Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
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우리는 BIOCEV (프라하, 체코)의 크리스티안 랑코트 박사에게 고정 된 벌레를 장착하는 입 마이크로 파이프 기술을 가르쳐 준 크리스티안 랑토트 박사와 파티마 산토스 박사와 데비 드라게 박사가 입 마이크로 파이프에 안전 설정을 공유한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 지원에 대한 원고, 샬린 머독과 Babraham 연구소 시설을 편집 프란체스카 호지 감사합니다. OC는 ERC 638426 및 BBSRC [BBS/E/B000C0426]에 의해 지원됩니다.

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웜 정렬은 시각적 비교, 분류 및 표현을 돕기 위해 웜을 곧게 펴고 정렬하는 사용자 선택 웜의 몽타주를 쉽게 생성하는 FIJI 기반 이미지 처리 파이프라인입니다. 이 기능은 셀 프로파일러7의웜툴박스 모듈과 같은 일부 기존 도구에도 제공되지만 웜 정렬은 비교적 적은 이전 이미지 분석 경험이 필요합니다. 원시 이미지 데이터의 웜을 추적하는 것은 쉬운 과정이지만 특히 터치 스크린 컴퓨터 또는 태블릿을 사용할 수 있는 경우 해당 선이 웜의 세로 축을 따라 올바르게 그려집니다. 웜의 일부만 따르는 불완전한 선은 CellProfiler 분석 중에 몽타주에 부분 적인 벌레(즉, 꼬리 끝의 머리가 누락된 벌레)와 부분 분할 마스크를 생성합니다. 또한, 두 개의 개별 웜의 선이 교차하는 경우, 웜은 형광 정량화뿐만 아니라 웜 정렬 몽타주에서 올바르게 처리되지 않습니다. 품질 관리를 위해 원본 이미지의 라인 선택 의 오버레이 이미지가 QC 테이블과 함께 데이터 폴더에 저장됩니다. 이러한 것에서 잘못 분할된 웜으로 이어지는 문제가 있는 선은 몽타주 및/또는 후속 분석에서 쉽게 식별하고 제외될 수 있습니다.
벌레의 선택에 있는 실험자의 직접적인 입력은 아마 약간 시간이 소요되는 것처럼 보이지만, 다른 발달 단계의 웜이 동일한 이미지에 존재하는 실험에서 다른 사람들보다 워크플로우의 명확한 이점을 제공합니다: 웜은 올바른 발달 단계에 있는 그 웜만을 요약하여 "추적 단계"동안 선택할 수 있습니다. 또는, 웜은 추적 선의 길이 또는 분할 마스크의 면적에 따라 Worm_CP 출력을 사용하여 필터링할 수 있으며, 둘 다 웜의 길이/크기의 신뢰할 수 있는 지표입니다. 틀림없이, 기계 학습 알고리즘은 DIC 이미지의 크기와 모양이 너무 다르기 때문에 다른 발달 단계에서 웜을 인식하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용할 수 있습니다. 웜 정렬 출력을 웜 정렬 파이프라인을 실행하는 동안 선택한 개별 웜에서 다중 채널 형광 강도의 정량화를 허용하는 간단한 CellProfiler 파이프라인(Worm_CP)으로 가져와 이를 입증했습니다. 우리는 CellProfiler 소프트웨어의 유연성 때문에 이 접근 방식을 선택했습니다: 개별 벌레의 추가 특징을 분석하기 위해 파이프 라인에 추가 모듈을 통합하는 것은 간단합니다 (예 : 지질 방울의 크기 측정, 또는 스트레스 과립, 핵, 미토콘드리아). 또한 단일 웜 마스크는 웜툴박스7에대한 새 모델을 학습하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
이 방법의 주요 장점은 빠르며 간단한 웜 장착 설정이 필요하다는 것입니다. 이 방법은 머신 알고리즘7을통해 소프트웨어 작업을 학습하거나 교육 세트를 실행하는 데 시간을 할애할 필요가 없기 때문에 빠릅니다. 또한 이 방법은 일반 아가로즈 패드에 단순히 장착된 라이브 또는 고정 웜과 함께 작동합니다. 다른 방법으로 개발 된 복잡한 미세 유체 챔버를 사용할 필요가 없습니다5,6.

비교적 간단한 유기체인 선충 C. elegans는인간 질병을 연구하는 데 매우 유용한 모델 시스템입니다. C. elegans 게놈에 있는 유전자의 대략 38%는 인간1,2에있는 기능적인 대응이 있습니다. C. elegans의 독특한 특성 중 하나는 광학적으로 투명하여 조직 전반에 걸쳐 형광 기자의 세포 발현 (sub) 세포 발현에 관한 생체 내 정보에 쉽게 액세스 할 수 있다는 것입니다. 이로 인해 C. elegans는 이미지 기반 플랫폼3을사용하여 고콘텐츠 스크린의 주요 모델 유기체로 만듭니다. 그러나 이러한 연구를 복잡하게 만드는 한 가지 문제는 벌레의 조밀한 집단을 이미징할 때 교차하고 클러스터링하는 경향이 있어 개별 웜을 비교하고 다운스트림 이미지 분석 및 양을 흐리게 한다는 것입니다.
이 문제를 극복하는 기존 솔루션은 일반적으로 마이크로 유체 설정4의사용을 통해 와 같은 배양 및 이미징 프로토콜의 최적화에 의존하여 단일 웜을 별도의 이미지5,6으로캡처할 수 있도록 합니다. 다른 사람들은 집단이 뭉친 집단에서도 단일 웜을 인식할 수 있도록 기계 학습 알고리즘을 적용했습니다. 후자의 훌륭한 예는 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼, CellProfiler7의모듈식 확장인 WormToolbox입니다. WormToolbox는 C. elegans분석을 위한 높은 처리량 및 고함량 솔루션을 제공하며, 추가 분석 모듈을 쉽게 포함할 수 있기 때문에 CellProfiler에 포함된 이점을 명확하게 제공합니다. WormToolbox는 미리 학습된 모델(DefaultWormModel.xml과 함께 제공되지만, 각 새 응용 프로그램에 대해 일반적으로 기계 학습 알고리즘의 재교육이 필요합니다. 이 작업을 수행하는 방법에 대한 온라인 자습서는 Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/)에서 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 WormToolbox를 설치하고 사용하려면 초보자 사용자에게 상당한 시간 투자가 필요합니다.
여기서는 문화에 대한 간단하고 비용 효율적이고 시간 효율적인 프로토콜과 C. elegans의 이미지 모집단을 설명합니다. 획득한 이미지에서 개별 웜을 평가할 수 있도록 웜 정렬이라는 간단한 오픈 소스 FIJI 기반 워크플로우를 개발했습니다. 웜 정렬은 곧게 펴고 정렬된 웜의 단일 채널 또는 다중 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, 사용자는 머리에서 꼬리까지 선을 그려 분석을 위해 개별 웜을 수동으로 선택해야 합니다. 웜 정렬은 이 선택을 사용하여 개요 이미지에서 선택한 웜을 자르고 선택한 웜이 곧게 펴지고 정렬되어 시각적 비교 및 프레젠테이션을 용이하게 하는 몽타주를 생성합니다.
또한, 웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. 웜 정렬 출력을 오픈 소스 CellProfiler 소프트웨어를 사용하는 파이프라인인 Worm_CP 가져옵니다. CellProfiler의 유연성은 고콘텐츠 스크리닝을 위한 추가 모듈을 통합할 수 있게 해줍니다. 우리는 Worm_CP 파이프 라인을 사용하여 열 충격 반응을 정량화하고, 고온8과같은 스트레스로 인해 잘못 접힌 단백질을 재접는 잘 보존 된 보호 메커니즘입니다. 구체적으로, 우리는 열 충격 유도 유전자, hsp-70 (C12C8.1)의 발기인이 녹색 형광 단백질 (GFP)9를구동통합 다중 복사 트랜스진을 운반하는 웜에 파이프 라인을 적용했다. 우리는 또한 지질 물방울 (LDs), C. elegans10의주요 지방 저장 세포기관을 시각화하는 형광 염료로 표시 된 고정 동물에 Worm_CP 파이프 라인을 사용했다. 이 워크플로에는 WormToolBox에서 제공하는 처리량이 없지만 이미지 기반 C. elegans 실험의 시각적 프레젠테이션 및 분석을 위한 사용자 친화적이고 간단한 대안입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

고정 또는 마취된 C. elegans에서 이미지 데이터를 수집할 때 종종 발생하는 문제는 웜이 이웃과 교차하고 클러스터된다는 것입니다. 이 문제는 벌레의 밀도가 증가함에 따라 악화되고 이미징 및 정량화에 대한 과제를 만듭니다. 우리는 피지 기반워크플로우인 웜정렬을 개발하여 C. elegans의 원시 이미지 데이터에서 사용자가 선택한, 곧게 펴고 정렬된 웜의 단일 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 웜 정렬은 사용자 또는 분석 알고리즘에 대한 사전 교육이 필요하지 않은 간단하고 사용자 친화적인 워크플로입니다. 웜 정렬로 생성된 몽타주들은 웜, 분류 및 표현의 육안 검사를 도울 수 있습니다. 또한, 웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. 웜 정렬 출력을 오픈 소스 CellProfiler 소프트웨어를 사용하는 파이프라인인 Worm_CP 가져옵니다. CellProfiler의 유연성은 고콘텐츠 스크리닝을 위한 추가 모듈을 통합할 수 있게 해줍니다. 실용적인 예로, 우리는 두 개의 데이터 세트에 파이프라인을 사용했습니다: 첫 번째 데이터 세트는 열 충격 유도 유전자 hsp-70의프로모터의 통제 하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 열 충격 기자 웜의 이미지이며, 두 번째 데이터 세트는 고정 된 벌레로부터 얻은 이미지이며, 형광 염색으로 지방 상점에 얼룩이 있는 이미지입니다.

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Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

웜 정렬/Worm_CP Caenorhabditis elegans 샘플을 곧게 하고 정렬하고 사전 학습 단계 없이 전체 웜 이미지 기반 assays를 득점하는 데 사용할 수 있는 간단한 FIJI/CellProfiler 워크플로우입니다. 우리는 고정 된 샘플에서 살아있는 동물 이나 지질 물방울에서 열 충격 유도 발현의 정량화에 웜 정렬 /Worm_CP 적용했습니다.

벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

우리는 여기에 원시 현미경 이미지에서 관심의 곧게 된 웜의 단일 또는 다중 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수있는 웜 정렬이라는 간단한 오픈 소스 피지 기반워크를 설명합니다. 이 워크플로는 사용자가 선택한 관심 있는 동물에 의존하므로 웜이 올바른 단계 또는 상태가 아닌 C.elegans의 이미지를 분석할 때 특히 유용할 수 있습니다. 웜 정렬의 출력피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어와 형광의 후속 정량화에 사용할 수 있다는 점에 유의해야 한다.여기서 우리는 CellProfiler 파이프라인 Worm_CP 사용하여 형광 정량화를 보여줍니다. 화염에 연장 후, 확장 후 두 조각으로 부서지지 않으면 모세관을 두 조각으로 부수습니다.두 조각으로 부서진 경우 가장 긴 것의 끝을 잘라냅니다. 더 긴 조각을 선택하고 모세관이 물을 흡인하려고 시도하여 열려 있는지 여부를 테스트합니다. 3mm 실리콘 튜브에서 어댑터를 분리합니다.유리 모세관을 6mm 실리콘 튜브에 연결된 모세관 어댑터에 연결합니다. 그런 다음 6mm 튜브의 다른 쪽 끝을 0.2 마이크로미터 필터와 다른 쪽 끝에 3밀리미터 실리콘 튜브에 연결합니다. 1밀리미터 필터 팁을 3mm 실리콘 튜브의 프리 엔드에 연결하여 액체를 흡인합니다.해부 현미경에서, 입 마이크로 피펫고정 된 벌레의 펠릿 주위에 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 튜브 바닥에 10 마이크로리터의 장착 매체를 빠르게 추가합니다. PBS에 10 마이크로리터 팁을 헹구고 세제 의 흔적으로 벌레가 플라스틱 파이펫 팁의 측면에 달라붙는 것을 방지합니다.그런 다음 팁의 맨 끝을 가위로 잘라냅니다. 이전에 준비된 아가로즈 패드에 웜을 장착한 8개의 마이크로리터를 이송합니다. 현미경 아래 슬라이드를 관찰하는 동안 웜의 겹치지 않도록 부드럽게 동요하십시오.그런 다음 아가로즈 패드에 장착 매체의 드롭을 18 18 mm 커버 슬립으로 덮습니다. 살아있는 벌레를 장착하기 위해 M9에 용해된 3밀리머 레바미솔의 3~4마이크로리터를 아가로즈 패드에 실어 주어 있다. 레바미솔을 떨어뜨리기 위해 조건당 30~50개의 웜을 선택합니다.그런 다음 18 18mm 커버슬립으로 드롭을 덮고 1시간 이내에 웜을 이미지화합니다. ImageJ에서 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 피지를 설치, 또는 이미 컴퓨터에 설치 되어 있는 경우, 버전 1.52A 이상 인지 확인, 다음 GitHub에서 웜 정렬 저장소를 다운로드 하 고 컴퓨터에 저장. 모든 파이프라인 구성 요소를 다운로드하여 설치하면 피지를 열고 플러그인, 매크로를 클릭하여 웜 정렬 매크로를 실행하고 메인 메뉴 표시줄에서 실행합니다.웜 정렬을 찾습니다. ijm 스크립트를 클릭하고 엽니 다. 분석할 이미지가 있는 입력 폴더로 이동하여 선택한 폴더에 이미지 파일만 포함되어 있는지 확인합니다.매크로는 모든 결과가 저장되는 출력 폴더를 자동으로 생성합니다. 폴더의 이름은 포스트 픽스로 출력된 입력 폴더와 동일합니다. 매크로가 입력 폴더에서 첫 번째 이미지를 열고 이를 대표 이미지로 사용하여 웜의 너비, 밝기 및 대비를 포함하여 몽타주를 생성하는 데 필요한 설정을 추출하도록 허용합니다.직선 그리기 도구를 사용하여 웜 너비에 선을 그리고 확인을 클릭합니다. 이 선의 길이를 사용하여 단일 웜에 대한 자른 영역의 높이를 결정합니다. 각 채널에 대해 이름, 조회 테이블 및 몽타주에 포함해야 하는지 여부를 지정한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 슬라이더를 사용하여 채널의 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. 나머지 채널에 대해 이 프로세스를 반복합니다.모든 설정이 구성되면 설정 테이블에 기록되어 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 저장됩니다. 설정 응용 프로그램 후 모든 이미지가 어떻게 보일지 보여 줄 이미지를 생성합니다. 이미지가 만족스럽으면 상단 상자를 체크합니다.모든 설정 패널의 두 번째 및 세 번째 상자는 몽타주 생성에 대한 옵션을 지정합니다. 두 상자를 체크하고 확인을 클릭하여 매크로의 나머지 부분을 실행합니다. 상단 상자를 선택하지 않으면 매크로가 설정을 다시 실행합니다.그런 다음 매크로가 입력 폴더의 모든 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 분할 된 또는 프리 핸드 라인 도구를 사용하여 몽타주에 포함 될 모든 웜의 세로 축에 선을 그립니다. 웜의 전체 길이를 따라 머리에서 꼬리 또는 그 반대의 경우도 마찬가지인 라인을 일관되게 그리고 원하는 모든 웜이 추가되면 컨트롤 T.를 클릭하여 각 줄을 ROI 관리자에 추가하면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 웜 정렬은 선택한 단일 웜의 자른 이미지를 생성하며, 이는 출력 폴더의 단일 웜 하위 폴더에 저장됩니다.선택한 모든 웜의 몽타주가 정렬된 폴더에 저장됩니다. 다운로드 및 다운로드 페이지에서 이전 CellProfiler 릴리스에 대한 링크를 클릭하고 필요한 운영 체제를 선택하여 CellProfiler 2.2.0을 다운로드하고 설치합니다. Worm_CP 파이프라인을 시작하기 전에 예상되는 모든 출력 이미지가 웜 정렬 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 있는지 확인합니다.원본 이미지의 처리된 복사본, 웜 채우기의 이진 이미지 마스크, 선택한 웜에 선이 그려지는 경우 마스크를 정렬하고 원본 이미지의 각 채널을 나타내는 하나의 이미지가 있어야 합니다. CellProfiler를 열고 이미지 입력 모듈을 클릭하고 여기에서 파일 및 폴더를 놓는 다고 적는 셀 프로파일러 모듈 폴더를 창으로 드래그합니다. 이전 분석에서 이미지 목록이 있는 경우 먼저 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 명확한 파일 목록을 선택하여 이미지 목록을 제거합니다.메타데이터 입력 모듈을 클릭하고 두 번째 추출 방법을 클릭하고 노란색 폴더를 클릭하고 웜 정렬 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더로 이동합니다. 설정 파일을 선택한 다음 업데이트를 클릭합니다. 그런 다음 이름 및 유형 입력 모듈을 클릭하고 파이프라인에 필요한 모든 이미지가 있는지 확인합니다.파이프라인을 실행하기 전에 출력 결과에 대한 대상을 선택합니다. 테스트 모드를 사용하여 시작 테스트 모드를 클릭하여 파이프라인의 성능을 확인하고 폴더의 첫 번째 이미지를 통해 실행할 수 있습니다. 파이프라인의 성능에 만족하면 종료 테스트 모드를 클릭하고 이미지를 분석합니다.분석을 시작하기 전에 분석 모듈 앞의 모든 눈이 닫혀 있는지 확인합니다. 분석이 완료되면 두 개의 CSV 파일, 웜 CSV 및 라인 CSV로 구성된 Worm_CP 출력 폴더를 엽니다. 이 프로토콜에 설명된 방법에 따라 C.elegans를 배양하고 이미징하면 웜 개체수의 큰 개요 이미지가 생성됩니다.파이프라인의 출력은 주로 이미지 위에 그려진 선의 품질에 따라 달라집니다. 웜 정렬의 여러 줄 예제와 출력이 여기에 표시됩니다. 웜 정렬 스크립트를 사용하는 경우 데이터 하위 폴더에 있는 오버레이 이미지와 몽타주에 있는 개별 웜 패널에서 교차하는 웜의 시각적 식별이 가능합니다.QC 테이블을 사용하여 겹치는 웜을 식별할 수도 있습니다. 그러나 교차하는 선은 Worm_CP 파이프라인에 문제가 있습니다. 이는 Worm_CP 관심 영역이 아닌 라인 마스크를 사용하여 개별 웜을 식별하는 데 도움이 되기 때문입니다.따라서 CellProfiler는 웜 중 하나를 두 개체로 분할합니다. Worm_CP 파이프라인은 지질 방울에 통합되는 형광염으로 표시된 고정 동물의 형광 강도를 정량화하는 데 사용되었습니다. 지질 물방울 함량은 수동 정량화를 사용하여 야생 유형과 돌연변이 DBL1 동물 사이에 17 % 감소하고, Worm_CP 파이프 라인을 사용하여 12 % 감소합니다.Worm_CP 또한 열 충격 유도 유전자의 통제하에 GFP를 표현하는 살아있는 벌레에서 열 충격 반응을 정량화하기 위하여 이용되었습니다. 열 응력의 부재에서, 벌레는 GFP 발현을 유도하지 않았다. 웜이 짧은 열 충격으로 노출되면 GFP 발현이 유도됩니다.Worm_CP 출력은 주로 웜 정렬을 사용하여 그리는 선의 품질에 따라 달라집니다. 선이 닿거나 겹치지 않고 모든 선을 같은 방향으로 그립니다. QC 테이블을 확인하면 분석에서 이러한 사례를 제외할 수 있도록 만지거나 겹치는 줄을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 후속 정량화에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 다른 분석 모듈이 매우 쉽게 통합 될 수있는 매우 기본적인 CellProfiler 파이프 라인을 보여 주었다, 예를 들어, 지질 방울의 수를 계산하거나 웜 내에서 개별 방울의 강도를 정량화. 이 기술의 장점 중 하나는 개별 벌레에서 형광을 신속하게 정량화 할 수있는 가능성입니다.우리의 실험실에서, 우리는 형광 기자를 사용하여 개별 생존가능성에 관심이 있고 우리는 이 목적을 위해 웜 정렬 및 Worm_CP 일상적으로 사용합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

연구

생물학

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

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관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

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지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...