Beginnen Sie mit der Erstellung einer Mundmikropipette, indem Sie eine dünne Glaskapillare in der Flamme eines Bunsenbrenners ausdehnen. Nach verlängerung in der Flamme, brechen Sie die Kapillare in zwei Stücke, wenn es nicht in zwei Stücke nach verlängerung brechen.Wenn es in zwei Stücke zerbrach, schneiden Sie das Ende des längsten. Wählen Sie das längere Stück aus und testen Sie, ob die Kapillare offen ist, indem Sie versuchen, Wasser zu saugen. Lösen Sie den Adapter von einem drei Millimeter silikonrohr.Stecken Sie die Glaskapillare in einen Kapillaradapter, der mit einem sechs Millimeter langen Silikonrohr verbunden ist. Dann das andere Ende des Sechs-Millimeter-Rohres in einen 0,2-Mikrometer-Filter und ein Drei-Millimeter-Silikonrohr am anderen Ende stecken. Stecken Sie eine ein Millimeter Filterspitze in das freie Ende des drei Millimeter großen Silikonrohrs, um Flüssigkeit zu saugen.Entfernen Sie unter einem Seziermikroskop so viel Flüssigkeit wie möglich um ein Pellet fester Würmer mit der Mundmikropipette. Fügen Sie schnell 10 Mikroliter Montagemedium an der Unterseite des Rohres hinzu. Spülen Sie eine 10-Mikroliter-Spitze in PBS mit Spuren von Reinigungsmittel, um zu verhindern, dass Würmer an den Seiten der Kunststoff-Pipettespitze kleben.Dann schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer Schere. Acht Mikroliter Montagemedium mit den Würmern auf ein zuvor vorbereitetes Agarosepad übertragen. Während Sie den Schlitten unter dem Mikroskop beobachten, rühren Sie ihn sanft auf, um Überlappungen der Würmer zu vermeiden.Dann bedecken Sie den Tropfen des Montagemediums auf dem Agarose-Pad mit einem 18 mal 18 Millimeter-Deckel. Um lebende Würmer zu montieren, löst sich Pipette drei bis vier Mikroliter von drei Millimolar-Levamisol in M9 auf ein Agarose-Pad. Wählen Sie 30 bis 50 Würmer pro Zustand in den Tropfen Levamisol.Dann bedecken Sie den Tropfen mit einem 18 mal 18 Millimeter-Coverslip und bedecken Sie die Würmer innerhalb einer Stunde. Installieren Sie das Open-Source-Image-Analyse-Softwarepaket Fiji von ImageJ, oder wenn es bereits auf dem Computer installiert ist, überprüfen Sie, ob es Version 1.52A oder höher ist, laden Sie dann das Worm-Align-Repository von GitHub herunter und speichern Es auf dem Computer. Sobald alle Pipeline-Komponenten heruntergeladen und installiert wurden, öffnen Sie Fidschi und führen Sie das Worm-Align-Makro aus, indem Sie auf Plugins, Makros klicken und in der Hauptmenüleiste ausgeführt werden.Suchen Sie die Wurmausrichtung. ijm-Skript und klicken Sie auf öffnen. Navigieren Sie zum Eingabeordner mit den zu analysierenden Bildern, und klicken Sie auf Auswählen, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Ordner nur Bilddateien enthält.Das Makro generiert automatisch einen Ausgabeordner, in dem alle Ergebnisse gespeichert werden. Der Name des Ordners entspricht dem Eingabeordner mit der Ausgabe als Post-Fix. Erlauben Sie dem Makro, das erste Bild im Eingabeordner zu öffnen, und verwenden Sie es als repräsentatives Bild, um die Einstellungen zu extrahieren, die zum Generieren der Montage erforderlich sind, einschließlich der Breite der Würmer, der Helligkeit und des Kontrasts.Zeichnen Sie mit dem geraden Zeichenwerkzeug eine Linie über die Breite eines Wurms, und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie die Länge dieser Linie, um die Höhe der zugeschnittenen Bereiche für einzelne Würmer zu bestimmen. Geben Sie für jeden Kanal den Namen, die Nachsuchtabelle und ob er in die Montage einbezogen werden soll, und klicken Sie dann auf OK. Passen Sie als Nächstes die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen für die Kanäle mit den Schiebereglern an. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Kanäle.Sobald alle Einstellungen konfiguriert sind, werden sie in einer Einstellungstabelle aufgezeichnet und im CellProfiler-Unterordner des Ausgabeordners gespeichert. Ein Bild wird generiert, um zu zeigen, wie alle Bilder nach der Anwendung der Einstellungen aussehen. Wenn das Bild zufriedenstellend ist, kreuzen Sie das obere Kästchen an.Das zweite und dritte Kästchen des Kontrollkästchens alle Einstellungen geben die Optionen für die Montagegenerierung an. Lassen Sie beide Kästchen angekreuzt, und klicken Sie auf OK, um den Rest des Makros auszuführen. Wenn Sie das obere Kästchen nicht ankreuzen, führt das Makro dazu, dass das Setup erneut ausgeführt wird.Das Makro öffnet dann alle Bilder im Eingabeordner. Zeichnen Sie für jedes Bild Linien auf der Längsachse aller Würmer, die mit dem segmentierten oder dem Freihandlinienwerkzeug in die Montage einbezogen werden sollen. Zeichnen Sie Linien konsistent von Kopf zu Schwanz oder umgekehrt entlang der gesamten Länge der Würmer und fügen Sie jede Linie zum ROI-Manager hinzu, indem Sie auf Control T klicken. Sobald alle gewünschten Würmer hinzugefügt wurden, klicken Sie auf OK. Worm-align generiert dann zugeschnittene Bilder einzelner ausgewählter Würmer, die im einzelnen Wurmunterordner des Ausgabeordners gespeichert werden.Montagen aller ausgewählten Würmer werden im ausgerichteten Ordner gespeichert. Laden Sie CellProfiler 2.2.0 herunter und installieren Sie es, indem Sie auf den Link für frühere CellProfiler-Versionen auf der Download-Seite klicken und das gewünschte Betriebssystem auswählen. Stellen Sie vor dem Starten der Worm_CP Pipeline sicher, dass alle erwarteten Ausgabebilder im CellProfiler-Unterordner des Wurm-Align-Ausgabeordners vorhanden sind.Eine verarbeitete Kopie des Originalbildes, eine binäre Bildmaske der Wurmpopulation, ausrichten Maske, wenn die Linie auf ausgewählten Würmern gezeichnet wird und ein Bild, das jeden der Kanäle im Originalbild darstellt, vorhanden sein sollte. Öffnen Sie CellProfiler, klicken Sie dann auf das Bildeingabemodul und ziehen Sie den CellProfiler-Modulordner in das Fenster, das hier Drop-Dateien und Ordner angibt. Wenn eine Liste von Bildern aus einer früheren Analyse vorhanden ist, entfernen Sie diese zuerst, indem Sie mit der rechten Maustaste in das Fenster klicken und die Dateiliste löschen.Klicken Sie auf das Metadateneingabemodul und auf die zweite Extraktionsmethode, klicken Sie auf den gelben Ordner und navigieren Sie zum CellProfiler-Unterordner des Worm-Align-Ausgabeordners. Wählen Sie die Einstellungsdatei aus, und klicken Sie dann auf Aktualisieren. Klicken Sie als Nächstes auf das Eingabemodul für Namen und Typen, und stellen Sie sicher, dass alle für die Pipeline erforderlichen Bilder vorhanden sind.Wählen Sie vor dem Ausführen der Pipeline ein Ziel für die Ausgabeergebnisse im Ausgabemodul aus. Verwenden Sie den Testmodus, um zu sehen, wie die Pipeline funktioniert, indem Sie auf den Testmodus starten klicken und es zulassen, dass sie durch das erste Bild im Ordner ausgeführt wird. Wenn Sie mit der Leistung der Pipeline zufrieden sind, klicken Sie auf Testmodus beenden und Bilder analysieren.Stellen Sie vor Beginn der Analyse sicher, dass alle Augen vor dem Analysemodul geschlossen sind. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, öffnen Sie den Worm_CP Ausgabeordner, der aus zwei CSV-Dateien, Würmern CSV und Zeilen CSV besteht. Die Kultivierung und Abbildung von C.elegans nach der in diesem Protokoll beschriebenen Methode erzeugt große Übersichtsbilder von Wurmpopulationen.Die Ausgabe der Pipeline hängt weitgehend von der Qualität der Linien ab, die über den Bildern gezeichnet werden. Hier werden mehrere Linienbeispiele und deren Ausgabe aus Worm-align gezeigt. Bei Verwendung des Worm-Align-Skripts ist eine visuelle Identifizierung von sich schneidenden Würmern aus den Overlay-Bildern im Datenunterordner sowie aus den Panels einzelner Würmer in der Montage möglich.Die QC-Tabelle kann auch verwendet werden, um überlappende Würmer zu identifizieren. Das Schneiden von Leitungen ist jedoch für die Worm_CP Pipeline problematisch. Dies liegt daran, dass Worm_CP Linienmaske und nicht Interessenbereiche verwendet, um einzelne Würmer zu identifizieren.Daher segmentieren CellProfiler einen der Würmer als zwei Objekte. Die Worm_CP-Pipeline wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von festen Tieren zu quantifizieren, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet sind, der in Lipidtröpfchen einbaut. Der Fetttröpfchengehalt wird durch manuelle Quantifizierung um 17 % zwischen Wildtyp und mutierten DBL1-Tieren und mit hilfe der Worm_CP-Pipeline um 12 % verringert.Worm_CP wurde auch verwendet, um die Hitzeschock-Reaktion bei lebenden Würmern zu quantifizieren, die GFP unter Kontrolle eines hitzeschockinduzierbaren Gens ausdrücken. In Ermangelung von Hitzestress induzierten die Würmer keine GFP-Expression. Wenn die Würmer als kurzer Hitzeschock ausgesetzt werden, wird die GFP-Expression induziert.Die Ausgabe von Worm_CP hängt weitgehend von der Qualität der Linien ab, die Sie mit Worm-Align zeichnen. Stellen Sie sicher, dass sich Ihre Linien nicht berühren oder überlappen, und zeichnen Sie alle Linien in die gleiche Richtung. Wenn Sie die QC-Tabelle überprüfen, können Sie Linien identifizieren, die sich berühren oder überlappen, sodass Sie diese Fälle aus der Analyse ausschließen können.Die Ausgabe von Worm-align kann für die nachfolgende Quantifizierung entweder in Fidschi oder in anderen Bildanalyse-Softwarepaketen verwendet werden. Wir haben hier eine sehr einfache CellProfiler-Pipeline gezeigt, in die sehr einfach andere Analysemodule integriert werden könnten, um beispielsweise die Anzahl der Lipidtröpfchen zu zählen oder die Intensität einzelner Tröpfchen innerhalb eines Wurms zu quantifizieren. Einer der Vorteile dieser Technik ist die Möglichkeit, die Fluoreszenz von einzelnen Würmern schnell zu quantifizieren.In unserem Labor haben wir ein Interesse an individueller Lebensfähigkeit mit Fluoreszenzreportern und verwenden dafür routinemäßig Wurm-Align- und Worm_CP.

Research

JoVE Journal

Biology

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