Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Vi vil gjerne takke Dr Christian Lanctôt ved BIOCEV (Praha, Tsjekkia) for å lære oss munnen mikropipette teknikk for å montere faste ormer og Dr Fatima Santos og Dr Debbie Drage for å dele sikkerhetsoppsett på munnen mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC støttes av ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].

1. Fiksering av ormer for fettinnholdsavbildning ved hjelp av et fluorescerende fargestoff for lipiddråper (BODIPY)10
<ol><li>Forbered en synkronisert populasjon av C. elegans ved bleking i henhold til standardprosedyrer2. Plate ca 1000 L1-trinns ormer på en 9 cm nematode vekst media (NGM) plate per tilstand. MERK: Flere ormer er forberedt enn faktisk kvantifisert på slutten, på grunn av tap av ormer ved håndtering.</li>
	<li>For å bilde dyr på ung voksen stadium (rundt 50 h post L1 plating ved 20 ° C), vask hver 9 cm plate med 15 ml M9 i et konisk rør, sentrifuge på 252 x g i 1 min, og fjern supernatant.</li>
	<li>Gjenta vasken og la 1 ml M9 over pellet av ormer.</li>
	<li>Overfør 1 ml M9 som inneholder ormene i et 2 ml lavt proteinbindende mikrocentrifugerør, ved hjelp av lave oppbevaringsspisser.</li>
	<li>Spinn ned på 252 x g i en mikrocentrifuge i 1 min og fjern supernatanten, vær forsiktig så du ikke berører ormpelleten nederst på røret.</li>
	<li>For overvåking av fettinnhold ved hjelp av 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) farging1 ( Table of Materials), fikse ormer enten ved å legge til 0,5 ml 60% isopropanol til ormpellet i 3 min11, eller ved å legge til 2 ml iskald metanol i 10 min. For begge prosedyrene, inverter røret hver 30 s. FORSIKTIG: Hvis metanol er den valgte fikseringsreagensen, må dette trinnet utføres i en røykhette på grunn av toksisiteten.</li>
	<li>Fjern så mye fikseringsmiddel som mulig uten å berøre ormpelleten og tilsett 1 ml M9. La ormene bosette seg på bunnen av røret i 3-5 min.</li>
	<li>Vask igjen med 1 ml M9, la ormene slå seg ned og fjern supernatanten, og la ca 50 μL i røret. Fest røret med en klemme.</li>
	<li>Frys-sprekk ormene ved å stupe sikkert lukket rør i flytende nitrogen og deretter inn i et varmt vann bad på ~ 40 ° C.</li>
	<li>Gjenta trinn 1.9 en gang til.</li>
	<li>Tilsett 0,5 ml BODIPY fortynnet i M9 ved en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL og plasser på en rotator ved romtemperatur i 1 time.</li>
	<li>Etter 1 t, la ormene bosette seg nederst på røret i 3-5 min.</li>
	<li>Fjern supernatant og tilsett 1 ml M9.</li>
	<li>La ormene bosette seg nederst og fjerne supernatant. MERK: Alternativt er det mulig å spinne ned på 252 x g i 1 min, da dette ikke ser ut til å påvirke morfologien.</li>
	<li>Legg til 0,5 ml M9. MERK: Hvis fikseringsmiddelet er 60% isopropanol, kan ormene bare brukes innen 48 timer. Hvis fikseringsmiddelet er metanol, bør ormene brukes innen 24h.</li>
</ol>2. Klargjøre agarose pads for å montere ormene
MERK: Det kritiske trinnet under utarbeidelsen av en agarosepute er å få en pute med vanlig tykkelse. Ellers vil ormer over puten være i forskjellige fokale fly, noe som gjør det vanskelig å få et fokusert bilde av et bredere synsfelt.
<ol><li>Forbered 2% agarose pads ved å legge til 0,2 g agarose til 10 ml sterilisert H2O i et beger eller en konisk kolbe. Varm i mikrobølgeovnen i 30 s til agarose begynner å koke. MERK: Ikke overopphetes og stopp så snart bobler vises. ellers øker det viskositeten til agarose gjør det vanskeligere å oppnå ønsket pad tykkelse.</li>
	<li>Når agarose er smeltet, dispensere en dråpe smeltet agarose i midten av et mikroskop glass lysbilde ved hjelp av en 1000 μL pipette tips med sin helt ende kutt. Umiddelbart, men delikat, hold et annet glasssklie svært nær agarose-fallet og slipp den på agarose for å danne en pute med vanlig tykkelse for best mikroskopiresultater. MERK: Hvis du slipper det øverste lysbildet fra en høyde, dannes ikke bare bobler, men vil resultere i en ujevn pute. Alternativt er det også mulig å bruke to glasssklier flankerer lysbildet med puten, med et tynt lag med tape på hvert lysbilde.</li>
	<li>Etter minst 2-3 min, fjern forsiktig det øverste lysbildet. Bruk siden av det øverste lysbildet til å trimme puten for å gjøre den firkantet formet. Monter ormene innen 5 min, for å hindre at puten tørker før bruk.</li>
</ol>3. Montering av faste ormer for bildebehandling
<ol><li>Lag en munnmikropipette ved å utvide en tynn glasskapillær i flammen til en Bunsen-brenner (figur 1A). Etter forlengelse i flammen, bryte kapillær i to stykker (Figur 1B). Velg den mest tilstrekkelige, vanligvis den lengste, og test om enden av kapillæren er åpen ved å prøve å aspirere vann. MERK: Hvis væsken ikke kommer inn i kapillæren, er den for tynn eller blokkert. Skjær forsiktig enden av kapillæren med en saks, unngå å kutte for mye som ormer vil bli aspirert hvis hullet er for stort.</li>
	<li>Plugg glasskapillæren fra trinn 3.1 til kapillæradapteren (figur 1C), koblet til silikonrøret på 6 mm og koble den andre enden av silikonrøret på 6 mm til et 0,2 μm filter, festet til et 3 mm silikonrør i den andre enden (figur 1C). Plugg en 1 ml filterspiss (figur 1C) inn i den frie enden av 3 mm silikonrør for å aspirere væske. MERK: Filteret på 0,2 μm tilsettes mellom munnen på eksperimentereren og kapillæren, for å sikre maksimal sikkerhet for eksperimentereren. En lignende løsning brukes til munnmikropipetter som brukes til å håndtere museembryoer12. Bytt filteret (vanligvis noen få måneder) hvis munnmikropipetten ikke aspirerer væske lenger.</li>
	<li>Bruk munnmikropipetten under et disseksjonsmikroskop, fjern så mye væske som mulig rundt ormpellet av faste ormer (figur 2). MERK: Pipettering supernatant ut ved hjelp av en manuell mikropipette kan brukes som et alternativ til munnpipettene i trinn 3.1 til 3.3 for å fjerne så mye supernatant som mulig. Tilsett 6 μL monteringsmedium. Vi finner imidlertid at denne metoden ikke fungerer så effektivt fordi overdreven væske i putene skaper en sparsom ormtetthet, noe som gjør avbildningen mer tidkrevende. Fortsett trinn 3.6. Se på bunnen av røret og sørg for at pipetten ikke aspirerer ormene.</li>
	<li>Tilsett raskt 10 μL monteringsmedium (Materials table) til bunnen av røret.</li>
	<li>Skyll en 10 μL tupp i PBS med spor av vaskemiddel (0,01% Triton), for å hindre ormer fra å holde seg til sidene av plastpipettespissen. Klipp selve enden av spissen med en saks.</li>
	<li>Overfør 8 μL monteringsmedium som inneholder ormene på agaroseputen tilberedt i trinn 2.3. Under mikroskopet rister du forsiktig lysbildet, for å unngå overlapping av ormene.</li>
	<li>Dekk dråpe monteringsmediet på agaroseputen med en 18 mm x 18 mm dekslerslip (figur 3). MERK: Mindre dekkslips foretrekkes da de utøver mindre press på ormene. Hold dekkslipsen med et par pinsett og påfør den ene kanten av dekkslippen mot agaroseputen, før du forsiktig deponerer dekkslipsen med pinsettene.</li>
</ol>4. Montering av levende ormer for avbildning
MERK: For å bilde levende ormer, må de immobiliseres på puten. En måte å oppnå dette på er å lamme dem med nikotinreseptoragonisten: levamisol (Materialseksjon).
<ol><li>Pipette 3−4 μL på 3 mM levamisole oppløst i M9 på agaroseputen som ble opprettet i trinn 2,3. MERK: Det bør være nok flytende volum at ormene ikke er oppå hverandre, men ikke for mye væske at ormene er for sparsomme på puten. Erfarne ormplukkere kan bruke 3 μL levamisole. Mindre erfarne pickers må kanskje legge til et større volum av levamisole, slik at levamisole ikke helt fordamper.</li>
	<li>Plukk 30-50 ormer per tilstand i dråpe levamisole.</li>
	<li>Dekk dråpe levamisole på agarose pad med en 18 mm x 18 mm dekkslipp. Bildeormer innen 1 time, da lammende middel til slutt vil føre til døden av ormene.</li>
</ol>5. Bildebilder med et epifluorescencemikroskop
<ol><li>Med en agarose pad av jevn tykkelse, bilde alle ormer på lysbildet på en gang ved hjelp av en 6 x 6 eller 7 x 7 stort bilde for eksempel med 20x mål om et fluorescerende mikroskop. Hvis tykkelsen på puten ikke engang er jevn, kan du skaffe flere mindre 3 x 3 eller 4 x 4 bilder av samme lysbilde.</li>
	<li>Bruk de samme innstillingene for fluorescensintensitet og eksponeringstid for alle forhold. Juster hver innstilling slik at den samsvarer med lysbildet som har den lyseste intensiteten, slik at det ikke er noen pikselmetning. Hvis du vil ha spesifikke instruksjoner om bildeanskaffelse, følger du mikroskopprodusentens instruksjoner.</li>
</ol>6. Opprette montasjebilder av justerte enkeltormer ved hjelp av Worm-align FIJI-rørledningen
<ol><li>Installer programvarepakken for bildeanalyse med åpen kildekode FIJI13/ImageJ14 fra https://imagej.net/Fiji. Hvis en tidligere installasjon av FIJI er tilgjengelig, må du kontrollere at den er oppdatert til versjon 1.52a eller senere, da noen av funksjonene som brukes i makroen (f.eks. tabellfunksjoner), krever dette. Last ned ormjustert makro fra Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.</li>
	<li>Åpne FIJI, og kjør ormjustert makro. Utfør orm-juster ved å klikke plugins | Makroer | Kjør i fiji hovedmenylinjen (Figur S1). Finn nå Worm-align.ijm-skriptet på datamaskinen.</li>
	<li>Makroen initialiseres ved å be om plasseringen av bildene. Rørledningen vil fungere på både enkanals og flerkanals fluorescensbilder (figur S2). Velg en inndatamappe, og makroen genererer automatisk en utdatamappe der alle resultatene skal lagres (figur S3). MERK: Det er viktig at den valgte mappen bare inneholder bildefiler, da tilstedeværelsen av andre filformater vil føre til at makroen krasjer. Ideelt sett grupperer bare sammen bilder som ble tatt med de samme mikroskopinnstillingene. Orm-align vil godta mange forskjellige filformater, inkludert nd2, czi, tif, rgb, jpg og png. Navnet på utdatamappen vil være det samme som inndatamappen, med "_output" lagt til som et postfix, det vil si hvis inndatamappen er "bilder", vil utdataene bli funnet i "images_output". Utdatamappen inneholder fire undermapper, der dataene skal lagres.</li>
	<li>Tillat at makroen fortsetter å åpne det første bildet i inndatamappen og bruke det som et representativt bilde for å trekke ut en innstilling for å generere montasjen. MERK: Orm-align vil automatisk velge det første bildet i inndatamappen for å generere innstillingene som skal brukes på alle andre bilder i mappen. Hvis et annet bilde anses å være mer representativt for datasettet, må du kontrollere at dette bildet er valgt ved å lagre en kopi av bildet i inndatamappen, endre navnet slik at det nå er oppført øverst i listen (f.eks. '0_RepresentativeImage').</li>
	<li>Med det rette tegneverktøyet tegner du en linje over bredden på en orm (figur S4) og bruker lengden på denne linjen til å bestemme høyden på de beskårne områdene for enkle ormer. For hver kanal angir du navnet, oppslagstabellen (LUT), intensitetsinnstillingene (B&C) og om det skal inkluderes i montasjen (figur S4). MERK: Disse parameterne registreres og lagres i en innstillingsfil, Innstillinger.csv, som ligger i CellProfiler-undermappen i utdatamappen.</li>
	<li>Når alle innstillingene er tatt, vises brukeren hvordan bildene vil se ut etter påføring av innstillingene som er brukt (Figur S5). Merk av i den øverste boksen hvis innstillingene er tilstrekkelige. Velg alternativer for montasjegenerering (fjern flått, om ikke nødvendig): 1. Generer en montasje av utvalgte ormer for hvert enkelt bilde, eller 2. Generer en kombinert montasje der alle ormer valgt på alle bildene i inndatamappen vil bli kombinert til en enkelt montasje. Klikk OK for å utføre resten av makroen. MERK: Hvis den øverste boksen ikke er merket av før du klikker på 'OK' makroen vil kjøre oppsettet på nytt, slik at bildeinnstillingene kan optimaliseres.</li>
	<li>Worm-align-rørledningen fortsetter nå å åpne alle bilder i inndatamappen. For hvert bilde tegner du linjer på langsgående akse av alle ormer som skal inkluderes i montasjen og/eller kvantifisere (figur 4 og figur S6) ved hjelp av "segmentert linje" -verktøyet (på FIJI-hovedmenylinjen). For å sikre riktig justering av orm, tegn linjer konsekvent fra hode til hale ende (eller vice versa), og langs hele lengden av ormen (se eksempler på "god" og "dårlig" linje tegning i figur 4B).</li>
	<li>Legg til hver linje i roi managerved å klikke Ctrl + T. Worm-align bruker linjene lagt til roi manager, i kombinasjon med orm bredde parameteren (satt i trinn 6.4) for å generere beskårne bilder av enkelt valgte ormer. Samlingen av linje-ROIer lagres i undermappen "data". Denne mappen inneholder også en kopi av det opprinnelige bildet som viser linjene, samt nummeret på ormen. Linjer er fargekodet med Glasbey_on_dark oppslagstabellen. Bildene av rettede ormer lagres i single_worms undermappen i utdatamappen. Hvis det er valgt i trinn 6.6 i denne protokollen, produserer Orm-align montasjer av alle ormer valgt per oversiktsbilde og/eller for alle oversiktsbilder i inndatamappen (se figur 4C og figur S7). Disse montasjer kan bli funnet i "justert" undermappe av utdatamappen.</li>
</ol>7. Analysere fluorescensintensitet for enkeltorm ved hjelp av utgangen fra Worm-align i en automatisert CellProfiler-rørledning
<ol><li>For nedstrøms databehandling og analyse av Worm-align utgang, laste ned og installere åpen kildekode bildeanalyse programvarepakken 'CellProfiler15,16 fra https://cellprofiler.org/. Last ned Worm_CP.cpproj-rørledningen fra GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align Merk: Eksempelsamlebåndet som er beskrevet her, ble konstruert ved hjelp av CellProfiler2.2.0 og kan ikke kjøres i senere versjoner av CellProfiler.</li>
	<li>Før du starter Worms_CP.cpproj-rørledningen, sikre at alle forventede utdatabilder finnes i CellProfiler-undermappen i utdatamappen Worm-align: en bearbeidet kopi av det opprinnelige bildet (kalt: Original_), en binær bildemaske av ormpopulasjonen (kalt: Mask_), en linjemaske av linjene som tegnes på valgte ormer (kalt: Lines_), og ett bilde som representerer hver av kanalene som finnes i det opprinnelige bildet (navngitt av kanalnummer).</li>
	<li>For å kvantifisere fluorescensintensiteten i enkelt ormer, klikk på Bilder inndatamodulen og bare dra CellProfiler utdatamappen inn i vinduet som sier Slipp filer og mapper her. Hvis det finnes en liste over bilder fra tidligere analyser, må du først fjerne disse ved å høyreklikke i vinduet og velge Fjern filliste. Hvis du vil utelate «Innstillinger.csv-filen fra bildelisten, velger du enten «Bare bilder» eller «Egendefinert» med «Utvidelse er tif, tiff, ome.tif eller ome.tiff» for filterinnstillingene (figur S8).</li>
	<li>Klikk på Metadata-inndatamodulen. I den andre utvinningsmetoden klikker du på den gule mappen, og finner cellprofiler-undermappen i utdatamappen WormAlign (Figur S9). Velg innstillinger.csv-filen, og koble innstillingene i filen til CellProfiler-utdataene ved å samsvare metadataene i CSV-filene til de i bildene (kanalmetadata).</li>
	<li>Klikk på NamesAndTypes inndatamodulen og sett inn et nytt bilde for hver kanal av det opprinnelige bildet som skal kvantifiseres. MERK: Allerede til stede i eksempelpipelinen er ormmasken, to fargebilder, linjemasken og det opprinnelige bildet, og tre gråskalabilder (den grønne og den røde kanalen). Listen i denne modulen må justeres hvis de opprinnelige bildene har flere eller færre kanaler enn eksempelbildene.</li>
	<li>Kontroller at navnet på bildene i hver kolonneetikett/maske/ormer er riktig. MERK: Navnene på bildene på én linje skal alle samsvare med det samme første bildet som skal analyseres. Hvis det gjøres en feil under bildeanalyseprosessen, mangler noen av utdatabildene, og navnene under de tre kolonneetikettene/masken/ormene vil ikke tilsvare det samme første bildet lenger for hver linje. Hvis dette er tilfelle, finn ut hvor feilen er.</li>
	<li>Trykk Vis utdatainnstilling for å velge mappen for å lagre utdataene fra Cellprofiler.</li>
	<li>Klikk Start testmodus. Når du er i testmodus, dobbeltsjekker du innstillingene for rørledningen ved å bruke dem på det første bildet i datasettet, ved å klikke Kjør (som vil kjøre gjennom alle aktive moduler i rørledningen), eller Trinn (som vil kjøre gjennom rørledningen én modul om gangen). MERK: Når du er i testmodus, eksporteres ikke de utpakkede målene, selv om en ExportToSpreadsheet-modul finnes (og aktiv) i rørledningen.</li>
	<li>Når rørledningen utfører slik den skal, klikker du Avslutt testmodus og trykker deretter Analyser bilder. Som konfigurert, vil Worms_CP (1) bruke Mask_-bildet til å segmentere en grov ormmaske og Lines_-bildet (Figur S10A) til å utse de valgte ormene og produsere enkeltormmasker (figur S10C), (2) måle fluorescensintensiteten til alle kanaler som finnes i inndatabildene i de ormene identifisert og maskert. Rørledningen kan også måle bakgrunnsintensitet (figur S10B) og korrigere alle bilder tilsvarende (angitt med ordet terskel i navnet på parameteren målt. f.eks. Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) måle størrelsen på de valgte ormene, og (4) eksportere alle målte parametere (Figur S10D).</li>
	<li>Åpne Worm_CP som består av to csv-filer, ormer.csv og linjer.csv som er lagret i den valgte utdatamappen (se Figur S11). Disse filene kan åpnes i Excel eller R (Studio) for etterbehandling og rapportering. Hvis det kreves ekstra utdata, for eksempel per bildedata, kan dette velges i ExportToSpreadsheet-modulen i rørledningen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Orm-align er en FIJI-basert bildebehandlingsrørledning som lett genererer montasjer av brukervalgte ormer, der ormer rettes og justeres for å hjelpe visuell sammenligning, klassifisering og representasjon. Selv om denne funksjonen også tilbys av noen eksisterende verktøy, spesielt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, krever Worm-align relativt lite tidligere bildeanalyseopplevelse: Brukere trenger bare å spore de ormene de ønsker å velge for montasjen (og analysen). Selv om sporing av ormene på råbildedataene er en enkel prosess - spesielt når en berøringsskjermdatamaskin eller nettbrett er tilgjengelig- det er viktig, at linjer tegnes riktig langs ormenes langsgående akse. Ufullstendige linjer, som bare følger en del av ormen, vil resultere i delvise ormer i montasjen (det vil si ormer som mangler hoder av haleender) og delvissegmenteringsmasker under CellProfiler-analyse. Også, hvis linjer fra to individuelle ormer krysser, vil ormene ikke bli riktig behandlet i ormen justering montasje samt for fluorescens kvantifisering. For kvalitetskontroll lagres et overleggsbilde av linjevalgene på det opprinnelige bildet i datamappen, sammen med en QC-tabell. Fra disse kan problematiske linjer som fører til feil segmenterte ormer lett identifiseres og utelates fra montasje og/eller påfølgende analyse.
Selv om direkte innspill fra eksperimentereren i valg av ormer kanskje virker litt tidkrevende, presenterer det en klar fordel av arbeidsflyten over andre i eksperimenter der ormer fra forskjellige utviklingsstadier er tilstede i samme bilde: Ormer kan velges under "sporingstrinn", ved å skissere bare de ormene som er i riktig utviklingsstadium. Alternativt kan ormer filtreres ved hjelp av utgangen fra Worm_CP basert på enten lengden på sporingslinjen, eller området av segmenteringsmasken, både pålitelige indikatorer på ormenes lengde/størrelse. Uten tvil kan maskinlæringsalgoritmer slite med å gjenkjenne ormer fra forskjellige utviklingsstadier, da deres størrelse og utseende i DIC-bildene er så forskjellige.
Utgangen av Worm-align kan brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre bildeanalyseprogramvareplattformer. Vi demonstrerte dette ved å importere Worm-align-utgangen til en enkel CellProfiler-rørledning (Worm_CP), som gjør det mulig å kvantifisere flerkanals fluorescensintensitet i de individuelle ormene som ble valgt mens du kjører Worm-align-rørledningen. Vi valgte denne tilnærmingen på grunn av fleksibiliteten til CellProfiler-programvaren: Det er enkelt å innlemme flere moduler i rørledningen for å analysere flere funksjoner i individuelle ormer (f.eks. måle størrelsen på lipiddråper, eller stressgranulat, kjerner, mitokondrier). I tillegg kan enkeltormmaskene potensielt brukes til å trene en ny modell for WormToolbox7.
De viktigste fordelene med denne metoden er at den er rask og krever et enkelt ormmonterings oppsett. Denne metoden er raskere da den ikke krever å bruke tid på å lære programvaredrift eller kjøre opplæringssett gjennom enmaskinalgoritme 7. Videre fungerer denne metoden med enten levende eller faste ormer bare montert på vanlige agarose pads. Det er ikke nødvendig å bruke komplekse mikrofluidiske kamre, som utviklet i andre metoder5,6.

En relativt enkel organisme, nematoden C. elegans, er et ekstremt nyttig modellsystem for å studere menneskelige sykdommer. Omtrent 38% av genene i C. elegans genom har funksjonelle kolleger hos mennesker1,2. En av de unike egenskapene til C. elegans er at den er optisk gjennomsiktig, noe som gir enkel tilgang til in vivo-informasjon om (sub) cellulært uttrykk for fluorescerende journalister på tvers av vev. Dette gjør C. elegans en førsteklasses modell organisme for høyinnholdsskjermer ved hjelp av bildebaserte plattformer3. Men et problem som ofte kompliserer disse studiene er at når de avbilder tette populasjoner av ormer, har de en tendens til å krysse og klynge, noe som gjør sammenligninger på tvers av individuelle ormer utfordrende, overskyet nedstrøms bildeanalyse og kvantisering.
Eksisterende løsninger som overvinner dette problemet, er vanligvis avhengige av optimalisering av kulterings- og bildeprotokollen, for eksempel gjennom bruk av mikroflytoppsett4, slik at enkeltormer kan fanges i separate bilder5,6. Andre har brukt maskinlæringsalgoritmer som åpner for anerkjennelse av enkeltormer, selv i en klumpete befolkning. Et utmerket eksempel på sistnevnte er WormToolbox, som er en modulær forlengelse av åpen kildekode bildeanalyseplattform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyr en løsning med høy gjennomstrømning og høyt innhold for analyse av C. elegans,og drar helt klart nytte av inkluderingen i CellProfiler, da ytterligere analysemoduler enkelt kan inkluderes. Selv om WormToolbox leveres med en forhåndstrent modell (DefaultWormModel.xml), er omskolering av maskinlæringsalgoritmen vanligvis nødvendig for hvert nytt program. Online tutorials om hvordan du gjør dette er tilgjengelig på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Til tross for dette krever installasjon og bruk av WormToolbox en betydelig tidsinvestering for nybegynnere.
Her beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv protokoll til kultur, og bildepopulasjoner av C. elegans. For å tillate vurdering av individuelle ormer i de oppkjøpte bildene har vi utviklet en enkel åpen kildekode FIJI-basert arbeidsflyt, kalt Worm-align. Orm-align kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av rettede og justerte ormer. For det første må brukeren manuelt velge individuelle ormer for analyse ved å tegne en linje fra hodet til halen. Orm-align vil bruke dette valget til å beskjære utvalgte ormer fra oversiktsbildet, og generere en montasje der valgte ormer er rettet og justert for å lette visuell sammenligning og presentasjon.
I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Vi har brukt Worm_CP rørledningen til å kvantifisere varmesjokkresponsen, en godt bevart beskyttelsesmekanisme som binder seg over proteiner som er feilfoldet på grunn av stressfaktorer som høy temperatur8. Spesielt brukte vi rørledningen på ormer som bærer en integrert multi-kopi transgene, hvor arrangøren av et varmesjokk induserbart gen, hsp-70 (C12C8.1), driver grønt fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brukt Worm_CP rørledningen på faste dyr som har blitt merket med et fluorescerende fargestoff som visualiserer lipiddråper (LDer), den viktigste fettlagringsorganelle i C. elegans10. Selv om denne arbeidsflyten ikke har gjennomstrømningen som tilbys av WormToolBox, er det et brukervennlig og enkelt alternativ for visuell presentasjon og analyse av bildebaserte C. elegans eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Et problem som ofte oppstår når du anskaffer bildedata fra faste eller bedøvede C. elegans er at ormer krysser og klynger seg med sine naboer. Dette problemet forverres med økende tetthet av ormer og skaper utfordringer for avbildning og kvantifisering. Vi utviklet en FIJI-basert arbeidsflyt, Worm-align, som kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av brukervalgte, rettede og justerte ormer fra rå bildedata av C. elegans. Orm-align er en enkel og brukervennlig arbeidsflyt som ikke krever tidligere opplæring av brukeren eller analysealgoritmen. Montasjer generert med Worm-align kan hjelpe visuell inspeksjon av ormer, deres klassifisering og representasjon. I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Som et praktisk eksempel har vi brukt rørledningen på to datasett: det første datasettet er bilder av varmesjokkreporterormer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av arrangøren av et varmesjokkinduserbart gen hsp-70, og det andre datasettet er bilder hentet fra faste ormer, farget for fettbutikker med fluorescerende fargestoff.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Orm-align / Worm_CP er en enkel FIJI / CellProfiler arbeidsflyt som kan brukes til å rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og å score helorm bildebaserte analyser uten behov for tidligere opplæringstrinn. Vi har brukt Worm-align/Worm_CP på kvantifisering av varmesjokkindusert uttrykk hos levende dyr eller lipiddråper i faste prøver.

Orm-juster og Worm_CP, to åpen kildekode rørledninger for retting og kvantifisering av fluorescens bildedata hentet fra Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Vi beskriver her en enkel åpen kildekode Fiji-basert arbeidsflyt kalt Worm-align, som kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av rettede ormer av interesse fra rå mikroskopibilder. Fordi denne arbeidsflyten er avhengig av brukervalgte dyr av interesse, kan det være spesielt nyttig når du analyserer bilder fra C.elegans der ormene ikke er alle på riktig stadium eller tilstand. Det bør bemerkes at utgangen av Worm-align kan brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescens med enten Fiji eller annen bildeanalyse programvare.Her demonstrerer vi fluorescens kvantifisering ved hjelp av CellProfiler rørledningen Worm_CP. Begynn med å lage en munnmikropipette ved å utvide en tynn glasskapillær i flammen til en Bunsen-brenner. Etter forlengelse i flammen, bryte kapillær i to stykker hvis det ikke brytes inn i to stykker etter forlengelse.Hvis det brøt i to stykker, kutt enden av den lengste. Velg det lengre stykket og test om kapillæren er åpen ved å forsøke å aspirere vann. Koble adapteren fra et tre millimeter silikonrør.Plugg glasskapillæren til en kapillæradapter knyttet til et seks millimeter silikonrør. Koble deretter den andre enden av seks millimeterrøret til et 0,2 mikrometerfilter og et tre millimeter silikonrør i den andre enden. Plugg en 1 millimeter filterspiss inn i den frie enden av det tre millimeter silikonrøret for å aspirere væske.Under et disseksjonsmikroskop fjerner du så mye væske som mulig rundt en pellet av faste ormer med munnmikropipetten. Tilsett raskt 10 mikroliter monteringsmedium til bunnen av røret. Skyll en 10 mikroliterspiss i PBS med spor av vaskemiddel for å hindre at ormer stikker til sidene av plastpipettespissen.Klipp deretter helt enden av spissen med en saks. Overfør åtte mikroliter monteringsmedium med ormene på en tidligere forberedt agarose pad. Mens du observerer lysbildet under mikroskopet, rører du det forsiktig for å unngå overlapping av ormene.Dekk deretter dråpen av monteringsmediet på agaroseputen med en 18 med 18 millimeter deksler. For å montere levende ormer, pipette tre til fire mikroliter på tre millimolar levamisole oppløst i M9 på en agarose pad. Plukk 30 til 50 ormer per tilstand i dråpe levamisole.Dekk deretter dråpen med en 18 med 18 millimeter dekkslipp og bilde ormene innen en time. Installer programvarepakken for bildeanalyse med åpen kildekode Fiji fra ImageJ, eller hvis den allerede er installert på datamaskinen, må du kontrollere at det er versjon 1.52A eller nyere, og last deretter ned Worm-align-repositoriet fra GitHub og lagre det på datamaskinen. Når alle pipelinekomponenter er lastet ned og installert, åpner du Fiji og utfører Worm-align-makroen ved å klikke plugins, makroer og kjøre i hovedmenylinjen.Finn ormen-align. ijm script og klikk åpne. Naviger til inndatamappen med bildene som skal analyseres, og klikk velg, og kontroller at den valgte mappen bare inneholder bildefiler.Makroen genererer automatisk en utdatamappe der alle resultatene vil bli lagret. Navnet på mappen vil være det samme som inndatamappen med utdata som en post-fix. Tillat at makroen åpner det første bildet i inndatamappen og bruker det som et representativt bilde for å trekke ut innstillingene som kreves for å generere montasjen, inkludert bredden på ormene, lysstyrken og kontrasten.Bruk det rette linjetegneverktøyet til å tegne en linje over bredden på en orm og klikke OK. Bruk lengden på denne linjen til å bestemme høyden på de beskårne områdene for enkle ormer. For hver kanal angir du navnet, oppslagstabellen og om den skal inkluderes i montasjen, og deretter klikker du OK. Deretter justerer du innstillingene for lysstyrke og kontrast for kanalene ved hjelp av glidebryterne. Gjenta denne prosessen for de gjenværende kanalene.Når alle innstillingene er konfigurert, registreres de i en innstillingstabell og lagres i CellProfiler-undermappen i utdatamappen. Et bilde genereres for å vise hvordan alle bilder vil se ut etter påføring av innstillingene. Hvis bildet er tilfredsstillende, merker du av i toppboksen.Den andre og tredje boksen i sjekk alle innstillinger panelet angi alternativene for montasje generasjon. La begge boksene være merket av, og klikk OK for å utføre resten av makroen. Hvis du ikke merker av i den øverste boksen, blir makroen kjørte installasjonen på nytt.Makroen fortsetter deretter å åpne alle bilder i inndatamappen. For hvert bilde tegner du linjer på langsgående akse av alle ormer som skal inkluderes i montasjen ved hjelp av segmentert eller frihåndslinjeverktøyet. Tegn linjer konsekvent fra hode til hale eller omvendt langs hele lengden på ormene og legg til hver linje i ROI-lederen ved å klikke Kontroll T.Når alle ønskede ormer er lagt til, klikker du OK. Orm-align vil da generere beskårne bilder av enkelt valgte ormer, som vil bli lagret i enkelt orm undermappe av utdatamappen.Montasjer av alle ormer valgt vil bli lagret i den justerte mappen. Last ned og installer CellProfiler 2.2.0 ved å klikke koblingen for tidligere CellProfiler-versjoner på nedlastingssiden og velge det nødvendige operativsystemet. Før du starter Worm_CP, må du kontrollere at alle forventede utdatabilder finnes i CellProfiler-undermappen i utdatamappen Worm-align.En bearbeidet kopi av det opprinnelige bildet, en binær bildemaske av ormenpopulasjonen, justere maske hvis linjen tegnes på valgte ormer og ett bilde som representerer hver av kanalene i det opprinnelige bildet skal være til stede. Åpne CellProfiler, klikk deretter på bildeinndatamodulen og dra CellProfiler-modulmappen inn i vinduet som sier slippfiler og mapper her. Hvis det finnes en liste over bilder fra en tidligere analyse, må du først fjerne disse ved å høyreklikke i vinduet og velge fjern filliste.Klikk på metadatainndatamodulen og på den andre utvinningsmetoden, klikk på den gule mappen og naviger til CellProfiler-undermappen i utdatamappen Worm-align. Velg innstillingsfilen, og klikk deretter oppdater. Deretter klikker du på inndatamodulen for navn og type, og kontrollerer at alle bildene som kreves for rørledningen, finnes.Før du kjører rørledningen, velger du et mål for utdataresultatene i utdatamodulen. Bruk testmodusen til å se hvordan datasamlebåndet fungerer ved å klikke start testmodus og la den kjøre gjennom det første bildet i mappen. Når du er fornøyd med ytelsen til rørledningen, klikker du avslutt testmodus og analyserer bilder.Før du begynner analysen, må du kontrollere at alle øyne foran analysemodulen er lukket. Når analysen er fullført, åpner du Worm_CP utdatamappen som består av to CSV-filer, CSV-ormer og linjer CSV. Culturing og imaging C.elegans i henhold til metoden beskrevet i denne protokollen produserer store oversiktsbilder av ormpopulasjoner.Utgangen av rørledningen avhenger i stor grad av kvaliteten på linjene som tegnes på toppen av bildene. Flere linjeeksempler og deres utgang fra Worm-align vises her. Når du bruker Worm-align-skriptet, er visuell identifisering av kryssende ormer mulig fra overleggsbildene som finnes i dataundermappen, samt fra panelene av individuelle ormer i montasjen.QC-tabellen kan også brukes til å identifisere overlappende ormer. Kryssende linjer er imidlertid problematiske for Worm_CP rørledningen. Dette er fordi Worm_CP bruker linjemaske, ikke områder av interesse, for å identifisere individuelle ormer.CellProfiler vil derfor segmentere en av ormene som to objekter. Den Worm_CP rørledningen har blitt brukt til å kvantifisere fluorescensintensiteten fra faste dyr merket med et fluorescerende fargestoff som inkorporerer i lipiddråper. Lipiddråpeinnholdet reduseres med 17 % mellom villtype og muterte DBL1-dyr ved hjelp av manuell kvantifisering, og med 12 % ved hjelp av Worm_CP rørledningen.Worm_CP ble også brukt til å kvantifisere varmesjokkresponsen i levende ormer som uttrykte GFP under kontroll av et varmesjokkinduserbart gen. I fravær av varmestress induserte ormene ikke GFP-uttrykk. Når ormene blir utsatt som et kort varmesjokk, induseres GFP-uttrykk.Utgangen av Worm_CP i stor grad av kvaliteten på linjene du tegner ved hjelp av Worm-align. Kontroller at linjene ikke berører eller overlapper, og tegn alle linjene i samme retning. Hvis du kontrollerer QC-tabellen, kan du identifisere linjer som berører eller overlapper, slik at du kan utelate disse tilfellene fra analysen.Utgangen av Worm-align kan brukes til påfølgende kvantifisering enten i Fiji eller i andre bildeanalyse programvarepakker. Vi har vist her en svært grunnleggende CellProfiler rørledning der andre analysemoduler kan svært enkelt innlemmes, for eksempel for å telle antall lipiddråper eller for å kvantifisere intensiteten av individuelle dråper i en orm. En av fordelene med denne teknikken er en mulighet til å kvantifisere fluorescens fra individuelle ormer raskt.I laboratoriet vårt har vi interesse for individuell levedyktighet ved hjelp av fluorescensreportere, og vi bruker Worm-align og Worm_CP rutinemessig til dette formålet.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbeidsflyt for High-innhold, Individuell Cell Kvantifisering av Fluorescent Markers fra Universal Microscope data, som støttes av Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Ved hjelp av Open-source verktøy

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observasjon og Kvantifisering av telomere og repeterende sekvenser med fluoresens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Høy innholdsanalyse Utnytte Automated Fluorescence Lifetime Imaging Mikros

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantifisering av Lipid overflod og evaluering av Lipid distribusjon i Caenorhabditis elegans av Nilen rød og olje Red O flekker

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...