Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Ringraziamo il Dott. Christian Lanctôt di BIOCEV (Praga, Repubblica Ceca) per averci insegnato la tecnica della micropipetta della bocca per montare vermi fissi e la dott.ssa Fatima Santos e la dott.ssa Debbie Drage per aver condiviso la configurazione di sicurezza sulla micropipetta della bocca. Ringraziamo anche Francesca Hodge per aver modificato il manoscritto, Sharlene Murdoch e Babraham Institute Facilities per il loro supporto. OC è supportato da ERC 638426 e BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Worm-align è una pipeline di elaborazione delle immagini basata su FIJI che genera prontamente montaggi di worm selezionati dall'utente, in cui i worm vengono raddrizzata e allineati per aiutare il confronto visivo, la classificazione e la rappresentazione. Sebbene questa funzionalità sia offerta anche da alcuni strumenti esistenti, in particolare il modulo WormToolbox in CellProfiler7, Worm-align richiede relativamente poca esperienza di analisi delle immagini precedenti: gli utenti devono solo rintracciare quei worm che vorrebbero selezionare per il montaggio (e l'analisi). Sebbene rintracciare i worm sui dati dell'immagine non elaborata sia un processo semplice, in particolare quando è disponibile un computer touch-screen o un tablet, è fondamentale che le linee siano disegnate correttamente lungo l'asse longitudinale dei worm. Le linee incomplete, che seguono solo una parte del worm, si tradurranno in worm parziali nel montaggio (ad esempio, worm mancanti teste di estremità della coda) e maschere di segmentazione parziale durante l'analisi di CellProfiler. Inoltre, se le linee di due singoli vermi si incrociano, i vermi non verranno elaborati correttamente nel montaggio di allineamento del verme e per la quantificazione della fluorescenza. Per il controllo qualità un'immagine sovrapposta delle selezioni di riga sull'immagine originale viene salvata nella cartella dati, insieme a una tabella QC. Da questi, le linee problematiche che porteranno a vermi segmentati in modo errato possono essere facilmente identificate ed escluse dal montaggio e / o dall'analisi successiva.
Sebbene l'input diretto dello sperimentatore nella selezione dei worm sembri forse un po 'dispendioso in termini di tempo, presenta un chiaro vantaggio del flusso di lavoro rispetto ad altri in esperimenti in cui worm provenienti da diversi stadi di sviluppo sono presenti nella stessa immagine: i worm possono essere selezionati durante la "fase di tracciamento", delineando solo quei worm che si trovano nella giusta fase di sviluppo. In alternativa, i worm possono essere filtrati utilizzando l'output di Worm_CP in base alla lunghezza della linea di tracciatura o all'area della maschera di segmentazione, entrambi indicatori affidabili della lunghezza/dimensione dei worm. Probabilmente, gli algoritmi di apprendimento automatico possono avere difficoltà a riconoscere i worm da diverse fasi di sviluppo, poiché le loro dimensioni e il loro aspetto nelle immagini DIC sono così diversi.
L'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo abbiamo dimostrato importando l'output di worm-align in una semplice pipeline cellprofiler (Worm_CP), che consente la quantificazione dell'intensità di fluorescenza multicanale nei singoli worm selezionati durante l'esecuzione della pipeline di allineamento worm. Abbiamo scelto questo approccio grazie alla flessibilità del software CellProfiler: è semplice incorporare moduli aggiuntivi nella pipeline per analizzare funzionalità aggiuntive nei singoli worm (ad esempio misurando le dimensioni delle goccioline lipidiche o granuli di stress, nuclei, mitocondri). Inoltre, le singole maschere worm potrebbero potenzialmente essere utilizzate per addestrare un nuovo modello per WormToolbox7.
I principali vantaggi di questo metodo sono che è veloce e richiede un semplice set-up di montaggio worm. Questo metodo è più veloce in quanto non richiede di dedicare tempo all'apprendimento del software, né all'esecuzione di set di training tramite un algoritmodi computer 7. Inoltre, questo metodo funziona con vermi vivi o fissi semplicemente montati su normali cuscinetti di agarosio. Non è necessario utilizzare camere microfluidiche complesse, come sviluppato in altri metodi5,6.

Un organismo relativamente semplice, il nematode C. elegans, è un sistema modello estremamente utile per lo studio delle malattie umane. Circa il 38% dei geni nel genoma di C. elegans ha controparti funzionali nell'uomo1,2. Una delle caratteristiche uniche di C. elegans è che è otticamente trasparente, consentendo un facile accesso alle informazioni in vivo riguardanti l'espressione (sub) cellulare dei reporter fluorescenti attraverso i tessuti. Ciò rende C. elegans un organismo modello primario per schermi ad alto contenuto che utilizzano piattaforme basate su immagini3. Tuttavia, un problema che spesso complica questi studi è che quando si imagingno popolazioni dense di vermi, tendono ad attraversare e raggrupparsi, rendendo difficili i confronti tra i singoli worm, offuscando l'analisi e la quantificazione delle immagini a valle.
Le soluzioni esistenti che superano questo problema in genere si basano sull'ottimizzazione del protocollo di coltivazione e imaging, ad esempio attraverso l'utilizzo di configurazioni microli fluidiche4, consentendo l'cattura di singoli worm in immagini separate5,6. Altri hanno applicato algoritmi di machine learning che consentono il riconoscimento di singoli worm, anche in una popolazione grumiata. Un ottimo esempio di quest'ultimo è WormToolbox, che è un'estensione modulare della piattaforma di analisi delle immagini open source CellProfiler7. WormToolbox offre una soluzione ad alta produttività e ad alto contenuto per l'analisi di C. elegans ebeneficia chiaramente della sua inclusione in CellProfiler, in quanto è possibile includere facilmente moduli di analisi aggiuntivi. Sebbene WormToolbox venga fornito con un modello pre-addestrato (DefaultWormModel.xml), il training dell'algoritmo di machine learning è in genere necessario per ogni nuova applicazione. Esercitazioni online su come farlo sono disponibili su Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Nonostante ciò, l'installazione e l'utilizzo di WormToolbox richiede un significativo investimento in termini di tempo per gli utenti alle prime armi.
Qui descriviamo un protocollo semplice ed economico per la cultura e le popolazioni di immagini di C. elegans. Per consentire la valutazione dei singoli worm nelle immagini acquisite abbiamo sviluppato un semplice flusso di lavoro open source basato su FIJI, denominato Worm-align. L'allineamento dei worm può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm raddrizzare e allineati. In primo luogo, l'utente deve selezionare manualmente singoli worm per l'analisi disegnando una linea dalla testa alla coda. L'allineamento dei worm utilizzerà questa selezione per ritagliare i worm selezionati dall'immagine panoramica e generare un montaggio in cui i worm selezionati vengono raddrizzata e allineata per facilitare il confronto visivo e la presentazione.
Inoltre, l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo dimostriamo importando l'output di worm-align in Worm_CP, una pipeline che utilizza il software CellProfiler open source. La flessibilità di CellProfiler consente l'incorporazione di moduli aggiuntivi per lo screening ad alto contenuto. Abbiamo utilizzato la tubazione Worm_CP per quantificare la risposta allo shock termico, un meccanismo protettivo ben conservato che riformuplica le proteine che vengono piegate erroneamente a causa di fattori di stresscome l'altatemperatura 8 . Nello specifico, abbiamo applicato la tubazione ai vermi che trasportano un transgene multi-copia integrato, dove il promotore di un gene indutbile da shock termico, hsp-70(C12C8.1), guida la proteina fluorescente verde (GFP)9. Abbiamo anche utilizzato la pipeline Worm_CP su animali fissi che sono stati etichettati con un colorante fluorescente che visualizza goccioline lipidiche (LDs), il principale organello di conservazione dei grassi in C. elegans10. Sebbene questo flusso di lavoro non abbia la velocità effettiva offerta da WormToolBox, è un'alternativa semplice e intuitiva per la presentazione visiva e l'analisi di esperimenti C. elegans basati su immagini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Un problema che si verifica spesso quando si acquisiscono dati di immagine da C. elegans fissi o anesteti è che i worm si incrociano e si raggruppano con i loro vicini. Questo problema è aggravato dall'aumento della densità dei vermi e crea sfide per l'imaging e la quantificazione. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro basato su FIJI, Worm-align, che può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm selezionati dall'utente, raddrizzati e allineati dai dati delle immagini non elaborati di C. elegans. Worm-align è un flusso di lavoro semplice e intuitivo che non richiede una formazione preliminare né dell'utente né dell'algoritmo di analisi. I montaggi generati con Worm-align possono aiutare l'ispezione visiva dei vermi, la loro classificazione e rappresentazione. Inoltre, l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo dimostriamo importando l'output di worm-align in Worm_CP, una pipeline che utilizza il software CellProfiler open source. La flessibilità di CellProfiler consente l'incorporazione di moduli aggiuntivi per lo screening ad alto contenuto. Come esempio pratico, abbiamo utilizzato la pipeline su due set di dati: il primo set di dati sono immagini di worm reporter shock termici che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) sotto il controllo del promotore di un gene indutbile da shock termico hsp-70e il secondo set di dati sono immagini ottenute da vermi fissi, macchiati per fat-store con un colorante fluorescente.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP è un semplice flusso di lavoro FIJI/CellProfiler che può essere utilizzato per raddrizzare e allineare i campioni di caenorhabditis elegans e per ottenere test basati su immagini worm interi senza la necessità di passaggi di formazione precedenti. Abbiamo applicato worm-align/Worm_CP alla quantificazione dell'espressione indotta da shock termico negli animali vivi o goccioline lipidiche in campioni fissi.

Worm-align e Worm_CP, due pipeline open source per raddrizzare e quantificare i dati delle immagini a fluorescenza ottenuti da Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Descriviamo qui un semplice flusso di lavoro basato su Fiji opensource chiamato Worm-align, che può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm raddrizzati di interesse da immagini di microscopia grezze. Poiché questo flusso di lavoro si basa su animali di interesse selezionati dall'utente, potrebbe essere particolarmente utile quando si analizzano immagini da C.elegans in cui i worm non sono tutti nella fase o condizione corretta. Va notato che l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione della fluorescenza con Fiji o altri software di analisi delle immagini.Qui dimostriamo la quantificazione della fluorescenza utilizzando la pipeline CellProfiler Worm_CP. Inizia creando una micropipetta per la bocca estendendo un sottile capillare di vetro nella fiamma di un bruciatore Bunsen. Dopo l'estensione nella fiamma, rompere il capillare in due pezzi se non si è rotto in due pezzi dopo l'estensione.Se si è rotto in due pezzi, tagliare l'estremità di quello più lungo. Selezionare il pezzo più lungo e verificare se il capillare è aperto tentando di aspirare l'acqua. Staccare l'adattatore da un tubo in silicone da tre millimetri.Collegare il capillare di vetro a un adattatore capillare collegato a un tubo di silicone di sei millimetri. Quindi collegare l'altra estremità del tubo di sei millimetri a un filtro da 0,2 micrometri e un tubo di silicone di tre millimetri sull'altra estremità. Collegare una punta del filtro di un millimetro all'estremità libera del tubo in silicone da tre millimetri per aspirare il liquido.Al microscopio a dissezione, rimuovere il più liquido possibile intorno a un pellet di vermi fissi con la micropipetta della bocca. Aggiungere rapidamente 10 microlitri di mezzo di montaggio sul fondo del tubo. Risciacquare una punta da 10 microliter in PBS con tracce di detergente per evitare che i vermi si attacchino ai lati della punta della pipetta di plastica.Quindi tagliare l'estremità della punta con un paio di forbici. Trasferire otto microlitri di mezzo di montaggio con i vermi su un cuscinetto di agarosio precedentemente preparato. Osservando lo scivolo al microscopio, agitarlo delicatamente per evitare sovrapposizioni dei vermi.Quindi coprire la goccia di mezzo di montaggio sul tampone di agarosio con un coverslip da 18 per 18 millimetri. Per montare vermi vivi, pipetta da tre a quattro microlitri di levamisolo millimolare sciolti in M9 su un cuscinetto di agarosio. Scegli da 30 a 50 vermi per condizione nella goccia di levamisolo.Quindi coprire la goccia con un coverslip di 18 per 18 millimetri e immagini i vermi entro un'ora. Installare il pacchetto software di analisi delle immagini open source Fiji da ImageJ, o se è già installato nel computer, verificare che sia versione 1.52A o successiva, quindi scaricare il repository worm-align da GitHub e salvarlo sul computer. Una volta scaricati e installati tutti i componenti della pipeline, aprire Fiji ed eseguire la macro Di allineamento worm facendo clic su plug-in, macro ed esecuzione nella barra dei menu principale.Individuare l'allineamento del verme. script ijm e fare clic su apri. Passare alla cartella di input con le immagini da analizzare e fare clic su seleziona, assicurandosi che la cartella selezionata contenga solo file di immagine.La macro genererà automaticamente una cartella di output in cui verranno salvati tutti i risultati. Il nome della cartella sarà lo stesso della cartella di input con l'output come post-correzione. Consentire alla macro di aprire la prima immagine nella cartella di input e usarla come immagine rappresentativa per estrarre le impostazioni necessarie per generare il montaggio, inclusa la larghezza dei worm, la luminosità e il contrasto.Utilizzando lo strumento di disegno a linea retta, disegnare una linea sulla larghezza di un worm e fare clic su OK. Utilizzare la lunghezza di questa linea per determinare l'altezza delle aree ritagliate per i singoli worm. Per ogni canale, specificare il nome, la tabella di ricerca e se deve essere inclusa nel montaggio, quindi fare clic su OK. Quindi, regola le impostazioni di luminosità e contrasto per i canali usando i dispositivi di scorrimento. Ripetere questo processo per i canali rimanenti.Una volta configurate tutte le impostazioni, verranno registrate in una tabella delle impostazioni e salvate nella sottocartella CellProfiler della cartella di output. Viene generata un'immagine per mostrare come saranno tutte le immagini dopo l'applicazione delle impostazioni. Se l'immagine è soddisfacente, spuntare la casella superiore.La seconda e la terza casella del pannello seleziona tutte le impostazioni specificano le opzioni per la generazione del montaggio. Lasciare entrambe le caselle selezionate e fare clic su OK per eseguire il resto della macro. Se non si seleziona la casella superiore, la macro verrà rieseguita.La macro procede quindi ad aprire tutte le immagini nella cartella di input. Per ogni immagine, disegnare linee sull'asse longitudinale di tutti i worm da includere nel montaggio utilizzando lo strumento linea segmentata o a mano libera. Disegnare le linee in modo coerente da testa a coda o viceversa lungo l'intera lunghezza dei worm e aggiungere ogni riga al gestore del ROI facendo clic su Controllo T.Una volta aggiunti tutti i worm desiderati, fare clic su OK. L'allineamento del worm genererà quindi immagini ritagliate di singoli worm selezionati, che verranno salvati nella singola sottocartella worm della cartella di output.I montaggi di tutti i worm selezionati verranno salvati nella cartella allineata. Scaricare e installare CellProfiler 2.2.0 facendo clic sul collegamento per le versioni precedenti di CellProfiler nella pagina di download e selezionando il sistema operativo richiesto. Prima di avviare Worm_CP pipeline, assicurarsi che tutte le immagini di output previste siano presenti nella sottocartella CellProfiler della cartella di output di worm-align.Una copia elaborata dell'immagine originale, una maschera immagine binaria della popolazione di worm, allinea la maschera se la linea viene disegnata su worm selezionati e deve essere presente un'immagine che rappresenta ciascuno dei canali nell'immagine originale. Aprire CellProfiler, quindi fare clic sul modulo di input delle immagini e trascinare la cartella del modulo CellProfiler nella finestra in cui sono presenti file e cartelle di rilascio. Se un elenco di immagini è presente da un'analisi precedente, rimuoverle facendo clic con il pulsante destro del mouse nella finestra e selezionando cancella elenco file.Fare clic sul modulo di input dei metadati e sul secondo metodo di estrazione fare clic sulla cartella gialla e passare alla sottocartella CellProfiler della cartella di output Di allineamento worm. Selezionare il file delle impostazioni e quindi fare clic su Aggiorna. Fare quindi clic sul modulo di input nomi e tipi e verificare che siano presenti tutte le immagini necessarie per la pipeline.Prima di eseguire la pipeline, selezionare una destinazione per i risultati dell'output nel modulo di output. Utilizzare la modalità di test per vedere le prestazioni della pipeline facendo clic sulla modalità di test iniziale e consentirgli di eseguire la prima immagine nella cartella. Se soddisfatto delle prestazioni della pipeline, fare clic sulla modalità di test di uscita e analizzare le immagini.Prima di iniziare l'analisi, assicurarsi che tutti gli occhi davanti al modulo di analisi siano chiusi. Al termine dell'analisi, aprire Worm_CP cartella di output costituita da due file CSV, worm CSV e righe CSV. La coltivazione e l'imaging di C.elegans secondo il metodo descritto in questo protocollo produce immagini di grandi dimensioni sulle popolazioni di worm.L'output della pipeline dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate sopra le immagini. Diversi esempi di linee e il loro output da Worm-align sono mostrati qui. Quando si utilizza lo script di allineamento worm, è possibile l'identificazione visiva dei worm intersecati dalle immagini sovrapposte presenti nella sottocartella dei dati, nonché dai pannelli dei singoli worm nel montaggio.La tabella QC può anche essere utilizzata per identificare i worm sovrapposti. Tuttavia, le linee intersecante sono problematiche per la Worm_CP pipeline. Questo perché il Worm_CP la maschera di linea, non le regioni di interesse, per aiutare a identificare i singoli worm.Pertanto, CellProfiler segmenterà uno dei worm come due oggetti. La Worm_CP è stata utilizzata per quantificare l'intensità della fluorescenza da animali fissi etichettati con un colorante fluorescente che incorpora nelle goccioline lipidiche. Il contenuto di goccioline lipidiche è diminuito del 17% tra gli animali di tipo selvatico e mutante DBL1 utilizzando la quantificazione manuale e del 12% utilizzando la pipeline Worm_CP animale.Worm_CP è stato anche usato per quantificare la risposta agli shock termici nei vermi vivi che esprimono la GFP sotto il controllo di un gene inducibile da shock termico. In assenza di stress da calore, i vermi non hanno indotto l'espressione della GFP. Quando i vermi sono esposti come un breve shock termico, viene indotta l'espressione GFP.L'output Worm_CP dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate utilizzando l'allineamento worm. Assicurarsi che le linee non si tocchino o si sovrappongano e disegnare tutte le linee nella stessa direzione. Il controllo della tabella QC consente di identificare le linee che si toccano o si sovrappongono in modo da poter escludere tali casi dall'analisi.L'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione sia nelle Fiji che in altri pacchetti software di analisi delle immagini. Abbiamo mostrato qui una pipeline cellprofiler molto semplice in cui altri moduli di analisi potrebbero essere facilmente incorporati, ad esempio, per contare il numero di goccioline lipidiche o per quantificare l'intensità delle singole goccioline all'interno di un verme. Uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di quantificare rapidamente la fluorescenza dai singoli vermi.Nel nostro laboratorio, abbiamo interesse alla fattibilità individuale utilizzando giornalisti a fluorescenza e usiamo worm-align e Worm_CP abitualmente per questo scopo.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Ricerca

Biologia

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...