Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Christian Lanctôt do BIOCEV (Praga, República Tcheca) por nos ensinar a técnica de micropipette bucal para montar vermes fixos e a Dra. Agradecemos também a Francesca Hodge por editar o manuscrito, Sharlene Murdoch e o Instituto Babraham Facilities pelo apoio. OC é suportado pela ERC 638426 e BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. 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Os autores não têm nada a revelar.

Worm-align é um pipeline de processamento de imagem baseado em FIJI que facilmente gera montagens de worms selecionados pelo usuário, nos quais os worms são endireitados e alinhados para ajudar a comparação visual, classificação e representação. Embora esse recurso também seja oferecido por algumas ferramentas existentes, notadamente o módulo WormToolbox no CellProfiler7, o Worm-align requer relativamente pouca experiência de análise de imagem prévia: os usuários precisam apenas rastrear os worms que gostariam de selecionar para a montagem (e análise). Embora rastrear os worms nos dados de imagem bruta seja um processo fácil - particularmente quando um computador ou tablet touch-screen está disponível - é primordial, que as linhas são corretamente desenhadas ao longo do eixo longitudinal dos worms. Linhas incompletas, que seguem apenas parte do verme, resultarão em vermes parciais na montagem (ou seja, vermes faltando cabeças de extremidades traseiras) e máscaras de segmentação parcial durante a análise do CellProfiler. Além disso, se linhas de dois vermes individuais se cruzarem, os vermes não serão processados corretamente na montagem de alinhamento de vermes, bem como para quantificação da fluorescência. Para controle de qualidade, uma imagem sobreposta das seleções de linha na imagem original é salva na pasta de dados, juntamente com uma tabela QC. A partir dessas, linhas problemáticas que levarão a vermes segmentados incorretamente podem ser facilmente identificadas e excluídas da montagem e/ou análise subsequente.
Embora a entrada direta do experimentador na seleção de worms talvez pareça um pouco demorada, ela apresenta uma clara vantagem do fluxo de trabalho sobre outros em experimentos onde vermes de diferentes estágios de desenvolvimento estão presentes na mesma imagem: Os worms podem ser selecionados durante a "etapa de rastreamento", delineando apenas os vermes que estão no estágio de desenvolvimento certo. Alternativamente, os worms podem ser filtrados usando a saída de Worm_CP com base no comprimento da linha de rastreamento, ou na área da máscara de segmentação, ambos indicadores confiáveis do comprimento/tamanho dos worms. Indiscutivelmente, algoritmos de aprendizagem de máquina podem lutar para reconhecer vermes de diferentes estágios de desenvolvimento, já que seu tamanho e aparência nas imagens DIC são tão diferentes.
A saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de worm-align em um simples pipeline CellProfiler (Worm_CP), que permite a quantificação da intensidade de fluorescência multicanal nesses worms individuais que foram selecionados durante a execução do pipeline de alinhamento worm. Escolhemos essa abordagem devido à flexibilidade do software CellProfiler: É simples incorporar módulos adicionais no pipeline para analisar recursos adicionais em worms individuais (por exemplo, medir o tamanho de gotículas lipídicas, ou grânulos de estresse, núcleos, mitocôndrias). Além disso, as máscaras de vermes individuais poderiam potencialmente ser usadas para treinar um novo modelo para WormToolbox7.
As principais vantagens deste método são que ele é rápido e requer uma configuração simples de montagem de vermes. Este método é mais rápido, pois não requer gastar tempo aprendendo operação de software nem executando conjuntos de treinamento através de um algoritmo de máquina7. Além disso, este método funciona com vermes vivos ou fixos simplesmente montados em almofadas de agarose regulares. Não há necessidade de uso de câmaras microfluidas complexas, conforme desenvolvido em outros métodos5,6.

Um organismo relativamente simples, o nematode C. elegans,é um sistema modelo extremamente útil para estudar doenças humanas. Cerca de 38% dos genes do genoma de C. elegans têm contrapartes funcionais em humanos1,2. Uma das características únicas de C. elegans é que ele é opticamente transparente, permitindo fácil acesso a informações in vivo sobre (sub) expressão celular de repórteres fluorescentes através de tecidos. Isso faz da C. elegans um organismo modelo principal para telas de alto conteúdo usando plataformas baseadas em imagem3. No entanto, uma questão que muitas vezes complica esses estudos é que, quando imagens densas populações de vermes, elas tendem a se cruzar e agrupar, fazendo comparações entre vermes individuais desafiando, ofuscando a análise de imagens a jusante e a quantitação.
As soluções existentes que superam esse problema normalmente dependem da otimização do protocolo de cultivo e imagem, como através do uso de configurações micro fluidicas4, permitindo que worms únicos sejam capturados em imagens separadas5,6. Outros aplicaram algoritmos de aprendizagem de máquina permitindo o reconhecimento de vermes únicos, mesmo em uma população desajeitada. Um excelente exemplo deste último é o WormToolbox, que é uma extensão modular da plataforma de análise de imagem de código aberto, CellProfiler7. O WormToolbox oferece uma solução de alto rendimento e alto conteúdo para análise de C. elegans, e claramente se beneficia de sua inclusão no CellProfiler, pois módulos de análise adicionais podem ser facilmente incluídos. Embora o WormToolbox venha fornecido com um modelo pré-treinado (DefaultWormModel.xml), a requalificação do algoritmo de aprendizagem de máquina é geralmente necessária para cada nova aplicação. Tutoriais online sobre como fazer isso estão disponíveis no Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Apesar disso, instalar e usar o WormToolbox requer um investimento significativo para usuários iniciantes.
Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico e de tempo efetivo para a cultura, e populações de imagens de C. elegans. Para permitir a avaliação de worms individuais nas imagens adquiridas, desenvolvemos um simples fluxo de trabalho baseado em FIJI de código aberto, chamado Worm-align. O worm-align pode ser usado para gerar montagens de worms endireitados e alinhados. Em primeiro lugar, o usuário deve selecionar manualmente worms individuais para análise, desenhando uma linha da cabeça para a cauda. O worm-align usará essa seleção para cortar worms selecionados a partir da imagem de visão geral e gerar uma montagem na qual os worms selecionados são endireitados e alinhados para facilitar a comparação visual e a apresentação.
Além disso, a saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de alinhamento worm para Worm_CP, um pipeline que usa o software CellProfiler de código aberto. A flexibilidade do CellProfiler permite a incorporação de módulos adicionais para triagem de alto conteúdo. Usamos o Worm_CP pipeline para quantificar a resposta ao choque térmico, um mecanismo de proteção bem conservado que repatos proteínas que são mal dobradas devido a estressores como alta temperatura8. Especificamente, aplicamos o gasoduto a vermes que transportam um transgênico multi-cópia integrado, onde o promotor de um gene indutível de choque térmico, hsp-70(C12C8.1), conduz proteína fluorescente verde (GFP)9. Também usamos o Worm_CP pipeline em animais fixos que foram rotulados com um corante fluorescente que visualiza gotículas lipídicas (LDs), a principal organela de armazenamento de gordura em C. elegans10. Embora este fluxo de trabalho não tenha o throughput oferecido pelo WormToolBox, é uma alternativa fácil e simples para apresentação visual e análise de experimentos C. elegans baseados em imagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Um problema frequentemente encontrado ao adquirir dados de imagem de C. elegans fixos ou anestesiados é que os vermes cruzam e se agrupam com seus vizinhos. Esse problema é agravado com o aumento da densidade de vermes e cria desafios para a imagem e quantificação. Desenvolvemos um fluxo de trabalho baseado em FIJI, worm-align, que pode ser usado para gerar montagens de um ou vários canais de worms selecionados pelo usuário, endireitados e alinhados a partir de dados de imagem bruta de C. elegans. Worm-align é um fluxo de trabalho simples e fácil de usar que não requer treinamento prévio do usuário ou do algoritmo de análise. Montagens geradas com worm-align podem auxiliar na inspeção visual de vermes, sua classificação e representação. Além disso, a saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos, seja em FIJI diretamente ou em outras plataformas de software de análise de imagem. Demonstramos isso importando a saída de alinhamento worm para Worm_CP, um pipeline que usa o software CellProfiler de código aberto. A flexibilidade do CellProfiler permite a incorporação de módulos adicionais para triagem de alto conteúdo. Como exemplo prático, usamos o pipeline em dois conjuntos de dados: o primeiro conjunto de dados são imagens de worms repórteres de choque térmico que expressam proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle do promotor de um gene indutível de choque térmico hsp-70, e o segundo conjunto de dados são imagens obtidas de vermes fixos, manchados para lojas de gordura com um corante fluorescente.

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Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP é um simples fluxo de trabalho FIJI/CellProfiler que pode ser usado para endireitar e alinhar amostras de elegans de Caenorhabditis e para marcar ensaios baseados em imagens de vermes inteiros sem a necessidade de etapas de treinamento prévias. Aplicamos o alinhamento/Worm_CP de vermes à quantificação da expressão induzida por choque de calor em animais vivos ou gotículas lipídicas em amostras fixas.

Linha de worm e Worm_CP, dois gasodutos de código aberto para endireitar e quantificação de dados de imagem fluorescência obtidos de elegans caenorhabditis

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Descrevemos aqui um simples fluxo de trabalho baseado em Fiji chamado Worm-align, que pode ser usado para gerar montagens únicas ou multicanais de worms endireitados de interesse a partir de imagens de microscopia bruta. Como este fluxo de trabalho depende de animais selecionados pelo usuário de interesse, pode ser particularmente útil ao analisar imagens de C.elegans onde os worms não estão todos no estágio ou condição corretas. Deve-se notar que a saída de Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente de fluorescência com Fiji ou outro software de análise de imagem.Aqui demonstramos quantificação de fluorescência usando o pipeline CellProfiler Worm_CP. Comece criando uma micropipette bucal estendendo um capilar de vidro fino na chama de um queimador bunsen. Após a extensão da chama, quebre o capilar em dois pedaços se ele não se quebrar em dois pedaços após a extensão.Se ele quebrou em dois pedaços, corte a ponta da mais longa. Selecione a peça mais longa e teste se o capilar está aberto ao tentar aspirar água. Retire o adaptador de um tubo de silicone de três milímetros.Conecte o capilar de vidro a um adaptador capilar ligado a um tubo de silicone de seis milímetros. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de seis milímetros em um filtro de 0,2 micrômetros e um tubo de silicone de três milímetros na outra extremidade. Conecte uma ponta de filtro de um milímetro na extremidade livre do tubo de silicone de três milímetros para aspirar líquido.Sob um microscópio de dissecção, remova o máximo de líquido possível em torno de uma pelota de vermes fixos com a micropipette bucal. Adicione rapidamente 10 microliters de meio de montagem ao fundo do tubo. Enxágüe uma ponta de 10 microliter em PBS com traços de detergente para evitar que os vermes grudem nas laterais da ponta de pipeta plástica.Em seguida, corte a ponta da ponta com um par de tesouras. Transfira oito microliters de meio de montagem com os vermes em uma almofada de agarose previamente preparada. Ao observar o slide sob o microscópio, agitar suavemente para evitar a sobreposição dos vermes.Em seguida, cubra a gota de meio de montagem na almofada de agarose com um deslizamento de cobertura de 18 por 18 milímetros. Para montar vermes vivos, pipeta de três a quatro microliters de três levamisole mililitros dissolvido em M9 em uma almofada de agarose. Escolha de 30 a 50 vermes por condição na gota de levamisole.Em seguida, cubra a gota com uma cobertura de 18 por 18 milímetros e imagem os vermes dentro de uma hora. Instale o pacote de software de análise de imagem de código aberto Fiji do ImageJ, ou se ele já está instalado no computador, verifique se é a versão 1.52A ou posterior, em seguida, baixe o repositório de linha worm do GitHub e salve-o no computador. Uma vez que todos os componentes do pipeline tenham sido baixados e instalados, abra Fiji e execute a macro de alinhamento worm clicando em plugins, macros e executado na barra de menu principal.Localize o worm-align. script ijm e clique em abrir. Navegue até a pasta de entrada com as imagens a serem analisadas e clique em selecionar, certificando-se de que a pasta selecionada contém apenas arquivos de imagem.A macro gerará automaticamente uma pasta de saída onde todos os resultados serão salvos. O nome da pasta será o mesmo da pasta de entrada com saída como pós-correção. Permita que a macro abra a primeira imagem na pasta de entrada e use-a como uma imagem representativa para extrair as configurações necessárias para gerar a montagem, incluindo a largura dos worms, o brilho e o contraste.Usando a ferramenta de desenho em linha reta, desenhe uma linha através da largura de um worm e clique em OK. Use o comprimento desta linha para determinar a altura das regiões cortadas para vermes únicos. Para cada canal, especifique o nome, a tabela de procura e se ele deve ser incluído na montagem e clique em OK. Em seguida, ajuste as configurações de brilho e contraste para os canais usando os controles deslizantes. Repita este processo para os canais restantes.Uma vez configuradas todas as configurações, elas serão gravadas em uma tabela de configurações e salvas na subpassa CellProfiler da pasta de saída. Uma imagem é gerada para mostrar como serão todas as imagens após a aplicação das configurações. Se a imagem for satisfatória, marque a caixa superior.A segunda e terceira caixa do painel de verificação de todas as configurações especificam as opções para a geração de montagem. Deixe ambas as caixas marcadas e clique em OK para executar o resto da macro. A falha na marcação da caixa superior fará com que a macro reprise a configuração.A macro passa então a abrir todas as imagens na pasta de entrada. Para cada imagem, desenhe linhas no eixo longitudinal de todos os worms a serem incluídos na montagem usando a ferramenta segmentada ou a linha à mão livre. Desenhe as linhas consistentemente da cabeça para a cauda ou vice-versa ao longo do comprimento total dos worms e adicione cada linha ao gerenciador de ROI clicando em Control T.Uma vez que todos os worms desejados tenham sido adicionados, clique em OK. O worm-align gerará, então, imagens cortadas de worms selecionados únicos, que serão salvos na subpasta de um único worm da pasta de saída.Montagens de todos os worms selecionados serão salvas na pasta alinhada. Baixe e instale o CellProfiler 2.2.0 clicando no link para versões anteriores do CellProfiler na página de download e selecionando o sistema operacional necessário. Antes de iniciar o pipeline Worm_CP, certifique-se de que todas as imagens de saída esperadas estejam presentes na subpasta CellProfiler da pasta de saída de alinhamento worm.Uma cópia processada da imagem original, uma máscara de imagem binária da população de vermes, alinhar a máscara se a linha for desenhada em worms selecionados e uma imagem representando cada um dos canais na imagem original deve estar presente. Abra o CellProfiler e clique no módulo de entrada de imagens e arraste a pasta do módulo CellProfiler para a janela que diz soltar arquivos e pastas aqui. Se uma lista de imagens estiver presente a partir de uma análise anterior, remova-as primeiro clicando com o botão direito do mouse na janela e selecionando a lista de arquivos claras.Clique no módulo de entrada de metadados e no segundo método de extração, clique na pasta amarela e navegue até a subpasseira CellProfiler da pasta de saída de alinhamento worm. Selecione o arquivo de configurações e clique em atualizar. Em seguida, clique no módulo de entrada de nomes e tipos e certifique-se de que todas as imagens necessárias para o pipeline estão presentes.Antes de executar o pipeline, selecione um destino para os resultados de saída no módulo de saída. Use o modo de teste para ver como o pipeline se sai clicando no modo de teste iniciar e permitir que ele execute a primeira imagem na pasta. Quando estiver satisfeito com o desempenho do pipeline, clique no modo de teste de saída e analise imagens.Antes de iniciar a análise, certifique-se de que todos os olhos na frente do módulo de análise estejam fechados. Quando a análise estiver concluída, abra a pasta de saída Worm_CP que consiste em dois arquivos CSV, worms CSV e linhas CSV. Culturing e imagem C.elegans de acordo com o método descrito neste protocolo produz grandes imagens de visão geral de populações de vermes.A saída do gasoduto depende em grande parte da qualidade das linhas desenhadas em cima das imagens. Vários exemplos de linha e sua saída de Worm-align são mostrados aqui. Ao usar o script de alinhamento worm, a identificação visual de vermes interseccionais é possível a partir das imagens de sobreposição encontradas na subpastopa de dados, bem como dos painéis de worms individuais na montagem.A tabela QC também pode ser usada para identificar vermes sobrepostos. No entanto, as linhas de intersecção são problemáticas para o Worm_CP pipeline. Isso porque Worm_CP usa máscara de linha, não regiões de interesse, para ajudar a identificar vermes individuais.Portanto, o CellProfiler irá segmentar um dos worms como dois objetos. O Worm_CP pipeline tem sido usado para quantificar a intensidade da fluorescência de animais fixos rotulados com um corante fluorescente que incorpora gotículas lipídicas. O teor de gotículas lipídicas é reduzido em 17% entre animais do tipo selvagem e mutantes DBL1 usando quantificação manual, e em 12% usando o Worm_CP pipeline.Worm_CP também foi usado para quantificar a resposta de choque térmico em vermes vivos expressando GFP sob controle de um gene indutível de choque térmico. Na ausência de estresse térmico, os vermes não induziram a expressão GFP. Quando os vermes são expostos como um choque de calor curto, a expressão GFP é induzida.A saída de Worm_CP depende em grande parte da qualidade das linhas que você desenha usando worm-align. Certifique-se de que suas linhas não estão tocando ou sobrepostas e desenhe todas as suas linhas na mesma direção. Verificar a tabela QC pode ajudá-lo a identificar linhas que estão tocando ou sobrepondo para que você possa excluir esses casos de sua análise.A saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente em Fiji ou em outros pacotes de software de análise de imagem. Mostramos aqui um pipeline muito básico do CellProfiler no qual outros módulos de análise poderiam ser facilmente incorporados, por exemplo, para contar o número de gotículas lipídicas ou quantificar a intensidade de gotículas individuais dentro de um worm. Uma das vantagens dessa técnica é a possibilidade de quantificar a fluorescência de vermes individuais rapidamente.Em nosso laboratório, temos interesse em viabilidade individual usando repórteres de fluorescência e usamos worm-align e Worm_CP rotineiramente para este fim.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

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Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

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We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

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