Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

ברצוננו להודות לד"ר כריסטיאן לנקוט ב- BIOCEV (פראג, צ'כיה) שלימד אותנו את טכניקת מיקרופיפטית הפה להרכיב תולעים קבועות וד"ר פטימה סנטוס וד"ר דבי דראג על שיתוף הגדרת בטיחות על מיקרופיגט הפה. אנו מודים גם לפרנססקה הודג' על עריכת כתב היד, שרלין מרדוק ומתקני מכון ביברהאם על תמיכתם. OC נתמך על-ידי ERC 638426 ו- BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יישור תולעים הוא צינור עיבוד תמונה מבוסס FIJI שיוצר בקלות מונטאז'ים של תולעים שנבחרו על-ידי המשתמש, שבהם תולעים מיושרות ומיושרות כדי לסייע בהשוואה חזותית, סיווג וייצוג. למרות תכונה זו מוצעת גם על ידי כמה כלים קיימים, במיוחד מודול WormToolbox ב CellProfiler7, תולעת ליישר דורש יחסית מעט ניסיון ניתוח תמונה קודמת: משתמשים צריכים רק לעקוב אחר תולעים אלה הם רוצים לבחור עבור montage (וניתוח). למרות שמעקב אחר התולעים על נתוני התמונה הגולמית הוא תהליך קל - במיוחד כאשר מחשב או טאבלט עם מסך מגע זמין - הוא בעל חשיבות עליונה, כי קווים מצוירים כראוי לאורך הציר האורך של התולעים. קווים לא שלמים, הבאים רק חלק מהתולעת, יגרמו לתולעים חלקיות במונטאז' (כלומר, תולעים חסרות ראשי קצוות זנב) ומסכות פילוח חלקיות במהלך ניתוח CellProfiler. כמו כן, אם קווים משתי תולעים בודדות חוצים, התולעים לא יעובדו כראוי במונטאז' יישור התולעת, כמו גם לכימות פלואורסצנטי. לבקרת איכות נשמרת תמונת שכבת-על של בחירות הקו בתמונה המקורית, יחד עם טבלת QC. מתוך אלה, קווים בעייתיים שיובילו לתולעים מפולחים באופן שגוי ניתן לזהות בקלות ולא לכלול מונטאז ' ו / או ניתוח עוקב.
למרות שהקלט הישיר של הניסוי בבחירת התולעים אולי נראה קצת גוזל זמן, הוא מציג יתרון ברור של זרימת העבודה על פני אחרים בניסויים שבהם תולעים בשלבים התפתחותיים שונים נמצאות באותה תמונה: תולעים ניתן לבחור במהלך "צעד המעקב", על ידי מתאר רק את התולעים כי הם בשלב ההתפתחותי הנכון. לחלופין, ניתן לסנן תולעים באמצעות הפלט מ- Worm_CP בהתבסס על אורך קו העקיבה, או על שטח מסיכת הפילוח, שניהם אינדיקטורים אמינים לאורך/גודל התולעים. ניתן לטעון כי אלגוריתמים של למידת מכונה עשויים להיאבק לזהות תולעים בשלבים התפתחותיים שונים, שכן גודלם ומראהם בתמונות DIC כל כך שונים.
הפלט של ליישר תולעת יכול לשמש לכימות הבא של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, או בפיג'י ישירות, או בפלטפורמות אחרות של תוכנה לניתוח תמונה. הדגמנו זאת על ידי ייבוא פלט יישור התולעת לצינור CellProfiler (Worm_CP), המאפשר כימות של עוצמת פלואורסצנטיות רב-ערוצית באותן תולעים בודדות שנבחרו בעת הפעלת צינור יישור התולעת. בחרנו בגישה זו בגלל הגמישות של תוכנת CellProfiler: זה פשוט לשלב מודולים נוספים לתוך הצינור כדי לנתח תכונות נוספות בתולעים בודדות (למשל מדידת הגודל של טיפות השומנים, או גרגירי מתח, גרעינים, מיטוכונדריה). בנוסף, מסכות התולעת הבודדות עשויות לשמש לאמן דגם חדש עבור WormToolbox7.
היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי הוא מהיר ודורש התקנה פשוטה הרכבה תולעת. שיטה זו מהירה יותר מכיוון שהיא אינה דורשת השקעת זמן בלמידת פעולת תוכנה או הפעלת ערכות הדרכה באמצעות אלגוריתםמכונה 7. יתר על כן, שיטה זו פועלת עם תולעים חיות או קבועות פשוט רכוב על רפידות אגרוז רגילות. אין צורך להשתמש בתאים מיקרופלואידיים מורכבים, כפי שפותחו בשיטות אחרות5,6.

אורגניזם פשוט יחסית, nematode C. elegans, היא מערכת מודל שימושי מאוד לחקר מחלות אנושיות. כ -38% מהגנים בגנום C. elegans יש עמיתים פונקציונליים בבני אדם1,2. אחד המאפיינים הייחודיים של C. elegans הוא שהוא שקוף אופטית, ומאפשר גישה קלה למידע in vivo לגבי (תת) ביטוי תאי של כתבים פלואורסצנטיים על פני רקמות. זה עושה C. elegans אורגניזם מודל הממשלה עבור מסכי תוכן גבוה באמצעות פלטפורמות מבוססות תמונה3. עם זאת, נושא אחד שלעתים קרובות מסבך מחקרים אלה הוא שכאשר מדמיינים אוכלוסיות צפופות של תולעים, הם נוטים לחצות ולהתקבץ, מה שהופך את ההשוואות בין תולעים בודדות למאתגרות, ומערפל ניתוח תמונה לכימות במורד הזרם.
פתרונות קיימים המתגברים על בעיה זו מסתמכים בדרך כלל על אופטימיזציה של פרוטוקול culturing והדמיה, כגון באמצעות שימוש במיקרו-נוזליםהגדרות 4, המאפשר תולעים בודדות להיתפס בתמונותנפרדות 5,6. אחרים יישמו אלגוריתמים של למידת מכונה המאפשרים הכרה בתולעים בודדות, אפילו באוכלוסייה מגושמת. דוגמה מצוינת של האחרון הוא WormToolbox, שהוא הרחבה מודולרית של פלטפורמת ניתוח תמונה קוד פתוח, CellProfiler7. WormToolbox מציעה תפוקה גבוהה ופתרון תוכן גבוה לניתוח של C. elegans, וברור היתרונות של הכללתו CellProfiler, כמו מודולי ניתוח נוספים ניתן לכלול בקלות. למרות WormToolbox מגיע מסופק עם מודל מאומן מראש (ברירת מחדלWormModel.xml), הסבה של אלגוריתם למידת מכונה נדרש בדרך כלל עבור כל יישום חדש. הדרכות מקוונות על איך לעשות את זה זמינים על Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). למרות זאת, התקנה ושימוש WormToolbox דורש השקעת זמן משמעותית עבור משתמשים טירון.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני בזמן לתרבות, ואוכלוסיות תדמיתיות של C. elegans. כדי לאפשר הערכה של תולעים בודדות בתמונות שנרכשו פיתחנו זרימת עבודה פשוטה מבוססת פיג'י בקוד פתוח, בשם Worm-align. ניתן להשתמש ליישור תולעים כדי ליצור מונטאז'ים חד-ערוציים או רב-ערוציים של תולעים מיושרות ומיושרות. ראשית, על המשתמש לבחור באופן ידני תולעים בודדות לניתוח על-ידי ציור קו מהראש לזנב. יישור תולעים ישתמש בבחירה זו כדי לחתוך תולעים נבחרות מתמונת הסקירה, וליצור מונטאז' שבו תולעים נבחרות מיושרות ומיושרות כדי להקל על השוואה חזותית והצגה.
בנוסף, ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכימות עתידי של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, ישירות ב- FIJI, או בפלטפורמות תוכנה אחרות לניתוח תמונה. אנו מדגימים זאת על-ידי ייבוא פלט יישור התולעת Worm_CP, צינור המשתמש בתוכנת CellProfiler בקוד פתוח. הגמישות של CellProfiler מאפשרת שילוב של מודולים נוספים להקרנת תוכן גבוה. השתמשנו בצינור Worm_CP כדי לכמת את תגובת הלם החום, מנגנון הגנה שמור היטב כי refolds חלבונים כי הם misfolded עקב לחצים כגון טמפרטורהגבוהה 8. באופן ספציפי, יישנו את הצינור על תולעים הנושאות טרנסג'ין מרובה עותקים משולב, שבו המקדם של גן בלתי ניתן לחיסון הלם חום, hsp-70(C12C8.1), כוננים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)9. השתמשנו גם בצינור Worm_CP על בעלי חיים קבועים שתויגו בצבע פלואורסצנטי המדמיין טיפות שומנים (LDs), איבר אחסון השומן העיקרי ב C. elegans10. בעוד שלזרימת עבודה זו אין את התפוקה המוצעת על ידי WormToolBox, היא אלטרנטיבה ידידותית למשתמש ופשוטה להצגה חזותית וניתוח של ניסויים מבוססי תמונה C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

בעיה נתקלת לעתים קרובות בעת רכישת נתוני תמונה מ C. elegans קבוע או הרדמה היא כי תולעים לחצות אשכול עם שכניהם. בעיה זו מחמירה עם צפיפות הולכת וגדלה של תולעים ויוצרת אתגרים להדמיה וכימות. פיתחנו זרימת עבודה מבוססת FIJI, Worm-align, שניתן להשתמש בה כדי ליצור מונטאז'ים חד-ערוציים או רב-ערוציים של תולעים שנבחרו על-ידי המשתמש, מיושרות ומיושרות מנתוני תמונה גולמיים של C. elegans. יישור תולעים הוא זרימת עבודה פשוטה וידידותית למשתמש שאינה דורשת הכשרה מוקדמת של המשתמש או של אלגוריתם הניתוח. מונטאז'ים הנוצרים עם יישור תולעת יכולים לסייע בבדיקה החזותית של תולעים, בסיווגן ובייצוגן. בנוסף, ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכימות עתידי של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, ישירות ב- FIJI, או בפלטפורמות תוכנה אחרות לניתוח תמונה. אנו מדגימים זאת על-ידי ייבוא פלט יישור התולעת Worm_CP, צינור המשתמש בתוכנת CellProfiler בקוד פתוח. הגמישות של CellProfiler מאפשרת שילוב של מודולים נוספים להקרנת תוכן גבוה. כדוגמה מעשית, השתמשנו בצינור על שתי ערכות נתונים: ערכת הנתונים הראשונה היא תמונות של תולעי כתב הלם חום המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של המקדם של הלם חום בלתי ניתן לריפוי hsp-70, ואת ערכת הנתונים השנייה הם תמונות המתקבלות תולעים קבועות, מוכתם עבור מאגרי שומן עם צבע פלואורסצנטי.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP היא זרימת עבודה פשוטה FIJI /CellProfiler שניתן להשתמש בה כדי ליישר וליישר דגימות אלגנס Caenorhabditis ולהבקיע תותלעת שלמה מבוססת תמונה assays ללא צורך בשלבי אימון קודמים. יישמו תולעת ליישר / Worm_CP לכימות של ביטוי הנגרמת הלם חום בבעלי חיים חיים או טיפות השומנים בדגימות קבועות.

ליישר תולעת Worm_CP, שני צינורות קוד פתוח ליישור וכימות של נתוני תמונה פלואורסצנטיים המתקבלים מ- Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

אנו מתארים כאן זרימת עבודה פשוטה מבוססת פיג'י opensource בשם תולעת ליישר, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור מונטאז'ים בודדים או רב ערוציים של תולעים מיושר עניין מתמונות מיקרוסקופיות גלם. מכיוון שזרימת עבודה זו מסתמכת על בעלי חיים נבחרים של משתמשים בעלי עניין, היא עשויה להיות שימושית במיוחד בעת ניתוח תמונות מ- C.elegans שבהן התולעים אינן כולן בשלב או במצב הנכון. יש לציין כי הפלט של תולעת ליישר יכול לשמש לכימות הבאים של פלואורסצנטיות עם פיג'י או תוכנה אחרת לניתוח תמונה.כאן אנו מדגימים כימות פלואורסצנטיות באמצעות צינור CellProfiler Worm_CP. בגין על ידי יצירת מיקרופייפאט פה על ידי הרחבת נימי זכוכית דק בלהבה של מבער בונזן. לאחר הארכה בלהבה, לשבור את נימי לשני חלקים אם זה לא לשבור לשני חלקים לאחר הארכה.אם זה פרץ לשתי חתיכות, לחתוך את הסוף של הארוך ביותר. בחר את החתיכה הארוכה יותר ובדוק אם נימי פתוח על ידי ניסיון לשאפת מים. נתק את המתאם מצינור סיליקון באורך 3 מ"מ.חבר את נימי הזכוכית למתאם נימי המקושר לצינור סיליקון באורך שישה מילימטרים. ואז לחבר את הקצה השני של צינור שישה מילימטר לתוך מסנן 0.2 מיקרומטר וצינור סיליקון שלושה מילימטר בקצה השני שלה. חבר קצה מסנן מילימטר אחד לקצה החופשי של צינור הסיליקון שלושה מילימטר כדי לשאוף נוזל.תחת מיקרוסקופ ניתוח, להסיר נוזלים רבים ככל האפשר סביב גלולה של תולעים קבועות עם micropipette הפה. הוסף במהירות 10 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לתחתית הצינור. יש לשטוף קצה של 10 מיקרוליטר ב-PBS עם עקבות של חומר ניקוי כדי למנוע מתולעים להידבק לצדדים של קצה פיפטה מפלסטיק.ואז לחתוך את הקצה של הקצה עם זוג מספריים. מעבירים שמונה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה עם התולעים על משטח אגרוז שהוכן בעבר. תוך כדי התבוננות בשקופית מתחת למיקרוסקופ, התסיסו אותה בעדינות כדי למנוע חפיפה של התולעים.ואז לכסות את טיפת מדיום הרכבה על כרית אגרוז עם כיסוי 18 על 18 מילימטר. כדי לעלות על תולעים חיות, פיפטה שלושה עד ארבעה מיקרוליטרים של שלושה levamisole מילימולרי נמס M9 על כרית אגרוז. בחר 30 עד 50 תולעים לכל תנאי לתוך טיפת levamisole.לאחר מכן לכסות את הירידה עם כיסוי 18 על 18 מילימטר ותמונה התולעים בתוך שעה אחת. התקן את חבילת התוכנה לניתוח תמונות קוד פתוח פיג'י מ- ImageJ, או אם היא כבר מותקנת במחשב, ודא שגירסה 1.52A או גירסה מתקדמת יותר, ולאחר מכן הורד את המאגר ליישור תולעים מ- GitHub ושמור אותו במחשב. לאחר שכל רכיבי הצינור הורדו והותקנו, פתח את פיג'י והפעל את המאקרו יישור התולעת על-ידי לחיצה על תוספים, פקודות מאקרו והפעלה שורת התפריטים הראשית.אתר את יישור התולעת. ijm סקריפט ולחץ על פתוח. נווט אל תיקיית הקלט עם התמונות שיש לנתח ולחץ על בחר, ודא שהתיקיה שנבחרה מכילה קבצי תמונה בלבד.המאקרו ייצור באופן אוטומטי תיקיית פלט שבה יישמרו כל התוצאות. שם התיקיה יהיה זהה לתיקיית הקלט עם פלט כמו לאחר התיקון. אפשר למאקרו לפתוח את התמונה הראשונה תיקיית הקלט ולהשתמש בה כתמונה מייצגת כדי לחלץ את ההגדרות הדרושות ליצירת המונטאז', כולל רוחב התולעים, הבהירות והניגודיות.באמצעות כלי ציור הקו הישר, צייר קו לרוחב תולעת ולחץ על אישור. השתמש באורך שורה זו כדי לקבוע את גובה האזורים החתוכים עבור תולעים בודדות. עבור כל ערוץ, ציין את השם, טבלת בדיקת המידע ואם יש לכלול אותו במונטאז', ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, התאימו את הגדרות הבהירות והניגודיות של הערוצים בעזרת המחוונים. חזור על תהליך זה עבור הערוצים הנותרים.לאחר שתצורת כל ההגדרות נקבעה, הן יוקלטו בטבלת הגדרות ויישמרו בתיקיה המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט. תמונה נוצרת כדי להראות איך ייראו כל התמונות לאחר יישום ההגדרות. אם התמונה משביעת רצון, סמן את התיבה העליונה.התיבה השנייה והשלישית של החלונית 'בדוק את כל ההגדרות' מציינות את האפשרויות לדור מונטאז'. השאר את שתי התיבות מסומנות ולחץ על אישור כדי לבצע את שאר המאקרו. כשל בניג המותר העליון יגרום למאקרו להתנין מחדש את תוכנית ההתקנה.לאחר מכן המאקרו ממשיך לפתוח את כל התמונות תיקיית הקלט. עבור כל תמונה, צייר קווים על ציר האורך של כל התולעים שייכללו במונטאז' באמצעות כלי הקו מקולח או חופשי. צייר קווים באופן עקבי מכף יד לזנב או להיפך לאורך המלא של התולעים והוסף כל שורה למנהל החזר ההשקעות על-ידי לחיצה על Control T.Once שנוספו כל התולעים הרצויות, לחץ על אישור. לאחר מכן, יישור תולעים ייצור תמונות חתוכה של תולעים בודדות שנבחרו, אשר יישמרו בתת-תיקיית התולעת הבודדת של תיקיית הפלט.מונטאז'ים של כל התולעים שנבחרו יישמרו בתיקיה המיושרת. הורד והתקן את CellProfiler 2.2.0 על-ידי לחיצה על הקישור עבור מהדורות CellProfiler קודמות בדף ההורדה ובחירת מערכת ההפעלה הדרושה. לפני הפעלת Worm_CP, ודא שכל תמונות הפלט הצפויות נמצאות בתיקיות המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט יישור תולעת.עותק מעובד של התמונה המקורית, מסיכת תמונה בינארית של אוכלוסיית התולעים, יישור מסיכה אם הקו מצויר על תולעים נבחרות ותמונה אחת המייצגת כל אחד מהערוצים בתמונה המקורית צריכה להיות נוכחת. פתח את CellProfiler ולאחר מכן לחץ על מודול קלט התמונות וגרור את תיקיית מודול CellProfiler לתוך החלון שאומר שחרר קבצים ותיקיות כאן. אם רשימת תמונות קיימת מניתוח קודם, הסר אותן תחילה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון ובחירה באפשרות נקה רשימת קבצים.לחץ על מודול קלט מטה-נתונים ועל שיטת החילוץ השנייה, לחץ על התיקייה הצהובה ונווט אל תיקיית המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט יישור תולעת. בחר את קובץ ההגדרות ולאחר מכן לחץ על עדכן. לאחר מכן, לחץ על השמות והסוגים של מודול הקלט וודא שכל התמונות הדרושות עבור הצבר קיימות.לפני הפעלת הצבר, בחר יעד עבור תוצאות הפלט במודול הפלט. השתמש במצב הבדיקה כדי לראות את הביצועים של הצבר על-ידי לחיצה על הפעל מצב בדיקה ואפשר לו לעבור על התמונה הראשונה בתיקיה. כאשר אתה מרוצה מביצועי הצבר, לחץ על צא ממצב בדיקה ונתח תמונות.לפני תחילת הניתוח, ודא שכל העיניים מול מודול הניתוח סגורות. לאחר השלמת הניתוח, פתח את תיקיית Worm_CP המורכבת משני קבצי CSV, תולעים CSV וקווים CSV. Culturing והדמיה C.elegans על פי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת תמונות סקירה גדולות של אוכלוסיות תולעים.הפלט של הצינור תלוי במידה רבה באיכות הקווים שצוירו על גבי התמונות. מספר דוגמאות שורה והפלט שלהן מישור תולעת מוצגים כאן. בעת שימוש בתסריט יישור תולעת, זיהוי חזותי של תולעים מצטלבים אפשרי מתמונות שכבת-על שנמצאו בתת-תיקיית הנתונים, כמו גם מהלוחות של תולעים בודדות במונטאז'.ניתן להשתמש בטבלת QC גם לזיהוי תולעים חופפות. עם זאת, קווים מצטלבים הם בעייתיים עבור Worm_CP הצינור. הסיבה לכך היא Worm_CP משתמש במסכת קו, לא באזורים מעניינים, כדי לסייע בזיהוי תולעים בודדות.לכן, CellProfiler יקטע את אחת התולעים כשני אובייקטים. צינור Worm_CP שימש לכימות עוצמת פלואורסצנטיות מבעלי חיים קבועים המסומנים בצבע פלואורסצנטי המשלב טיפות שומנים. תוכן טיפת השומנים יורד ב-17% בין סוג הבר לבין בעלי חיים מוטנטים מסוג DBL1 באמצעות כימות ידני, וב-12% באמצעות Worm_CP הדם.Worm_CP שימש גם לכימות תגובת הלם החום בתולעים חיות המבטאת GFP תחת שליטה של גן בלתי ניתן לריפוי הלם חום. בהיעדר עומס חום, התולעים לא גרמו לביטוי GFP. כאשר התולעים נחשפות כהלם חום קצר, ביטוי GFP הוא המושרה.הפלט של Worm_CP תלוי במידה רבה באיכות הקווים שאתה מצייר באמצעות יישור תולעת. ודא שהקווים שלך אינם נוגעים או חופפים וצייר את כל הקווים באותו כיוון. בדיקת טבלת QC יכולה לסייע לך לזהות קווים נוגעים ללב או חופפים כדי שתוכל לא לכלול אירועים אלה בניתוח שלך.ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכמות עוקב בפיג'י או בחבילות תוכנה אחרות לניתוח תמונות. הראינו כאן צינור CellProfiler בסיסי מאוד שלתוכו מודולי ניתוח אחרים יכולים בקלות רבה להיות משולבים, למשל, כדי לספור את מספר טיפות השומנים או לכמת את עוצמת טיפות בודדות בתוך תולעת. אחד היתרונות של טכניקה זו היא אפשרות לכמת פלואורסצנטיות מתולעים בודדות במהירות.במעבדה שלנו, יש לנו עניין בכדאיות אישית באמצעות כתבי פלואורסצנטיות ואנחנו משתמשים בתולעת ליישר Worm_CP באופן שגרתי למטרה זו.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...